Dissertation Klaus Heitkamp 1999

3 Theoretischer Teil 27Isoluminol (6-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) und Cytochrom c bzw. Mikroperoxidaseund anschließender Messung der bei Anwesenheit von Hydroperoxiden entstehendenChemilumineszenz. Nach Yamamoto et al. ist die Verwendung von Isoluminol aufgrund desbesseren Signal-Rausch-Verhältnisses dem Einsatz von Luminol vorzuziehen. 93,94 Allgemeinerlaubt die Chemilumineszenzmessung die Bestimmung sehr geringer Hydroperoxidkonzentrationen.So gaben Miyazawa et al. bei der Verwendung von Cytochrom c eineabsolute Nachweisgrenze von etwa 7 nmol (entsprechend 0,7 µmol/l) für verschiedenePhospholipidhydroperoxide an. 95 Neben der hohen Empfindlichkeit hat die Chemilumineszenzbestimmungvon Lipidhydroperoxiden in der HPLC den weiteren Vorteil, daß sie nichtnur in Zusammenhang mit Normalphasen, sondern auch in der RP-HPLC eingesetzt werdenkann. 96Die Bildung rot gefärbter Eisen-Thiocyanat-Komplexe (vgl. Kapitel 3.3.1) wurde im Zusammenhangmit der Trennung von Phospholipiden an Normalphasen ebenfalls als Detektionsmöglichkeiteingesetzt. 97 Die Trennung erfolgte dabei durch Gradientenelution mit Chloroform-Methanol.Die mit diesem Reaktionssystem erreichte Nachweisgrenze lag bei etwa0,2 nmol (entsprechend ca. 0,01 µmol/l).Akasaka et al. beschrieben 1987 eine fluorimetrische Bestimmungsmethode für Lipidhydroperoxide,98 die später für die Nachsäulenderivatisierung in der NP-HPLC weiterentwickeltwurde. 99 Die Detektion beruht auf der Oxidation von Diphenyl-1-pyrenylphosphin durchHydroperoxide zu dem entsprechenden Phosphinoxid (Abbildung 17). Dieses zeigte in vorangegangenenVersuchen im Vergleich zu anderen aromatischen Phosphinoxiden eine sehrstarke Fluoreszenz. 100POP[O]nicht fluoreszierendfluoreszierendλ ex= 352 nm λ em= 380 nmAbbildung 17Oxidation von Diphenyl-1-pyrenylphosphin zum fluoreszierenden Phosphinoxid