PlasDIC – eine nützliche Modifikation des differentiellen ... - Carl Zeiss
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MIKROSKOPIEBild 5: <strong>PlasDIC</strong>-Schieber und SpaltblendeWährend in Bild 2 nur der Achsenpunkt ins Kalkül gezogen wurde,erweitern wir jetzt die Beleuchtung um <strong>eine</strong>n achsenfernen Punkt(Abstand b) in der Kondensorbrennebene (Bild 3), so dass derObjektpunkt OP mit dem Aperturwinkel α beleuchtet ist. Diegeneigten Strahlen durch OP bzw. OP 1 und OP 2 kommen in derObjektivbrennebene mit <strong>eine</strong>m vom Shear s (= OP 1 OP 2 ) und derBeleuchtungsapertur (sin α) abhängigen Gangunterschied ∆ an,der erwartungsgemäß das Produkt beider Größen ist:∆ = s · sin α (Gleichung 3)Aus der Funktionskurve in Bild 4 istersichtlich, dass man zur Erzeugung <strong>eine</strong>sausreichenden Kontrastes von 0,64 dieSpaltbreite höchstens <strong>eine</strong>m Viertel <strong>des</strong>Interferenzstreifenabstan<strong>des</strong> d O in derObjektivaustrittspupille entsprechend wählensollte. Diese Forderung ist in der Literatur[1] unter dem Begriff „Lambda-Viertel-Bedingung“bekannt geworden. Wennbeispielsweise die auf die Objektebenebezogene Sheargröße gleich der Auflösungsgrenze<strong>des</strong> Objektives (= 0,61 λ/nA)ist, darf die Beleuchtungsapertur sin α inShearrichtungλ nAsin α = ____ = ____ (Gleichung 5)4 s 2,44etwa 40% der numerischen Apertur (nA) <strong>des</strong> Objektives betragen,ohne dabei den genannten Kontrast-Wert zu unterschreiten. Diesenotwendige Reduzierung der Beleuchtungsapertur stellt aber fürdie praktische Anwendung <strong>eine</strong>n ausgewogenen Kompromiss hinsichtlichInterferenzkontrast, Bildqualität und lateraler Auflösungdar, zumal die Beleuchtungsapertur senkrecht zur Shearrichtunguneingeschränkt bleibt.Im gleichen Bildpunkt interferieren also Strahlenpaare mit <strong>eine</strong>mGangunterschied ∆ zwischen Null und s · sin α. Im ungünstigstenFall, nämlich bei ∆ = λ/2, tritt die gleiche Anzahl von Strahlenpaarenauf, die sich gegenseitig verstärken und auslöschen, so dass derKontrast (Quotient aus der Differenz und Summe der maximalenund minimalen Intensität = Michelsonsche Kontrastdefinition) völligverschwindet. Die Beleuchtungsapertur kann demzufolge nichtrotationssymmetrisch sein, weil sie nur in <strong>eine</strong>r Richtung, nämlichder Shearrichtung, <strong>eine</strong>n bestimmten Grenzwert nicht überschreitendarf. Damit ist festgelegt, dass die Kondensor-Irisblende durch<strong>eine</strong> Spaltblende ersetzt werden muss. Die Spaltbreite bestimmtden Gangunterschied ∆, wobei der Bildkontrast K proportional<strong>eine</strong>r sinc-Funktion ist (Bild 4):I max <strong>–</strong> I minK = ________ ~ sinc (∆ 2π/λ) (Gleichung 4),I max + I minBild 6: Quarz-Dünnschlifflinksrechts4 AnwendungsbeispieleKonventioneller DIC mit Kompensationsprisma, Plan-Neofluar 10x/0,30 ∞/0,17:Das Gangunterschiedsprofil wird im wesentlichen durch das Produkt aus: Doppelbrechung(≈ 0,01) und Schliffdicke (≈ 40 µm) bestimmt.<strong>PlasDIC</strong>, A-Plan 10x/0,25 ∞/-: Das Objekt-Gangunterschiedsprofil ist nicht mehrdurch die Doppelbrechung <strong>des</strong> Objektes gestört; die isodiametrischen Gradientendetailskönnen erst jetzt reliefartig dargestellt werden.Das <strong>PlasDIC</strong>-Verfahren wurde von <strong>Carl</strong> <strong>Zeiss</strong> im Herbst <strong>des</strong> Jahres2003 für Mikroskope umgekehrter Bauart in den Markt eingeführt.