PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE

I - 1MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - VersuchsprotokolleKurs:______Arbeitsplatz-Nr.:_______Name:__Beispiel aus dem Kurs 7 - WS 2003/04___neue Fragen fett gedrucktVersuchsprotokoll zu Abschnitt IVersuch 1:Gleichzeitige potentiometrische und photometrische Titration von para-Nitrophenol1.2.1 Messwert (E 0 , E 1 bis E 16 ) sowie ∆E-Werte (von ∆E 1 bis ∆E 16 und ∆E max ) in Tabelle 1eintragen.Tabelle 1NaOH-Zugabe Einpipettierte pH - Wert Extinktionenin µl Menge anEE - E 0 = ∆ENaOH in ml0 0 01. 50 0,05 ml2. 50 0,10 ml3. 100 0,20 ml4. 200 0,40 ml5. 400 0,80 ml6. 200 1,00 ml7. 200 1,20 ml8. 200 1,40 ml9. 400 1,80 ml10. 100 1,90 ml11. 50 1,95 ml12. 50 2,00 ml13. 50 2,05 ml14. 50 2,10 ml15. 100 2,20 ml16. 300 2,50 ml∆E max = _0,457___

I - 2MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - Versuchsprotokolle1.2.2 pH-Werte (linke Ordinate: 1 pH =^ 2 cm) und Extinktionswerte (rechte Ordinate: 0,1∆E =^ 2 cm) gegen den NaOH-Verbrauch (gemeinsame Abszisse: 1 ml NaOH =^ 5 cm)graphisch darstellen.Diagramm 1pH1211Äquivalenzpunkt0.60.5∆E10∆E max =0,45798pK S0.40.31/27pK S0,60.26540.10,60.00.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5ml NaOH1/2 1/21/21.2.3 Äquivalenzpunkt (auf der pH-Skala) und pK-Wert graphisch aus Diagramm 1 ermitteln.Äquivalenzpunkt:_9,75_ (2,05 ml NaOH)pK-Wert:__7,0_ (1,025 ml NaOH)Literaturwert: 7,15Hinweis: Theoretischer ÄquivalenzpunktpNP - + H 2 O pNPH + OH -pOH = ½ (pK B – lg c); pK B = 14 – 7,15 = 6,85; c = 20 mM (Verdünnung durchNaOH vernachlässigt)pOH = ½ (6,85 – lg 0,02) = 4,27pH = 14 – pOH = 14 – 4,27 = 9,73

I - 3MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - Versuchsprotokolle1.2.4 Berechnen Sie die exakte Konzentration der titrierten p-Nitrophenollösung unter derVoraussetzung, dass die zur Titration verwendete Natronlauge genau 1,00 M war.am Äquivalenzpunkt: molare Menge p-Nitrophenol = molare Menge zugegebene NaOH:;Menge = Konzentration x Volumen = c · Vc pNP · V pNP = c NaOH · V NaOH ; c pNP = c NaOH · V NaOH / V pNP ;c pNP = 1 M · 2,05 ml/ 100 ml = 0,0205 M → 20,5 mM1.2.5 pK-Wert zweimal mit Hilfe der Henderson-Hasselbalch’schen Gleichung berechnenunter Verwendung der aus der graphischen Darstellung (Diagramm 1) abgelesenen Wertefür die Extinktion und den pH bei 0,6 ml und 1,6 ml NaOH-Verbrauch.∆E max = 0,457pK (0,6 ml): pH = 6,6; ∆E = 0,145; pK = 6,6 – lg {0,145/(0,457- 0,145)} == 6,93pK (1,6 ml): pH = 7,65; ∆E = 0,360; pK = 7,65 – lg {0,360/(0,457- 0,360)} == 7,08Mittelwert: pK = (6,93 + 7,08)/2 = 7,005Literaturwert zum Vergleich: pK = 7,15 (für c → 0)1.2.6 Bestimmen Sie aus der graphischen Darstellung (Diagramm 1) die mittlere Pufferkapazität(∆[Pufferbase]/∆pH) des p-Nitrophenol/ p-Nitrophenolat-Pufferszwischen pH = 5,0 und pH = 6,0: 0,17 mmol/pHzwischen pH = 6,5 und pH = 7,5: 10 mmol/pH120.6111090.5∆E max =0,4570.4pH87650.30.20.1∆E40.00.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5ml NaOH (1 M)→ mmol NaOH∆(NaOH) = 1,5-0,5 = 1,0 mmol∆(pNP - ) = 1/0,1 = 10 (mmol/l), weil Volumen 100 ml = 0,1 l∆(pNP - )/ ∆pH = 10/1 = 10 (mM/pH)∆(NaOH) = 0,19-0,02 = 0,17 mmol∆(pNP - ) = 0,17/0,1 = 1,7 (mmol/l)∆(pNP - )/ ∆pH = 1,7/1 = 1,7 (mM/pH)

