Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
Die Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 90% kultiviert, abtrypsinisiert und in einer Neubauer-
Zählkammer ausgezählt. Die benötigte Anzahl an Zellen wird durch Zentrifugation (1000 UpM, 5
min, 4°C) pelletiert. Der Überstand wird abgenommen und das Pellet in 100-200µl eiskalten
Lysispuffer resuspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis werden die Zelltrümmer durch
Zentrifugation (13000 UpM, 2 min, 4°C) entfernt. Der Überstand wird für die SDS-Page verwendet.
Lysispuffer:
42
Tris-HCl, pH 7,5 10 mM
NaCl 150 mM
EDTA 1 mM
Igepal CA 630 (Sigma) 1% (v/v)
Na-Vanadat 1 mM
Na-Fluorid 10 mM
Protease-Inhibitor Mix
(Complete Mini, Roche) 1 Tablette auf 10 ml
2.10.2 Konzentrationsbestimmung nach Bradford
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgt mit dem Bio Rad Protein-Assay nach Bradford. Die
Proteinextrakte werden 1:5 bis 1:20 verdünnt, und es werden jeweils drei Parallelproben gemessen.
Die Auswertung erfolgt im Elisareader (Spetromax 250, MWG-Biotec) mit SoftMaxPro Software
(Molecular Devices Corp.).
2.10.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page)
Die Auftrennung der Proteinextrakte erfolgt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page)
nach Laemmli. Anschließend werden die Gele entweder gefärbt oder im Western-Blots weiter
verwendet.
Vor der Auftrennung werden die Proteinextrakte mit 2x SDS-Probenpuffer versetzt und für 10 min bei
95°C erhitzt. Das polymerisierte Trenngel wird mit einem Sammelgel überschichtet. Der Gellauf
erfolgt im SDS-Laufpuffer bei konstant 120V (Sammelgel) und 160V (Trenngel).