Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
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2. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
2.9.8 Blau-Weiß-Selektion<br />
Die Blau-Weiß-Selektion wird in <strong>die</strong>ser Arbeit verwendet, um nach dem TOPO-TA-Cloning religierte<br />
pCRII-TOPO-Vektoren von pCRII-TOPO-Vektoren mit inserierten PCR-Fragmenten unterscheiden<br />
zu können.<br />
2.9.9 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten<br />
Enzym <strong>und</strong> Puffer:<br />
Alkalische Phosphatase (Boehringer) <strong>und</strong> zugehöriger 10 x Dephosphorylierungspuffer.<br />
Reaktionsansatz:<br />
36<br />
Vektor-DNA x µg (Menge ist individuell variierbar)<br />
10 x Dephosphorylierungspuffer 10 µl<br />
Alkalische Phosphatase 1 µl<br />
H2O ad 99 µl<br />
Inkubation: 30 min bei RT<br />
Nach <strong>der</strong> Inkubation wird nochmals 1 µl alkalischer Phosphatase zugegeben <strong>und</strong> wie oben inkubiert.<br />
Anschließend wird <strong>die</strong> dephosphorylierte DNA durch Phenolisieren o<strong>der</strong> mit dem QIAquick PCR<br />
Purification Kit <strong>auf</strong>gereinigt.<br />
2.9.10 Ligation<br />
Bei <strong>der</strong> Ligation wird <strong>der</strong> dephosphorylierte Vektor mit einem DNA-Fragment durch eine T4-DNA-<br />
Ligase verb<strong>und</strong>en. Die Ligase katalysiert dabei <strong>die</strong> Bildung von Phospho<strong>die</strong>sterbindungen zwischen<br />
den benachbarten 3´-OH- <strong>und</strong> 5´-Phosphat-Enden. Der Vektor, sowie das zu inserierende DNA-<br />
Fragment, wurden vorher mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen geschnitten.
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