I - 4MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - VersuchsprotokolleVersuch 2:Kohlensäure-Hydrogencarbonat-Puffer2.2.1 Berechnen Sie die Molarität des NaHCO 3 (MG = 84) und des NaCl (MG = 58,5) in deraufstehenden Salzlösung-I.Zum Vergleich: Eine "physiologische Kochsalzlösung" ist 153 mM und 306 milliosmolar.Molarität = (g/l)/Molekular bzw. FormelgewichtNaHCO 3 : 2,1/84 = 0,025 (M = mol/l) → 25 mMNaCl: 7,5/58,5 = 0,128 (M = mol/l) → 128 mMSumme: 153 mM → 306 mosmolar2.2.2 Die gemessenen Extinktionen in Tabelle 2 (nächste Seite) eintragen und die Tabelle vervollständigenDazu müssen zunächst die pH-Werte in den vier Küvetten berechnetwerden, wofür der pK-Wert des p-Nitrophenols jetzt als bekannt vorausgesetzt wird: pKdes p-Nitrophenols = 7,15.2.2.3 Mit den in 2.2.2 bestimmten pH-Werten für die Küvetten 1 bis 3 wird jeweils das pK 1 'der Kohlensäure berechnet und der Mittelwert gebildet.Küvette 1:Küvette 2:Küvette 3:pH = 6,56; pK 1 ' = __6,338__pH = 7,23; pK 1 ' = __6,309__pH = 7,61; pK 1 ' = __6,388__pK 1 ' (Mittelwert) = _6,345__ → 6,35Berechnung von pK S´ (Platz Nr. 5):Küv. 1, 50 Vol% CO 2 : pK S´= 6,56 – lg (25/15) = 6,338Küv. 2, 10 Vol% CO 2 : pK S´= 7,23 – lg (25/3) = 6,309Küv. 3, 5 Vol% CO 2 : pK S´= 7,61 – lg (25/1,5) = 6,3882.2.4 Aus den Spalten 3a bis 3c der Tabelle 2 sollen die pH-Differenzen angegeben werden:1. vor und nach Zugabe der Milchsäure∆pH = 7,61 – 7,21 = 0,402. vor Zugabe der Milchsäure und nach erneutem Begasen, um diePufferwirkung des offenen Systems zu verdeutlichen.∆pH = 7,61 – 7,53 = 0,08

I - 5MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - VersuchsprotokolleTabelle 2Küvetten-Nummer 1 2 3 4Gasleitung braun grün blau rot blau grünVol.% CO 2 50 10 5 x 5 10[CO 2 ]−[ HCO ]3[ CO ]2−[ HCO ]31og[ CO ]2E 0E max[mM]∆E maxE∆Ea b c a b cE max∆E max∆E max − ∆E∆Ε∆Εmax− ∆Ε1og∆Ε∆Ε − ∆ΕmaxpH = pK * + 1og∆Ε∆Ε max − ∆ΕpK'= pH − 1og−[ HCO ]3[ CO ]2Mittelwert pK' =pK* ≡ pK des p-Nitrophenols = 7,15

