Dissertation Klaus Heitkamp 1999

86 4 Ergebnisse und DiskussionDazu wurden 20 mg Glucoseoxidase in 5 ml 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]-ethansulfonsäure(HEPES)-Puffer (10 mmol/l; pH 7,8) gelöst und diese Lösung zu 100 mg Aminopropyl-CPG-Beads(50/63,2) gegeben. Die Immobilisierung wurde durch Zugabe von 20 mg1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) gestartet. Das Reaktionsgemischwurde während der fünf Stunden andauernden Reaktion durch Überleiten eines schwachenStickstoffstromes ständig in Bewegung gehalten und durchmischt. Eine mechanischeBelastung der Beads, wie sie z. B. bei Einsatz eines Magnetrührers hätte auftreten können,konnte auf diese Weise vermieden werden. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Beadsabfiltriert und gründlich mit ca. 25 ml Wasser gewaschen. In nachstehender Abbildung ist derallgemeine Reaktionsverlauf der hier eingesetzten Methode zur Enzymimmobilisierungwiedergegeben.HO+R OHR = EnzymrestCH 3H 3C N C N NCH3C H 3N NCOROCH 3NCH 3OSi OSiOHNH +HN NCOOCH 3NCH 3OSi OSiOHNCROR+Abbildung 40HarnstoffderivatReaktionsverlauf der Immobilisierung von Enzymen mit EDAC an Aminopropyl-CPG-BeadsMit den gewaschenen Beads wurde ein Stahlreaktor (Chromatographie-Leersäule 20-4,6;20 mm Länge; 4,6 mm Innendurchmesser, vgl. Tabelle 29) gefüllt. Um die Aktivität undsomit eine erfolgreiche Immobilisierung nachzuweisen, wurde der Reaktor in der Weise ineine HPLC-Anlage eingebaut, daß eine entsprechende Reagenz bzw. die Testlösung im Kreisgefördert werden konnte (vgl. Kapitel 6.6.4). Der Nachweis der Aktivität des immobilisiertenEnzyms erfolgte nach Schuhmann 151 durch Zusatz von Glucose zu der Testlösung. Im Fallevon immobilisierter Glucoseoxidase wird dabei Glucose zu Wasserstoffperoxid umgesetzt.Dieses bildet dann in einer zweiten enzymkatalysierten Reaktion (Meerrettichperoxidase,