Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

Ligationsansatz:
Vektor-DNA 10-100 ng
„Insert“-DNA x ng
10 x Ligase-Puffer 1 µl (Boehringer)
T4-DNA-Ligase 1 U (Boehringer)
H2O ad 10 µl
Die exakte Menge der „Insert“-DNA wird wie folgt berechnet:
ng (Insert) =
2. Material und Methoden
Die Inkubation erfolgt ü.N. bei 4°C, anschließend wird direkt in E.coli transformiert (s. 2.7.12).
2.9.11 Herstellung kompetenter E.coli
Zur Herstellung kompetenter E.coli wird 1 l SOB+Mg-Salze mit 5 ml einer E.coli ü.N.-Kultur
angeimpft und bei 37°C unter Schütteln (180x g) bis zu einer OD600 = 0,5 inkubiert. Durch
Zentrifugation (5000x g, 4°C, 5 min) werden die Zellen pelletiert, in 100 ml eiskalter 0,1 M CaCl2-
Lösung resuspendiert und 20 min auf Eis inkubiert. Nach der anschließenden Zentrifugation (5000 x g,
4°C, 5 min) wird das Pellet in 10 ml eiskalter 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und 3 h auf Eis
inkubiert. Nach Zugabe von 87% Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 10% (v/v) wird die
Zellsuspension in 100 µl aliquotiert und bei –70°C eingefroren.
2.9.12 Transformation
ng (Vektor) * kb-Gr öße (Insert)
kb-Gr öße (Vektor)
100 µl kompetenter E. coli-Zellen werden langsam auf Eis aufgetaut, mit 10-100 ng Plasmid-DNA
versetzt, vorsichtig vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Es folgt ein Hitzeschock im 42°C
Wasserbad für 30 s und anschließender Inkubation auf Eis für 2-3 min. Dann werden 800 µl Soc-
Medium zugegeben und 1 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation werden die
transformierten Bakterien auf Selektivmediumplatten ausplattiert und ü.N. bei 37°C inkubiert.
*
1
3
(Verh ältnis Insert/Vektor)
37