Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
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Human Ezrin Position <strong>der</strong><br />
Zielsequenz:<br />
702-724<br />
Human Moesin Position <strong>der</strong><br />
Zielsequenz:<br />
784-806<br />
Human Radixin Position <strong>der</strong><br />
Zielsequenz:<br />
964-968<br />
Tab. 2: dsRNA-Duplexe<br />
5’-ccccaaagauuggcuuuccdTdT-3’<br />
3’-dTdTgggguuucuaaccgaaagg-5’<br />
5’-aaaagccccggacuucgucdTdT-3’<br />
3’-dTdTuuuucggggccugaagcag-5’<br />
5’-gcaguuggaaagggcacaadTdT-5’<br />
3’-dTdTcgucaaccuuucccguguu-5’<br />
2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
G/C-Gehalt:<br />
43%<br />
G/C-Gehalt:<br />
48%<br />
G/C-Gehalt:<br />
43%<br />
Für den „knock-down“ aller <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> müssen drei Duplexe verwendet werden, da jede dsRNA<br />
nur jeweils zur Inhibierung eines Proteins führt. Die Zielsequenzen sind so gewählt, dass nur<br />
spezifisch <strong>die</strong> Expression <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> inhibiert wird.<br />
Für <strong>die</strong> Transfektion werden HeLa-<strong>Zell</strong>en in einer 24-well Platte bis zu einer Konfluenz von 40-50%<br />
kultiviert. Sollen <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en für <strong>die</strong> Immunfluoreszenz verwendet werden, werden <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en <strong>auf</strong><br />
Deckgläschen kultiviert. Vor <strong>der</strong> Transfektion wird das Medium gegen frisches Wachstumsmedium<br />
ausgetauscht. Für <strong>die</strong> Transfektion wird pro well von jedem dsRNA-Duplex 0,84µg benötigt. Hierfür<br />
werden in einem Eppi 50µl Opti-MEM mit 3µl 20µM dsRNA vermixt. In einem an<strong>der</strong>en<br />
Reaktionsgefäß werden 3µl des Transfektionsreagenz OligofectAMINE Reagent (Invitrogen) mit 12µl<br />
Opti-MEM für 7-10min inkubiert. Beide Lösungen werden vereinigt <strong>und</strong> für 20-25min bei<br />
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird zur <strong>der</strong> Lösung 38µl Opti-MEM zugegeben <strong>und</strong> alles<br />
<strong>auf</strong> <strong>die</strong> ausgesäten <strong>Zell</strong>en gegeben. Die Transfektion wird für alle drei dsRNAs einzeln durchgeführt,<br />
sodass pro well jeweils drei Transfektionsansätze zu machen sind. Die <strong>Zell</strong>en werden dann 18-24h<br />
weiterkultiviert <strong>und</strong> anschließend in <strong>der</strong> Immunfluoreszenz o<strong>der</strong> im Western-Blot analysiert.<br />
2.10 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden<br />
2.10.1 <strong>Proteine</strong>xtrakte<br />
Für <strong>die</strong> Herstellung von <strong>Proteine</strong>xtrakten zur späteren Analyse im Western-Blot werden <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en mit<br />
einem Lysispuffer behandelt. Das zugesetzte Igepal (Sigma) lysiert <strong>die</strong> Zytoplasmamembran <strong>und</strong> führt<br />
so zu einer Freisetzung <strong>der</strong> zytoplasmatischen <strong>Proteine</strong>. Um einen proteolytischen Abbau <strong>und</strong><br />
Dephosphorylierungen <strong>der</strong> <strong>Proteine</strong> zu verhin<strong>der</strong>n, wird dem Lysispuffer Protease- <strong>und</strong><br />
Phosphataseinhibitoren hinzugefügt <strong>und</strong> <strong>die</strong> Reaktion <strong>auf</strong> Eis durchgeführt.<br />
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