Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

Human Ezrin Position der
Zielsequenz:
702-724
Human Moesin Position der
Zielsequenz:
784-806
Human Radixin Position der
Zielsequenz:
964-968
Tab. 2: dsRNA-Duplexe
5’-ccccaaagauuggcuuuccdTdT-3’
3’-dTdTgggguuucuaaccgaaagg-5’
5’-aaaagccccggacuucgucdTdT-3’
3’-dTdTuuuucggggccugaagcag-5’
5’-gcaguuggaaagggcacaadTdT-5’
3’-dTdTcgucaaccuuucccguguu-5’
2. Material und Methoden
G/C-Gehalt:
43%
G/C-Gehalt:
48%
G/C-Gehalt:
43%
Für den „knock-down“ aller ERM-Proteine müssen drei Duplexe verwendet werden, da jede dsRNA
nur jeweils zur Inhibierung eines Proteins führt. Die Zielsequenzen sind so gewählt, dass nur
spezifisch die Expression der ERM-Proteine inhibiert wird.
Für die Transfektion werden HeLa-Zellen in einer 24-well Platte bis zu einer Konfluenz von 40-50%
kultiviert. Sollen die Zellen für die Immunfluoreszenz verwendet werden, werden die Zellen auf
Deckgläschen kultiviert. Vor der Transfektion wird das Medium gegen frisches Wachstumsmedium
ausgetauscht. Für die Transfektion wird pro well von jedem dsRNA-Duplex 0,84µg benötigt. Hierfür
werden in einem Eppi 50µl Opti-MEM mit 3µl 20µM dsRNA vermixt. In einem anderen
Reaktionsgefäß werden 3µl des Transfektionsreagenz OligofectAMINE Reagent (Invitrogen) mit 12µl
Opti-MEM für 7-10min inkubiert. Beide Lösungen werden vereinigt und für 20-25min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird zur der Lösung 38µl Opti-MEM zugegeben und alles
auf die ausgesäten Zellen gegeben. Die Transfektion wird für alle drei dsRNAs einzeln durchgeführt,
sodass pro well jeweils drei Transfektionsansätze zu machen sind. Die Zellen werden dann 18-24h
weiterkultiviert und anschließend in der Immunfluoreszenz oder im Western-Blot analysiert.
2.10 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden
2.10.1 Proteinextrakte
Für die Herstellung von Proteinextrakten zur späteren Analyse im Western-Blot werden die Zellen mit
einem Lysispuffer behandelt. Das zugesetzte Igepal (Sigma) lysiert die Zytoplasmamembran und führt
so zu einer Freisetzung der zytoplasmatischen Proteine. Um einen proteolytischen Abbau und
Dephosphorylierungen der Proteine zu verhindern, wird dem Lysispuffer Protease- und
Phosphataseinhibitoren hinzugefügt und die Reaktion auf Eis durchgeführt.
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