Einfluss der ERM-Proteine auf die Protrusion- Ausbildung und Zell ...

3. Ergebnisse
ob die Phosphorylierung des konservierten Threonin-Rests in der C-terminalen Domäne der ERM
(Thr567 im Ezrin, Thr564 im Radixin und Thr558 im Moesin) für die Aktivierung der ERM-Proteine
mit der anschließenden Rekrutierung in die Protrusions verantwortlich ist.
Zur vorläufigen Untersuchung dieser Fragestellung fiel die Wahl auf eine Zelllinie, die Gautreau et al.
(2000) in ihrer Arbeit zur Funktions-Analyse der Phosphorylierung des Threonin-Restes Thr567 im
Ezrin verwendeten. Diese Nierenepithelzelllinie LLC-PK1 aus Sus scrofa war stabil mit
Phosphomutanten des Ezrin transfiziert worden, wodurch zwei verschiedene
Phosphorylierungszustände imitiert werden konnten. Neben den wt Zellen und den mit dem leeren
Klonierungsvektor transfizierten Zellen (LLC-Pk1+pCB6) standen zwei weitere Zelllinien zur
Verfügung. Diese Zellen exprimierten Ezrin-Mutanten, bei denen das Thr567 jeweils durch Alanin
bzw. Asparaginsäure substituiert worden war (LLC-Pk1+T/A bzw. LLC-Pk1+T/D). Durch die Alanin-
Substitution war das Ezrin an der Aminosäureposition 567 nicht mehr phosphorylierbar, was dem
Phosphorylierungszustand eines inaktivierten, maskierten Ezrin-Moleküls entspricht. Hingegen wurde
durch das Einfügen der Asparaginsäure eine Phosphorylierung dieser Position imitiert, wie es in
aktivierten Ezrin-Molekülen vorkommt.
Mit dieser Zelllinie bestand nun die Möglichkeit, den potentiellen Einfluss der Phosphorylierung am
konservierten Threonin 567 im Ezrin zu untersuchen. Sollte eine Phosphorylierung des Ezrins an
dieser Stelle zu einer Aktivierung des Proteins führen, so müsste durch die Transfektion der Ezrin-
Mutanten eine Veränderung in der Protrusion-Ausbildung zu erkennen sein. Zunächst wurde geprüft,
ob die Ezrin-Mutanten in die Listerien-induzierten Protrusions rekrutiert werden. Hierfür wurden die
infizierten Zellen nach der Fixierung mit einem anti-VSV-G Antikörper behandelt, um die Epitopmarkierten
mutierten Ezrin-Proteine detektieren zu können. Gegen den anti-VSV-G Antikörper wurde
dann ein fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper eingesetzt, um anschließend die Ezrin-Mutanten
unter dem Fluoreszenzmikroskop lokalisieren zu können. Zum Vergleich wurden in den
untransfizierten LLC-PK1-Zellen und den LLC-Pk1+pCB6-Zellen mit einem anti-Ezrin Antikörper
die Lokalisation des endogenen Ezrins bestimmt.
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