Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
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2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
Die vier verwendeten Dideoxynukleotide sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert,<br />
sodass <strong>die</strong> Fragmente bei Anregung mit einem Laserstrahl unterschiedliche Emissionsspektren<br />
<strong>auf</strong>weisen <strong>und</strong> differenziert werden können. Das entstandene DNA-Gemisch wird gelelektrophoretisch<br />
<strong>auf</strong>getrennt, <strong>und</strong> per Laseranregung wird in einem computergestützten, automatischen Verfahren <strong>die</strong><br />
Nukleotidsequenz <strong>der</strong> DNA ermittelt.<br />
Geräte:<br />
Applied Biosystems (ABI) Sequenzier-System<br />
Perkin Elmer Gene Amp 9600 PCR-System<br />
Puffer <strong>und</strong> Reagenzien:<br />
Premix:<br />
BigDye RR Terminator AmpliTaq Premix (PE Applied Biosystems)<br />
Reaktionsansatz:<br />
PCR-Programm:<br />
DNA 1 µg<br />
Primer 3,2 pmol<br />
Premix 4 µl<br />
H2O ad 10µl<br />
25 Zyklen: 96°C, 15 s<br />
55°C, 15 s<br />
60°C, 240 s<br />
1 Zyklus: 72°C, 240 s<br />
1 Zyklus: 15°C, unbegrenzt<br />
Die Aufreinigung, Gelelektrophorese <strong>und</strong> Detektion wird von GATC Biosystems durchgeführt. Die<br />
anschließende Auswertung <strong>der</strong> Daten erfolgt mit DNA-Star Software (GATC-Biosystems).<br />
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