Dissertation Klaus Heitkamp 1999

3 Theoretischer Teil 29Neben diesen Detektionsmöglichkeiten werden in der RP-HPLC bevorzugt Fluoreszenzsystemezur Nachsäulenderivatisierung eingesetzt. Lazrus et al. entwickelten 1985 ein Fließinjektionssystemzur Analyse von Wasserstoffperoxid. 107 Die Detektion beruht auf der durchMeerrettichperoxidase katalysierten Dimerisierung von 4-Hydroxyphenylessigsäure inGegenwart von Hydroperoxiden. Das entstandene Dimer (2,2´-Dihydroxy-5,5´-dicarboxymethyl-biphenyl)zeigt im Vergleich zum Monomer eine ausgeprägte Fluoreszenz.COOHHOOCHO2 + ROOHPeroxidase (HRP oder MP-11)OHOHCOOHAbbildung 18Oxidation von PES zum fluoreszierenden PES-Dimer unter katalytischerAktivität von PeroxidaseHellpointner und Gäb erweiterten das Verfahren, setzten es in der HPLC-Analytik von Alkylhydroperoxidenein und erreichten damit eine Nachweisgrenze von ca. 0,07 µmol/l. 108 Eszeigte sich jedoch, daß bei Einsatz von Meerrettichperoxidase die Detektion sekundärerHydroperoxide, also auch der Lipidhydroperoxide, nicht möglich ist. 11,109 Ursache ist die beider Meerrettichperoxidase auftretende Steuerung der Selektivität durch einen sogenannten"ligand access channel". Aufgrund sterischer Hinderungen gelangen verzweigte und längerkettigeHydroperoxide nicht mehr zum aktiven Zentrum. Im Gegensatz dazu stellt Mikroperoxidasekeine sterischen Anforderungen an das Substratmolekül. Das aktive Zentrum liegthier frei. Mikroperoxidase MP-11 ist ein Häminundecapeptid, das mit Hilfe proteolytischerEnzyme aus Cytochrom c gewonnen wird (vgl. Abbildung 39, Seite 84). Daneben gibt esnoch weitere Arten von Mikroperoxidasen, z.B. MP-8 oder MP-9, wobei die Ziffern dieAnzahl der Aminosäuren im Molekül anzeigen. In der Analytik von Hydroperoxiden werdendiese Mikroperoxidasen jedoch kaum eingesetzt.Die freie Zugänglichkeit des aktiven Zentrums für Substratmoleküle nutzte Kurth zumNachweis lipophiler Alkylhydroperoxide mittels der HPLC aus. 109 Heinmöller entwickeltedas Verfahren weiter, vereinfachte es und nutzte es erstmals zur Nachsäulenderivatisierungvon Fettsäurehydroperoxiden in der RP-HPLC. 11 Die Nachweisgrenze lag bei 2 µmol/l fürHydroperoxide der Linol- und Linolensäure und deren Methylester.