Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
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- Sammelgel (Angaben jeweils für 2 Gele):
2.10.4 Western-Blot
H2O 2,8 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 1,3 ml
Acrylamid/Bis 0,8 ml
10% SDS 50 µl
TEMED 10 µl
25% Ammoniumpersulfat 15 µl
Die in der SDS-Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine werden mittels „semidryblot“-Verfahren auf
eine PVDF-Membran (Poly-Vinylidene-Di-Fluorid, Immobilon P, Millipore) transferiert. Die Gele
und das Whatman-Papier werden nach der SDS-Page kurz in Blotpuffer äquilibriert, ebenso wie die
Immobilon-Membran, die vorher durch Methanol aktiviert wird. Danach werden auf die mit
Blotpuffer befeuchtete Anoden-Graphitplatte 3 Lagen Whatman-Papier, PVDF-Membran, SDS-Gel
und wieder 3 Lagen Whatman-Papier luftblasenfrei geschichtet. Die Transferzeit beträgt 1 h bei
konstant 0,8 mA/cm 2 .
Blotpuffer:
Tris-Base 50 mM
Glycin 39 mM
SDS 1,3 mM
Methanol 20% (v/v)
2.10.5 Coomassie-Färbung
Zur Anfärbung von Protein-Banden wird das SDS-Gel 30-50 min in der Färbelösung auf
einem Schwenktisch bei RT inkubiert. Anschließend wird es entfärbt, bis die Banden deutlich
kontrastiert erkennbar sind. Das Gel kann nun gescannt und auf einer Gel-Trockner-Apparatur
getrocknet werden.