I - 6MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - Versuchsprotokolle2.2.5 Berechnen Sie die Pufferkapazität (∆[Pufferbase]/∆pH) des Kohlensäure/Hydrogencarbonat-Puffers(0,2 M = 0,2 mol/l = 0,2 mmol/ml = 0,002 mmol/10 µl;0,002 mmol/ml = 2 mmol/l = 2 mM; ∆[HCO 3 - ] = 2 mMim geschlossenen System: Pufferkapazität: ∆[HCO 3 - ]/∆pH = 2/0,40 = 5 mM/pHim offenen System: Pufferkapazität: ∆[HCO 3 - ]/∆pH = 2/0,08 = 25 mM/pH2.2.6 Die CO 2 -Konzentrationen und pH-Werte der Küvetten 1 bis 3 (ohne Milchsäureversuch)werden graphisch in Diagramm 2 A (nächste Seite) dargestellt.2.2.7 Entsprechend werden die CO 2 -Konzentrationen und die drei pH-Werte der viertenKüvette in Diagramm 2 B eingetragen. Daraus ist die CO 2 -Konzentration in der Küvette4 nach Begasen mit dem unbekannten Gasgemisch zu ermitteln.Vol% CO 2 : 6,9[CO 2 ]: 6,9 · 0,3 = 2,1 mM2.2.8 Mit dem unter 2.2.7 ermittelten Wert soll die Konzentration des Bicarbonats in derKüvette 4 nach Begasen mit dem unbekannten Gasgemisch berechnet werden.lg ([HCO 3 - ]/2,1) = 7,39 – 6,35; [HCO 3 - ] = 23,0 (mM)2.2.9 Welche Störung des Säuren-Basen-Haushalts wird in Küvette 4 simuliert?normal„Patient“pH 7,57-7,61-7,65 7,39[HCO - 3 ] 25 mM 23 mM[CO 2 ] 1,5 mM 2,1 mMDiagnose: respiratorische AzidoseHinweis: Im Modellversuch bei 25 °C beträgt der normale pH (bei 5 Vol% CO 2 ) 7,61(siehe 2.2.2/2.2.3), der Normalbereich entsprechend 7,61 ± 0,04.2.2.10 Warum verläuft die in Diagramm 2 B gezeichnete Linie (Küvette 4) steiler als die inDiagramm 6 A (Küvetten 1-3)?weil wegen der Anwesenheit von Phosphatpuffer in Küvette 4 die Bicarbonatkonzentrationnicht konstant bleibt (wie in den Küvetten 1-3), sondern nachCO 2 + H 2 O + HPO 2- 4 → HCO - -3 + H 2 PO 4ansteigt.Deshalb verläuft die durch-lg [CO 2 ] = (- 1) ⋅ pH + {pK´ + lg [HCO 3 ]}-beschriebene Gerade steiler als wenn [HCO 3 ] wäre.

I - 7MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - VersuchsprotokolleA50 Vol %15,0 mM CO 230 Vol %10,0 mM CO 220 Vol %15 Vol %5,0 mM CO 210 Vol %9 Vol %8 Vol %7 Vol %6 Vol %5 Vol %3,0 mM CO 22,7 mM CO 22,4 mM CO 22,1 mM CO 21,8 mM CO 21,5 mM CO 2BpH pH 6,5 6,5 6,7 6,7 6,9 6,9 7,1 7,1 7,3 7,3 7,5 7,5 7,77,710 Vol %3,0 mM CO 29 Vol %2,7 mM CO 28 Vol %2,4 mM CO 27 Vol %2,1 mM CO 26 Vol %5 Vol %1,8 mM CO 21,5 mM CO 2pH 6,5 6,7 6,9 7,1 7,3 7,5 7,7

