Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
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alternativ:
1 Zyklus: 95°C, 5 min
15 Zyklen: 95°C, 1 min
70°C –1°C pro Zyklus, 1 min
72°C, 2 min
15 Zyklen: 95 °C, 1 min
x°C, 1 min
72°C, 2 min + 4 s pro Zyklus
1 Zyklus: 72°C, 10 min
1 Zyklus: 4°C, unbegrenzt
Mit x sind in beiden Programmen die Schmelztemperaturen der Primer bezeichnet.
2.9.5 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen lassen sich doppelsträngige DNA-Moleküle Sequenzspezifisch
spalten. In Abhängigkeit von der erkannten und geschnittenen DNA-Sequenz entstehen
dabei glatte Enden („blunt ends“) oder durch einen asymmetrischen Schnitt Enden mit überstehender
einzelsträngiger DNA. Mit Restriktionsenzymen kann man DNA-Moleküle in reproduzierbare
Fragmente zerlegen, die dann z.B. im Agarosegel aufgetrennt werden können (s. 2.7.2).
Restriktionsendonukleasen binden enzymspezifisch an meist palindromartig angeordnete
Erkennungssequenzen und schneiden innerhalb dieser Erkennungssequenz die DNA durch Spaltung
von zwei Phosphodiester-Bindungen.
Die verwendeten Restriktionsendonukleasen (Biolabs) werden mit den jeweils empfohlenen 10 x
Restritionspuffern verwendet.
Restriktionsansatz:
DNA 1 µg
Restriktionsenzym 1 U
10 x Restriktionspuffer 2 µl
BSA (wenn benötigt) 0,2 µl
H2O ad 20 µl
Inkubation bei der empfohlenen Temperatur über mindestens 1 h.