Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

2. Material und Methoden
(bis 15 kb) lassen sich in niedrig konzentrierten Gelen (Endkonzentration ca. 0,5 %) gut auftrennen,
für kleinere Fragmente eignen sich höher konzentrierte Agarosegele. Um die DNA-Fragmente im Gel
sichtbar zu machen, wird der Farbstoff Ethidiumbromid zugegeben, der nach Interkalation in die
DNA-Moleküle unter UV-Licht fluoresziert. Die Größe der Banden kann durch den Vergleich mit
einem DNA-Marker festgestellt werden.
Zu 1 x TAE-Puffer wird Sea Kem GTG Agarose (FMC Bioproducts) bis zu einer Endkonzentration
von 1% gegeben und in der Mikrowelle aufgekocht, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Nach
Abkühlen auf ca. 50°C wird Ethidiumbromid bis zu einer Endkonzentration von 0,1µg/ml zugegeben
und die Lösung in einen Elektrophoreseschlitten mit Kamm gegossen.
Nachdem das Gel auspolymerisiert ist, wird dieses in eine Gelkammer gelegt und mit 1 x TAE-Puffer
überschichtet. Der Kamm wird entfernt und die Proben mit 1/5 V 5 x DNA-Stop-Puffer versetzt und in
die Taschen pipettiert. In eine weitere Tasche wird zur Größenbestimmung der DNA-Marker
aufgetragen. Das Gel wird mit einer Feldstärke von 5-10 Volt/cm gefahren, bis eine ausreichende
Bandentrennung erreicht ist.
Geräte:
Gelkammer und Power-Supply (Biorad)
Lösungen und Marker:
5 x DNA-STOP-Puffer:
Bromphenolblau 0,05% (w/v)
EDTA 50 mM
Ficoll 15% (v/v)
SDS 0,4% (w/v)
50 x TAE-Puffer 20 µl
Xylenblau 0,05% (w/v)
50 x TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA):
Tris-Base 2 M (pH 7,5)
Na-Acetat 1 M
EDTA 50 mM
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