I - 8MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - Versuchsprotokolle2.2.11 Berechnen Sie mit Hilfe der Henderson-Hasselbalch’schen Gleichung die Hydrogencarbonat-Konzentrationenin Küvette 4 nach Begasen mit 5 Vol% CO 2 bzw. 10 Vol%CO 2 und daraus die Pufferkapazität des Phosphatpuffers in Küvette 4.5 Vol% CO 2 : [CO 2 ] = 1,5 mM; pH = 7,50;lg [HCO 3 - ]/1,5 = 7,50 – 6,35; [HCO 3 - ] = 21,2 mM10 Vol% CO 2 : [CO 2 ] = 3,0 mM; pH = 7,26;lg [HCO 3 - ]/3,0 = 7,26 – 6,35; [HCO 3 - ] = 24,4 mMPufferkapazität: ∆[Pufferbase]/ ∆pH = - (24,4 – 21,2)/(7,26 – 7,50) = 13,3 (mM/pH)Hinweis: Für jedes entstehende HCO 3 - wird eine Pufferbase HPO 4 2- des Phosphatpuffers"verbraucht" (siehe 2.2.10). Deshalb ist die Pufferkapazität des Phosphatpuffers∆ [HPO 4 2- ] / ∆pH = - ∆ [HCO 3 - ] / pH2.2.12 Für p-Nitrophenolat sollen die Extinktionskoeffizienten bei den Wellenlängen 490 nmund 405 nm berechnet werden. Dazu verwenden Sie den Mittelwert für die ∆E max -Werteaus der Tabelle 1 bzw. für die Küvetten 1 bis 3 aus der Tabelle 2 sowie die zugehörigenp-Nitrophenolat-Konzentrationen; Schichtdicke d = 1,00 cm.490 nm: Extinktionskoeffizient pNP - 490 nm:ε = ∆E max /cc = 0,02 x100/(100 + 2,1) = 0,01959∆E max = 0,457ε = 0,457/0,01959 = 23,3 M -1 cm -1405 nmε = (E max -E o )/ c⋅1 ;Berechnung der Konzentration c: 20 µl 2 mM p-NP-Lösung werden auf 1020 µlverdünnt; c = 2 ⋅ 20/1020 = 2/51 = 0,039 (mM)Beispiel: Mittelwerte Küv. 1-3: (0,709+0,717+0,733) = 0,720ε = 0,720/0,039 = 18,462 (mM -1 cm -1 ) → ε = 18462 (M -1 cm -1 )Sollwert: 18300Küvette 4 (Mittelwert): ε = 0,723/0,039 = 18,538 (mM -1 cm -1 ) → ε = 18538 (M -1 cm -1 )2.2.13 Welche Exktinktion ∆E max erwarten Sie (theoretisch) beim Titrationsversuch (Versuch1) im Extinktionsmaximum (405 nm)? Wäre diese Extinktion direkt messbar?c = 0,02 x100/(100 + 2,1) = 0,01959 (siehe 2.2.12)∆E max = ε · c = 18300 · 0,01959 = 358, 5Nein, niemals: Messbereich 0 - 3,000

I - 9MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - VersuchsprotokolleVersuch 3:Pipettierung mit der Eppendorf-PipetteTabelle 3n Gewicht1 19,64 Pipetten-Nummer: __________2 19,883 20,454 20,225 19,88 Meßtemperatur: __24____6 19,727 20,31 ∑x i = ______8 20,189 19,77 x − = _20,018_____10 20,13o C3.2.1 Die Messwerte sollen in Tabelle 3 eingetragen und der Mittelwert x − berechnet werden.Mittelwert = 20,018 mg3.2.2 Die Standardabweichung (s) als Maß für die Präzision und der Variationskoeffizient V(in %) sollen berechnet werden.s = 0,275; V = (0,275/20,018) ·100 = 1,38 (%)3.2.3 Stellen Sie Ihr Ergebnis in Diagramm 3 (nächste Seite) graphisch dar.3.2.4 Zeichnen Sie in Diagramm 3 zur X-Achse parallele Linien für den Mittelwert, für(Mittelwert ± Standardabweichung) und für (Mittelwert ± 2 x Standardabweichung) ein.

I - 10MeCuM – 1. Studienjahr/2. Halbjahr - SoSe 2004 – PRAKTIKUM DER BIOCHEMIE - VersuchsprotokolleDiagramm 3 (Pipettierübung)Gewicht (mg)23,022,522,021,521,020,520,019,519,018,518,017,517,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Wägung Nr.+ 2s+ sMittelwert- s- 2s3.2.5 Berechnen Sie für das Volumen der Pipette die prozentuale Abweichung (R) desMittelwerts vom Sollwert (Richtigkeit) und geben Sie den Korrekturfaktor f an, mit demder Sollwert multipliziert werden muss, um den Istwert zu erhalten.(Die Dichte des Wassers bei der Temperatur Ihrer Messung sollte berücksichtigt werden.Sie können diese aus einer Graphik bei den Waagen entnehmen. Sie beträgt z.B. bei20 o C: d = 998,2, bei 25 o C: d = 997,1 g/l oder kg/m 3 ).Dichte: 0,9973 g/mlMittelwert (Volumen) = 20,018/0,9973 = 20,07 (µl)Richtigkeit R = 100 · (20,07 – 20,00)/ 20,00 = 0,35 (%)Korrekturfaktor f = 20,07/20,00 = 1,0035