<strong>PlasDIC</strong>-Schieber unterscheiden sich von konventionellen DIC-Schiebern nur durch die Polarisatoren, die auf die Wollastonprismenaufgekittet sind (Bild 5, links). Zu jedem Kondensor existiertnur <strong>eine</strong> Spaltblende (Bild 5, rechts), die so dimensioniert ist, dassfür alle der drei verwendeten <strong>PlasDIC</strong>-Schieber bzw. Objektive A-Plan 10x/0,25, LD A-Plan 20x/0,30 und 40x/0,50 min<strong>des</strong>tens dieλ/4-Bedingung erfüllt ist.Als erstes Testobjekt diente ein Quarz-Dünnschliff der Dicke vonetwa 40 µm, so dass der polarisationsoptische Gangunterschied R(Produkt aus Dicke und Doppelbrechung, d.h., R ≈ 400 nm) bereitsso groß wird, dass f<strong>eine</strong>, auf den Schleifprozess zurückführendeDickeninhomogenitäten im konventionellen DIC (Bild 6, links)nicht mehr detektiert werden können. Mit<strong>PlasDIC</strong> hingegen kann das gewünschtePhasenprofil, das proportional ist demProdukt aus Schliffdicke und Brechzahldifferenzzwischen Umgebung (Kitt) undmittlerer Brechzahl <strong>des</strong> Quarzes, dargestelltwerden (Bild 6, rechts).Die derzeit erfolgversprechendsten Anwendungen<strong>des</strong> <strong>PlasDIC</strong> <strong>–</strong> Verfahrens liegen imbiologischen und medizinischen Bereich.Häufig untersucht man dort lebende Zellen,die <strong>–</strong> aus Kostengründen <strong>–</strong> in Plastik-Petrischalengezüchtet werden. Plastik verhältsich bekanntermaßen optisch anisotrop, sodass zur Untersuchung der Zellen der konventionelleDIC ausscheidet (Bilder 7a undb). Mit <strong>PlasDIC</strong> hingegen ergibt sich erstmalsdie Möglichkeit <strong>eine</strong>r qualitativ gutenDIC <strong>–</strong> Darstellung von einzelnen Zellen (Bild7c und 7d), Zellverbänden und dicken Einzelzellenin Zellkulturgefäßen aus Plastik.44 Photonik 1/2004
MIKROSKOPIEabBild 7: Menschliche Epithelzellen ausMundschleimhaut, präpariert in Kunststoff-Petrischale.a Konventioneller DIC mit Kompensationsprisma,Axioskop 2 plus, Plan-Neofluar 10x/0,30 ∞/0,17, achromatisch-aplanatischerKondensor 0,9,Petrischalenboden dem Kondensorzugewandt. Die anisotrope Plastik-Petrischale wirkt stark phasenschiebend,so dass der Reliefeffekt <strong>des</strong> DICkaum erkennbar ist.b wie a, aber Plan-Neofluar 40x/0,75∞/0,17. Die größere Beleuchtungsaperturbedingt <strong>eine</strong> zusätzliche Verringerung<strong>des</strong> Reliefkontrastes!c <strong>PlasDIC</strong>, Axiovert 40, A-Plan 10x/0,25 ∞/-, Petrischalenboden demObjektiv zugewandt. Die Anisotropieder Plastik-Petrischale hat k<strong>eine</strong>n Einflussauf die DIC-Abbildung!d wie c, aber LD A-Plan 40x/0,50 ∞/1,0cdBesonders geeignet ist das <strong>PlasDIC</strong>-Verfahren für die Reproduktionsmedizin,wie z.B. die in-vitro-Fertilisation.5 ZusammenfassungDurch die Erzeugung polarisierten Lichtes erst nach dem Durchgangdurch Kondensor, Objekt und Objektiv sowie geeigneter Aperturblendengeometrienwird erstmals die Voraussetzung geschaffen,polarisationsoptischen <strong>differentiellen</strong> Interferenzkontrast in guterQualität auch dann zu erzeugen, wenn Kondensor, Objektträger,Objekt und Objektiv optisch anisotropen Charakter aufweisen.Danksagung:Ansprechpartner:Rainer Danz<strong>Carl</strong> <strong>Zeiss</strong>, Werk GöttingenLichtmikroskopieKönigsallee 9-21D-37081 GöttingenTel. 0551/5060-368Fax 0551/5060-464eMail: danz@zeiss.demikro@zeiss.deInternet: www.zeiss.deHerrn Gerhard Börner, Jena, Herrn Dr. Martin Völcker und Herrn Dr.Michael Zölffel, Göttingen, danken wir für die kritische Durchsicht<strong>des</strong> Manuskriptes.Literaturhinweise:[1] Beyer, H.: Theorie und Praxis der Interferenzmikroskopie,Akad. Verlagsgesellschaft. Geest & Portig K.-G. Leipzig, 1974[2] Smith, F. H.: Microscopes, Brit. Patent 639 014, Class 97(i),Group XX, 1947[3] Nomarski, G.: Interféromètre à polarisation, Franz. Patent1.059.123, 1952[4] Pluta M.: Mikrointerferometria w swietle spolaryzowanym,Wydawnictwa Naukowo-Technicze, 1990 ; siehe auch M.Françon, Einführung in die neueren Methoden der Lichtmikroskopie,Karlsruhe: Verlag G. Braun 1967[5] Danz, R. u. P.Gretscher: C-DIC <strong>–</strong> ein neues mikroskopischesVerfahren zur rationellen Untersuchung von Phasenstrukturenin Auflichtanordnung, Photonik 35, No. 4, 2003[6] Danz, R. et al.: Anordnung und Verfahren zum polarisationsoptischenInterferenzkontrast, Europäische PatentanmeldungEP 1 359 453, 2003Anke VogelgsangTel. 0551/5060-619eMail: an.vogelgsang@zeiss.deDr. Rolf KäthnerTel. 0551/5060-429eMail: kaethner@zeiss.dePhotonik 1/2004 45