Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2.9.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten
Phenolisierung:
2. Material und Methoden
Der DNA-Lösung wird 1 V Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Carl Roth GmbH & Co) zugesetzt
und 5 min bei 13000x g zur Phasentrennung zentrifugiert. Die obere DNA-enthaltene Phase wird
vorsichtig abpipettiert und in ein neues Eppi überführt.
Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen:
Der PCR-Ansatz oder Restriktionsansatz wird gelelektrophoretisch aufgetrennt, die entsprechende
Bande aus dem Gel in einem möglichst kleinen Volumen ausgeschnitten und das DNA-Fragment mit
dem Jet Sorb-Kit (GGG Genomed) aus dem Gel eluiert und aufgereinigt.
Nachdem die DNA zuerst an spezielle Glasperlchen gebunden hat, wird die Agarose entfernt, die
DNA wird mehrmals gewaschen und anschließend wieder von den Glasperlchen eluiert und in Wasser
aufgenommen.
Aufreinigung von PCR-Fragmenten mit dem QIAquick PCR Purification Kit:
Um PCR-Ansätze von Reaktionsrückständen und Primern zu befreien, werden diese mit Hilfe des
QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen) aufgereinigt.
2.9.7 TOPO-TA-Cloning
Um PCR-Fragmente zu sichern, werden sie in den Vektor pCRII-TOPO (Invitrogen) kloniert (s. 2.4).
Hierbei wird ausgenutzt, dass die Taq-DNA-Polymerase eine terminale Transferaseaktivität besitzt,
die Deoxyadenosin an die 3'-Enden von PCR-Produkten hängt. Der linearisierte Vektor besitzt 3'überhängende
Deoxythymidine. Dies erlaubt eine effiziente Ligation der PCR-Produkte in den Vektor.
Die Ligation erfolgt innerhalb von 5 min bei RT durch eine Topoisomerase, die an den Vektor
gekoppelt ist. Der Ansatz wird in E. coli transformiert. Die Selektion erfolgt durch Ausplattieren auf
LB-Agarplatten mit Kanamycin und Blau-Weiß-Selektion.
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