Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
32
Standard zur Größenbestimmung:
1kb-ladder (Gibco), 1µl/Tasche
Marker zur Größenbestimmung und Abschätzung der DNA-Konzentration:
SmartLadder (Eurogentech), 5µl/Tasche
2.9.3 Fällen von DNA
Zur Fällung von DNA aus einer wäßrigen Lösung wird 1/10 Volumen 3 M Na-Acetat (pH 5,2)
zugegeben. Nach Zugabe von 2 Volumen kaltem Ethanol (-20°C, 100%) wird die DNA bei –20°C für
ca. 30 min gefällt. Sehr geringe DNA-Konzentrationen (< 0,1 µg/ml) werden ü.N. bei –70°C gefällt.
Durch Zentrifugation (13000x g, 15 min) wird die DNA pelletiert, mit 70% Ethanol gewaschen, in der
Speed-Vac getrocknet und in Wasser aufgenommen.
2.9.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die PCR ist eine automatisierte Methode zur enzymatischen Amplifizierung eines DNA-Abschnittes
zwischen zwei Oligonukleotid-Primern, die gegenläufig an komplementäre DNA-Stränge gebunden
sind.
Die PCR-Reaktion besteht aus einem wiederholten Zyklus von DNA-Denaturierung, Primer-
Hybridisierung und Primer-Extension. Im ersten Schritt wird die DNA bei einer Temperatur von 94°C
denaturiert. Anschließend binden die im Überschuß zugegebenen Primer bei einer Temperatur
zwischen 50°C und 65°C an die DNA-Stränge. Bei der Primer-Extension bindet dann bei einer
Temperatur von 68°C bis 72°C eine hitzestabile DNA-Polymerase Nukleotide entsprechend der
„template“-Sequenz an die 3´-OH-Primer-Enden und synthetisiert somit komplementäre DNA-
Sequenzen.
Die Anzahl der wiederholten Zyklen liegt zwischen 20 und 40, sodass durch die exponentielle
Amplifikation eine große Anzahl von DNA-Molekülen entstehen, die für weitere Arbeitsschritte
eingesetzt werden können. Um eine optimal ablaufende PCR zur ermöglichen, ist besonders die
Auswahl der Reaktionsbedingungen (s. PCR-Programme) und der Oligonukleotid-Primer
entscheidend. Bei den Primern ist zu beachten, dass die Differenz der Schmelztemperatur zwischen