PlasDIC – eine nützliche Modifikation des differentiellen ... - Carl Zeiss

MIKROSKOPIEBild 5: PlasDIC-Schieber und SpaltblendeWährend in Bild 2 nur der Achsenpunkt ins Kalkül gezogen wurde,erweitern wir jetzt die Beleuchtung um einen achsenfernen Punkt(Abstand b) in der Kondensorbrennebene (Bild 3), so dass derObjektpunkt OP mit dem Aperturwinkel α beleuchtet ist. Diegeneigten Strahlen durch OP bzw. OP 1 und OP 2 kommen in derObjektivbrennebene mit einem vom Shear s (= OP 1 OP 2 ) und derBeleuchtungsapertur (sin α) abhängigen Gangunterschied ∆ an,der erwartungsgemäß das Produkt beider Größen ist:∆ = s · sin α (Gleichung 3)Aus der Funktionskurve in Bild 4 istersichtlich, dass man zur Erzeugung einesausreichenden Kontrastes von 0,64 dieSpaltbreite höchstens einem Viertel desInterferenzstreifenabstandes d O in derObjektivaustrittspupille entsprechend wählensollte. Diese Forderung ist in der Literatur[1] unter dem Begriff „Lambda-Viertel-Bedingung“bekannt geworden. Wennbeispielsweise die auf die Objektebenebezogene Sheargröße gleich der Auflösungsgrenzedes Objektives (= 0,61 λ/nA)ist, darf die Beleuchtungsapertur sin α inShearrichtungλ nAsin α = ____ = ____ (Gleichung 5)4 s 2,44etwa 40% der numerischen Apertur (nA) des Objektives betragen,ohne dabei den genannten Kontrast-Wert zu unterschreiten. Diesenotwendige Reduzierung der Beleuchtungsapertur stellt aber fürdie praktische Anwendung einen ausgewogenen Kompromiss hinsichtlichInterferenzkontrast, Bildqualität und lateraler Auflösungdar, zumal die Beleuchtungsapertur senkrecht zur Shearrichtunguneingeschränkt bleibt.Im gleichen Bildpunkt interferieren also Strahlenpaare mit einemGangunterschied ∆ zwischen Null und s · sin α. Im ungünstigstenFall, nämlich bei ∆ = λ/2, tritt die gleiche Anzahl von Strahlenpaarenauf, die sich gegenseitig verstärken und auslöschen, so dass derKontrast (Quotient aus der Differenz und Summe der maximalenund minimalen Intensität = Michelsonsche Kontrastdefinition) völligverschwindet. Die Beleuchtungsapertur kann demzufolge nichtrotationssymmetrisch sein, weil sie nur in einer Richtung, nämlichder Shearrichtung, einen bestimmten Grenzwert nicht überschreitendarf. Damit ist festgelegt, dass die Kondensor-Irisblende durcheine Spaltblende ersetzt werden muss. Die Spaltbreite bestimmtden Gangunterschied ∆, wobei der Bildkontrast K proportionaleiner sinc-Funktion ist (Bild 4):I max – I minK = ________ ~ sinc (∆ 2π/λ) (Gleichung 4),I max + I minBild 6: Quarz-Dünnschlifflinksrechts4 AnwendungsbeispieleKonventioneller DIC mit Kompensationsprisma, Plan-Neofluar 10x/0,30 ∞/0,17:Das Gangunterschiedsprofil wird im wesentlichen durch das Produkt aus: Doppelbrechung(≈ 0,01) und Schliffdicke (≈ 40 µm) bestimmt.PlasDIC, A-Plan 10x/0,25 ∞/-: Das Objekt-Gangunterschiedsprofil ist nicht mehrdurch die Doppelbrechung des Objektes gestört; die isodiametrischen Gradientendetailskönnen erst jetzt reliefartig dargestellt werden.Das PlasDIC-Verfahren wurde von Carl Zeiss im Herbst des Jahres2003 für Mikroskope umgekehrter Bauart in den Markt eingeführt.PlasDIC-Schieber unterscheiden sich von konventionellen DIC-Schiebern nur durch die Polarisatoren, die auf die Wollastonprismenaufgekittet sind (Bild 5, links). Zu jedem Kondensor existiertnur eine Spaltblende (Bild 5, rechts), die so dimensioniert ist, dassfür alle der drei verwendeten PlasDIC-Schieber bzw. Objektive A-Plan 10x/0,25, LD A-Plan 20x/0,30 und 40x/0,50 mindestens dieλ/4-Bedingung erfüllt ist.Als erstes Testobjekt diente ein Quarz-Dünnschliff der Dicke vonetwa 40 µm, so dass der polarisationsoptische