DPMA - Erfinderaktivitäten 2006/2007

Beobachtung wurde 1992 beim eukaryotischen roten
Brotschimmelpilz Neurospora crassa gemacht [19]. Dieser
Pilz zeigte nach dem Einbringen eines Gens, welches an
der Carotenoidsynthese involviert ist, das Auftreten von
Albinomutanten. Das zusätzlich eingebrachte exogene
Gen unterdrückt hierbei die Expression eines Enzymes,
welches für die Carotenoidsynthese erforderlich ist. Dieser
Befund, welcher den gleichen Ursprung wie die
Cosuppression besitzt, wurde als Quelling bezeichnet [20]
[21]. Schon seit langem ist bekannt, dass Messenger-RNA
durch eine komplementäre (Antisense) RNA ausgeschaltet
werden kann. Da dieser Abbauprozess nach der
Transkription der mRNA erfolgt, wurde dieser als
„posttranskriptionales Gene Silencing“ (PTGS) bezeichnet
[22].
Der Antisense-Begriff wurde 1985 durch Inouye et al.
geprägt, basierend auf der Beobachtung, dass sich in dem
Darmbakterium E. coli bei der Transkription einer
Antisense-RNA (Gegensinn-RNA) die Menge an mRNA
verringerte [23].
Auch bei vielen anderen Modellorganismen wie z.B. in bei
Viren („virus-induced gene silencing" (VIGS)) [22] konnte
bestätigt werden, dass Gene posttranskriptionell dadurch
stillgelegt werden können, indem man eine Abschrift des
Zielgens mit umgekehrter Reihenfolge (komplementäres
exogenes Gen) in die Zelle einschleust. Bei diesem
Verfahren wird vom exogenen Transgen eine
komplementäre Gegensinn-RNA (Antisense-RNA)
abgelesen, währenddessen das normale zelluläre
(endogene) Gen eine translatierbare mRNA synthetisiert.
Zunächst vermutete man, dass sich RNA mit
entsprechender Antisense-RNA hybridisiert und der so
entstandene Doppelstrang den Weg zu den Ribosomen
und damit die Translation zu den entsprechenden
Genprodukten (Proteinen) verhindert. Ein Nachweis eines
„Sense-und Antisense-RNA-Komplexes“ konnte aber nicht
erbracht werden. Vielmehr waren nach der erfolgreichen
Stilllegung eines spezifischen Gens sowohl die mRNA als
auch Antisense-RNA nicht mehr nachweisbar, eine
Beobachtung, die der erwarteten größeren Stabilität von
doppelsträngiger RNA (dsRNA) widersprach. Da weder
Sense- noch Antisense-RNA Reste entdeckt wurden,
musste demzufolge die Menge beider Typen von RNA
exakt identisch sein, sodass der Mechanismus des „Gene
silencing“ basierend auf Antisense-RNA weitgehend
unverständlich blieb [24]. Spezifische Doppelstrang-
RNasen wurden postuliert und auch identifiziert, jedoch
konnte kein direkter Zusammenhang zu Antisense-
Mechanismen bewiesen werden [25]. Trotz fehlender
Kenntnis des Wirkmechanismus, wurde Cosuppression
und Antisense-RNA erfolgreich bei der Herstellung
gentechnisch abgewandelter Nutzpflanzen, wie
beispielsweise der „Anti-Matsch-Tomate“ (Flavr-Savr-
Tomate) [26] eingesetzt.
Bei Experimenten am Fadenwurm Caenorhabditis elegans
(C. elegans), welcher in vielen wissenschaftlichen Arbeiten
als Modellsystem dient [27], entdeckten Andrew Fire und
Craig Mello 1998 [15], dass bei gleichzeitiger Injektion von
Sense- (mRNA) und synthetisch hergestellter Antisense-
RNA (eine zur Ziel-mRNA komplementäre RNA)
überraschenderweise die Proteinproduktion wesentlich
effizienter ausgeschaltet werden konnte als beim reinen
Antisense-Versuch. Die Gen-Blockade funktionierte
mitunter auch, wenn die Organismen als Kontrolle nur
synthetisch hergestellte Sense-RNA, aber keine
Antisense-RNA verabreicht bekamen.
Dies widersprach aber der Theorie, wonach ein
doppelsträngiger Komplex aus Boten-RNA und Antisense-
RNA nicht fähig sein sollte, eine Ziel-RNA (mRNA)
spezifisch zu erkennen, sodass die Bildung des von der
mRNA kodierten Proteins in den Ribosomen verhindert
wird. In weiteren Experimenten konnten Fire und Mello
[15] [28] zeigen, dass auch die Injektion
substöchiometrischer Mengen an doppelsträngiger RNA
(dsRNA) in den Fadenwurm C. elegans einen besseren
Silencing-Effekt zur Folge hatte, als die Injektion großer
Mengen an Antisense-Transkripten. Sämtliche Antisense-
Experimente mit künstlich hergestellter einsträngiger RNA
waren also mehr oder weniger mit doppelsträngiger RNA
verunreinigt. Die Entdecker dieser Art der Geninhibition
prägten in Anlehnung an die physikalische Interferenz, bei
der sich Schallwellen überlagern und auslöschen, den
Ausdruck „RNA-Interferenz“ (RNAi), wonach sich hierbei
Ribonukleinsäuremoleküle gegenseitig Matt setzen. Im
Gegensatz zum „Knock-Out“ durch Genunterbrechung
wurde die Genrepression durch RNAi, welche nicht immer
vollständig verlief, als „Knock-Down“ charakterisiert.
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