Dissertation Klaus Heitkamp 1999

4 Ergebnisse und Diskussion 33niumsulfat bis zu einer Sättigung von 45 % versetzt und anschließend eine Stunde gerührt.Das ausgefallene Protein wurde durch weiteres 15-minütiges Zentrifugieren bei 15000 gabgetrennt, das entstandene Protein-Pellet in 60 ml Phosphatpuffer (40 mmol/l; pH 6,3)suspendiert und die Suspension 24 Stunden gegen 4000 ml Phosphatpuffer (40 mmol/l;pH 6,3) mit zweimaligem Pufferwechsel dialysiert. Die so gewonnene Enzymlösung wurdebei -20 °C gelagert. Eine weitere chromatographische Aufreinigung, wie sie Reddanna et al.vorschlugen, 27 erfolgte nicht.4.1.1.2 Bestimmung des Proteingehaltes und der EnzymaktivitätDer Proteingehalt wurde nach einer von Bradford 123 und Stoschek 124 beschriebenen Methodean einem ELISA-Reader bestimmt.Für die Reagenzlösung wurden 70 mg Serva Blau G im Ultraschallbad in 50 ml Ethanol gelöstund mit 100 ml 85 % Phosphorsäure versetzt. Anschließend wurden unter Rühren 850 mlbidest. Wasser hinzugefügt. Die Lösung wurde in einer Braunglasflasche im Kühlschrankaufbewahrt. Als Proteinstandard diente Rinderserumalbumin. Durch Verdünnen mit Phosphatpuffer(40 mmol/l; pH 6,3) wurden drei Protein-Standard-Lösungen mit einem Gehalt von0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml und 0,15 mg/ml hergestellt. Die Probenlösung wurde im Verhältnis1:100 und 1:200 verdünnt. Jeweils 10 µl Standard- bzw. Probenlösung wurden auf einerMikrotiterplatte (96 Kavitäten) mit je 200 µl der Reagenzlösung versetzt. Die Platte wurde 15Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und anschließend in einem ELISA-Reader bei 590 nm vermessen. Sowohl von den Standard- als auch von den Probenlösungenerfolgte jeweils eine Dreifachbestimmung (für die 1:100-Verdünnung wurden 9 Wertegemessen). Die sich ergebenden Meßwerte und die entsprechende Kalibrierkurve sindnachstehend aufgeführt. Dabei kam es bei der Messung der Proben vermutlich aufgrund vonMatrixeffekten zu einer größeren Streuung der Meßwerte.