Gangunterschied R(Produkt aus Dicke und Doppelbrechung, d.h., R ≈ 400 nm) bereitsso groß wird, dass feine, auf den Schleifprozess zurückführendeDickeninhomogenitäten im konventionellen DIC (Bild 6, links)nicht mehr detektiert werden können. MitPlasDIC hingegen kann das gewünschtePhasenprofil, das proportional ist demProdukt aus Schliffdicke und Brechzahldifferenzzwischen Umgebung (Kitt) undmittlerer Brechzahl des Quarzes, dargestelltwerden (Bild 6, rechts).Die derzeit erfolgversprechendsten Anwendungendes PlasDIC – Verfahrens liegen imbiologischen und medizinischen Bereich.Häufig untersucht man dort lebende Zellen,die – aus Kostengründen – in Plastik-Petrischalengezüchtet werden. Plastik verhältsich bekanntermaßen optisch anisotrop, sodass zur Untersuchung der Zellen der konventionelleDIC ausscheidet (Bilder 7a undb). Mit PlasDIC hingegen ergibt sich erstmalsdie Möglichkeit einer qualitativ gutenDIC – Darstellung von einzelnen Zellen (Bild7c und 7d), Zellverbänden und dicken Einzelzellenin Zellkulturgefäßen aus Plastik.44 Photonik 1/2004

MIKROSKOPIEabBild 7: Menschliche Epithelzellen ausMundschleimhaut, präpariert in Kunststoff-Petrischale.a Konventioneller DIC mit Kompensationsprisma,Axioskop 2 plus, Plan-Neofluar 10x/0,30 ∞/0,17, achromatisch-aplanatischerKondensor 0,9,Petrischalenboden dem Kondensorzugewandt. Die anisotrope Plastik-Petrischale wirkt stark phasenschiebend,so dass der Reliefeffekt des DICkaum erkennbar ist.b wie a, aber Plan-Neofluar 40x/0,75∞/0,17. Die größere Beleuchtungsaperturbedingt eine zusätzliche Verringerungdes Reliefkontrastes!c PlasDIC, Axiovert 40, A-Plan 10x/0,25 ∞/-, Petrischalenboden demObjektiv zugewandt. Die Anisotropieder Plastik-Petrischale hat keinen Einflussauf die DIC-Abbildung!d wie c, aber LD A-Plan 40x/0,50 ∞/1,0cdBesonders geeignet ist das PlasDIC-Verfahren für die Reproduktionsmedizin,wie z.B. die in-vitro-Fertilisation.5 ZusammenfassungDurch die Erzeugung polarisierten Lichtes erst nach dem Durchgangdurch Kondensor, Objekt und Objektiv sowie geeigneter Aperturblendengeometrienwird erstmals die Voraussetzung geschaffen,polarisationsoptischen differentiellen Interferenzkontrast in guterQualität auch dann zu erzeugen, wenn Kondensor, Objektträger,Objekt und Objektiv optisch anisotropen Charakter aufweisen.Danksagung:Ansprechpartner:Rainer DanzCarl Zeiss, Werk GöttingenLichtmikroskopieKönigsallee 9-21D-37081 GöttingenTel. 0551/5060-368Fax 0551/5060-464eMail: danz@zeiss.demikro@zeiss.deInternet: www.zeiss.deHerrn Gerhard Börner, Jena, Herrn Dr. Martin Völcker und Herrn Dr.Michael Zölffel, Göttingen, danken wir für die kritische Durchsichtdes Manuskriptes.Literaturhinweise:[1] Beyer, H.: Theorie und Praxis der Interferenzmikroskopie,Akad. Verlagsgesellschaft. Geest & Portig K.-G. Leipzig, 1974[2] Smith, F. H.: Microscopes, Brit. Patent 639 014, Class 97(i),Group XX, 1947[3] Nomarski, G.: Interféromètre à polarisation, Franz. Patent1.059.123, 1952[4] Pluta M.: Mikrointerferometria w swietle spolaryzowanym,Wydawnictwa Naukowo-Technicze, 1990 ; siehe auch M.Françon, Einführung in die neueren Methoden der Lichtmikroskopie,Karlsruhe: Verlag G. Braun 1967[5] Danz, R. u. P.Gretscher: C-DIC – ein neues mikroskopischesVerfahren zur rationellen Untersuchung von Phasenstrukturenin Auflichtanordnung, Photonik 35, No. 4, 2003[6] Danz, R. et al.: Anordnung und Verfahren zum polarisationsoptischenInterferenzkontrast, Europäische PatentanmeldungEP 1 359 453, 2003Anke VogelgsangTel. 0551/5060-619eMail: an.vogelgsang@zeiss.deDr. Rolf KäthnerTel. 0551/5060-429eMail: kaethner@zeiss.dePhotonik 1/2004 45