Dissertation Klaus Heitkamp 1999

92 4 Ergebnisse und DiskussionDas Füllen erfolgte somit mit einer Kombination beider Techniken:Der Reaktor wurde mit einer Suspension des Enzymimmobilisates gefüllt. Anschließendwurde ein erhöhter Stickstoffstrom durch den Reaktor geleitet, wobei sich das Immobilisatabsetzte, und die Flüssigkeit aus dem Reaktor getrieben wurde. Es wurde jeweils daraufgeachtet, daß die Beads nicht austrockneten und immer eine geringe Restfeuchte vorhandenwar. Im nächsten Schritt wurde der Reaktor verschlossen und mit 10-20 ml HEPES-Puffer(10 mmol/l; pH 7,8) bei einer Flußrate von 10 ml/min gespült. Nach erneutem Austreiben derFlüssigkeit mit Stickstoff wurde der Reaktor wieder geöffnet und gegebenenfalls weiteresEnzymimmobilisat zugegeben, so daß der Reaktorinnenraum vollständig gefüllt war. Nachnochmaligem Durchleiten von Stickstoff wurde der Reaktor wieder verschlossen und in dieHPLC eingebaut bzw. bei 4 °C gelagert.Zur Überprüfung des Einflusses der Füllmethode auf die Peakverbreiterung in der HPLCwurde ein weiterer Reaktor nach der klassischen Suspensionstechnik gefüllt. Dazu wurde einFüllrohr über ein entsprechendes Adapterstück mit Doppelgewinde mit dem zu füllendenReaktor verbunden. Das Füllrohr wurde mit einer Suspension des Enzymimmobilisates gefülltund verschlossen. Anschließend wurde mit einer Pumpe HEPES-Puffer (10 mmol/l; pH 7,8)durch Füllrohr und Reaktor geleitet. Dabei wurde die Flußrate schrittweise von 1 ml/min auf35 ml/min (7 bar) erhöht. Der Reaktor wurde etwa eine Minute bei einem Druck von 7 bargepackt, das Füllrohr wurde abgenommen und der Reaktor fest verschlossen. Der Einfluß derFüllmethode auf die Peakverbreiterung ist in Kapitel 4.5.8 erläutert.4.5.7 Bestimmung der MP-11-AktivitätIn der Literatur existieren zur Bestimmung der Aktivität immobilisierter Enzyme eine Reihemehr oder weniger aufwendiger und komplizierter Vorschriften, mit denen absolute Werte derAktivität berechnet werden können. Man bedient sich dabei in der Regel photometrischerMethoden, bei denen die Umsetzung eines Substrates durch das immobilisierte Enzym zueiner Änderung der Färbung führt. Die Aktivität kann dann bei bekanntem Extinktionskoeffizientenε aus der zeitlichen Änderung der Extinktion ûE berechnet werden. NachGleichung 4 ist die zeitliche Änderung der Extinktion der Aktivität proportional. 157