Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
2.9.13 Minipräperation von Plasmid-DNA
Für die Isolierung von Plasmid-DNA im analytischen Maßstab werden von einer 5 ml E.coli ü.N.-
Kultur 1,5 ml entnommen und mit dem GFX TM Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Pharmacia
Biotech) aufgereinigt.
2.9.14 Midi- und Maxipräperation von Plasmid-DNA
Für die Plasmidisolierung im präperativen Maßstab wird die Plasmid-DNA nach QIAgen-Midi- bzw.
QIAgen-Maxi-Protokoll mit QIAgen-Tip 100- bzw. QIAgen-Tip 500-Säulen (s. 2.7.6, Aufreinigung
von PCR-Fragmenten mit dem QIAquick PCR Purification Kit) aufgereinigt.
2.9.15 Mutagenese
Für die Mutagenese einzelner Nukleotide innerhalb eines ORF, die zu einem Aminosäurenaustausch
führen, wird der QuikChange-Site-Directed-Mutagenesis-Kit (Stratagene) verwendet. In einer PCR-
Reaktion hybridisieren zwei komplementäre, ca. 35 Nukleotide lange Oligonukleotide, welche die
neue gewünschte Sequenz in der Mitte tragen, an einen ORF innerhalb eines zirkulären Plasmid. Die
Oligonukleotide sind somit die Startpunkte der Amplifikation. Hierbei wird das gesamte Plasmid
amplifiziert und somit die zu mutierenden Basen direkt in das neu entstehende Plasmid eingebaut. Um
die nicht-mutierten, parentalen Plasmide abzubauen, wird nach der PCR ein Restriktionsverdau mit
DpnI durchgeführt. DpnI kann nur methylierte DNA schneiden und verdaut deshalb nur die aus E. coli
stammenden, methylierten, parentalen Plasmide. Die übriggebliebenden neuen Plasmide, die die
gewünschte Mutation tragen, werden in E. coli transformiert und amplifiziert. Die für diese Arbeit
verwendeten Primer sind unter 2.7 aufgeführt .
2.9.16 DNA-Sequenzierung
Die von Sanger et al. (1973) entwickelte Methode zur enzymatischen Sequenzierung von DNA-
Fragmenten basiert auf der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Dideoxynukleotiden als
Analoga zu den Deoxynukleotiden. Durch den zufälligen Einbau der Dideoxynukleotide mittels PCR
kommt es zum Kettenabbruch der DNA-Synthese, denn durch das Fehlen des notwendigen 3´-OH-
Endes wird die Ausbildung der nächsten Phosphodiesterbindung verhindert.
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