Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
3. Ergebnisse<br />
3.15 Auswikungen <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-Inhibierung <strong>auf</strong> <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>-<strong>Zell</strong>-Ausbreitung von Listeria<br />
94<br />
monocytogenes<br />
In den vorherigen Versuchen korrelierte <strong>die</strong> Inhibierung <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> mit einer Verringerung <strong>der</strong><br />
<strong>Protrusion</strong>zahl um durchschnittlich 50%. Dadurch stellte sich <strong>die</strong> Frage, welche biologische Relevanz<br />
<strong>die</strong> Inhibierung <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> <strong>und</strong> <strong>die</strong> daraus resultierende Verringerung <strong>der</strong> <strong>Protrusion</strong>zahl für<br />
das Bakterium Listeria monocytogenes haben könnte.<br />
Da eine Reduzierung <strong>der</strong> <strong>Protrusion</strong>zahl eine verringerte <strong>Zell</strong>-<strong>Zell</strong>-Ausbreitung zur Folge haben<br />
müsste, wurde in einem sog. „spreading assay“ das Ausbreitungsverhalten von Listeria<br />
monocytogenes in <strong>ERM</strong>-inhibierten versus wt-<strong>Zell</strong>en verglichen. Für <strong>die</strong>sen Versuch wurde <strong>die</strong> bereits<br />
in vorherigen Exprimenten beschriebene <strong>Zell</strong>linie LLC-PK1 verwendet. Diese <strong>Zell</strong>linie vereint<br />
mehrere Vorteile, <strong>die</strong> sie für <strong>die</strong>sen „assay“ optimal erschienen lies. Zum einen bilden LLC-PK1-<br />
<strong>Zell</strong>en nach mehrtägiger Kultivierung fast kreisr<strong>und</strong>e Kolonien, <strong>die</strong>se Kolonien bestehen aus<br />
polarisierten Einzellschichten (Monolayer). Zum an<strong>der</strong>en sind <strong>die</strong>se <strong>Zell</strong>en von Listeria<br />
monocytogenes nur durch <strong>die</strong> freien basolateralen Seiten <strong>der</strong> Monolayer infizierbar. Somit war im<br />
zeitlichen Verl<strong>auf</strong> eine direktionale Infektion zum Koloniemittelpunkt gewährleistet, <strong>und</strong> durch den<br />
Vergleich des listeriellen Vordringens in den verschiedenen Kolonien gleichen Durchmessers konnten<br />
Rückschlüsse über <strong>die</strong> relative Ausbreitungsgeschwindigkeit gemacht werden.<br />
Zur Inhibierung <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> in den LLC-PK1-<strong>Zell</strong>en wurde <strong>auf</strong> einen bereits beschriebenen<br />
Mechanismus zurückgegriffen (s. 3.10). Durch <strong>die</strong> Transfektion <strong>der</strong> zytoplasmatischen Domäne des<br />
CD44-Rezeptors (CD44tail) sollten <strong>die</strong> <strong>ERM</strong>-<strong>Proteine</strong> sequestriert <strong>und</strong> funktionell inhibiert werden,<br />
außerdem ermöglichte <strong>die</strong> GFP-Markierung <strong>der</strong> <strong>Proteine</strong> eine einfache Selektion von positiv<br />
transfizierten <strong>Zell</strong>en. Die LLC-PK1-<strong>Zell</strong>en wurden mit den GFP-markierten wt CD44-tail <strong>und</strong> zur<br />
Kontrolle mit dem in <strong>der</strong> <strong>ERM</strong>-Bindungsdomäne mutierten CD44tail mut transfiziert. Zur Herstellung<br />
stabil transfizierter LLC-PK1 wurden <strong>die</strong> positiven <strong>Zell</strong>en isoliert <strong>und</strong> durch Antibiotikazugabe über<br />
mehrere Wochen selektiert. Anschließend konnten <strong>die</strong> stabil transfizierten <strong>Zell</strong>en im „spreading assay“<br />
eingesetzt werden.<br />
Zum Vergleich <strong>der</strong> relativen Ausbreitungsgeschwindigkeiten von Listeria monocytogenes in „<strong>ERM</strong>inhibierten“<br />
LLC-PK1-<strong>Zell</strong>en (LLC-PK1+CD44tail) <strong>und</strong> den beiden Kontrollzelllinien (LLC-PK1 <strong>und</strong><br />
LLC-PK1+CD44tail mut) wurde eine definierte Anzahl <strong>der</strong> jeweiligen <strong>Zell</strong>en ausgesät <strong>und</strong> mehrere<br />
Tage kultiviert. Nachdem sich gleichgroße Kolonien gebildet hatten, wurden <strong>die</strong> <strong>Zell</strong>en für 2h bzw. 6h<br />
mit Listerien infiziert, fixiert <strong>und</strong> fluoreszenzmarkiert. Vorversuche zeigten, dass eine sechsstündige<br />
Infektion ausreichend war, um LLC-PK1-Kolonien (wt) von <strong>der</strong> in <strong>die</strong>sem Versuch verwendeten<br />
Größe zum größten Teil zu infizieren.
Change language