Dissertation Klaus Heitkamp 1999

4 Ergebnisse und Diskussion 105vermessen (λ em = 234 nm, λ ex = 415 nm). Dabei wurde ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenzüber mehrere Minuten beobachtet. Die Beads wurden daraufhin gründlich mit 2-Propanolgespült und mit je 1 ml Hexan und einer Lösung von 4 mg PES in 100 ml 2-Propanol versetzt.Nach Zugabe von 100 µl einer 13S-HPOD-Me-Ester-Lösung (1 mmol/l in Hexan) undDurchmischen wurde die Lösung erneut in einem Fluoreszenzphotometer vermessen. EinePeroxidaseaktivität konnte unter diesen Bedingungen auch nach längerer Zeit nicht beobachtetwerden. Nach erneutem Umspülen mit 2-Propanol, Methanol und Wasser auf einmethanolisch-wäßriges System zeigten die Beads wieder eine Aktivität, die im Vergleich zuvorher jedoch deutlich geringer war.Aufgrund dieser Ergebnisse war ein Einsatz der MP-11-Reaktoren unter NP-Bedingungennicht möglich. Dies wurde auch durch HPLC-Versuche bestätigt, bei denen ein entsprechenderEnzymreaktor in ein NP-HPLC-System eingebaut wurde. Selbst bei Injektion größererMengen an Hydroperoxid konnte kein Fluoreszenzsignal beobachtet werden. Wie dieKüvettentests zeigten, schien der Einsatz der MP-11-Reaktoren in einem apolaren, nichtwäßrigen Lösungsmittel nicht zu einer dauerhaften, irreversiblen Inaktivierung zu führen.Vermutlich spielt hier der Wasseranteil im Lösungsmittel eine entscheidende Rolle für dieAktivität des Enzyms, wie es Li und Ward 161 für Lipase in organischen Lösungsmittelnbeschrieben. Insgesamt decken sich die hier erhaltenen Ergebnisse mit den Beobachtungenvon Siegel und Roberts 89 über das Verhalten von Meerrettichperoxidase (HRP) in organischenLösungsmitteln. Danach zeigte HRP in protischen Lösungsmitteln mit einer hohen Dielektrizitätskonstanteneine katalytische Aktivität, während in aprotischen Lösungsmitteln, wieHexan, Dioxan oder Benzol keine Aktivität nachweisbar war.4.5.10 Diskussion der ErgebnisseDie in diesem Kapitel beschriebene Methode zur direkten kovalenten Bindung von Mikroperoxidase-11an Aminopropyl-CPG-Beads hat sich wegen ihrer Einfachheit und schnellenDurchführbarkeit gut bewährt. Aufgrund früherer Ergebnisse wurde auf den Einfluß vonSpacer-Molekülen verzichtet. Dadurch ergab sich im Vergleich zu den Arbeiten von Jacob 148eine höhere Trägerbelegung und letztendlich auch eine höhere Peroxidaseaktivität desImmobilisates. Die Bestimmung der Trägerbelegung erfolgte über die atomabsorptionsspektrometrischeMessung des Eisengehaltes. Die aus der Differenzmessung (Messung des