Skript - Mikrobiologie und Weinforschung - Johannes Gutenberg ...

InhaltsverzeichnisSeiteI. Allgemeine Bemerkungen 2II. Sicherheitstechnische Richtlinien 41. KurstagIII. Mikroskopie 61. Phasenkontrastmikroskopie und Morphologie 62. FärbungenMethylenblau-Färbung 8Kapseldarstellung 8Sporen-Färbung 9Volutin-Färbung 10Gram-Färbung 11Fett-Färbung 12Phasenkontrastmikroskop 142. KurstagIV. Wachstum und HemmungNährmedien für Mikroorganismen 161. Nährlösungen 162. Komplett-Nährmedien 18Nährbodengrundlagen-Bezeichnungsvergleich 19Maßnahmen zur Abtötung oder Entfernung vonMikroorganismen 201. Sterilisation 202. Entkeimung durch Keimabtrennung 213. Desinfektion 22Kultur- und Impftechniken zur Vermehrung vonMikroorganismen 23Impftechniken 25Überimpfen von Mikroorganismen aus einemKulturröhrchen in ein anderes mittels Öse 26Verteilen von Mikroorganismen mit Hilfe desDrigalski-Spatels 27Trennung eines Gemisches von Mikroorganismendurch Ausstrich 27Auxanographische Methode 292

KURSANLEITUNGI. ALLGEMEINE BERMERKUNGEN1. InhaltEinführung in mikrobiologische Methoden und einfache qualitative Untersuchungen.2. ZielVermittlung der theoretischen Grundkenntnisse mikrobiologischerArbeitsmethoden und deren praktischer Durchführung.3. LiteraturW. Fritsche: Mikrobiologie, Spektrum-Verlag.H. Cypionka: Grundlagen der Mikrobiologie, Springer-Verlag.K. Munk: Mikrobiologie (Grundstudium Biologie), Spektrum-Verlag.E. Bast: Mikrobiologische Methoden, Spektrum-Verlag.G. Drews: Mikrobiologisches Praktikum, Springer-Verlag.A. Steinbüchel: Mikrobiologisches Praktikum, Springer-Verlag.H. Schröder. Mikrobiologisches Praktikum, Volk und Wissen-Verlag.R. Süßmuth: Biochemisch-mikrobiologisches Praktikum, Thieme-Verlag.R. Näveke: Einführung in die mikrobiologischen Arbeitsmethoden, G.Fischer-Verlag.K.H. Wallhäuser: Praxis der Sterilisation-Desinfektion-Konservierung,Thieme-Verlag.G. Fuchs: Allgemeine Mikrobiologie, Thieme-Verlag.J.G. Cappuccino, N. Shermann, (2011) Microbiology. A Laboratory Manual.Pearson,San Fransico4. Zeit4 Kurstage.14.00 Uhr bis 19.00 Uhr.5. VersuchsanleitungDie Versuchsanleitungen können von der Homepage des Instituts fürMikrobiologie und Weinforschung herunter geladen werden.6. VorbesprechungEs findet eine allgemeine Vorbesprechung und Diskussion in Gruppenstatt, in denen die Hintergründe und Ziele der Versuche an Hand derausgegebenen Versuchsanleitung dargestellt werden. Die Vorbesprechungist wesentlicher Teil des Kurses und ein pünktliches Erscheinen istselbstverständlich Voraussetzung. Die mündlichen Beiträge werdenbewertet und sind ein Kriterium bei der Vergabe des Kursscheines.7. DurchführungAn jedem Kurstag werden mehrere Versuche durchgeführt undvorangegangene ausgewertet. Notwendige Geräte und Materialien findenSie entsprechend der Versuchsanleitung am Arbeitsplatz. Aus Sicherheitsgründenist die Benutzung von Laborkitteln erforderlich. Das Tragen vonoffenem Schuhwerk ist unzulässig.Von jedem Versuchstag ist ein Protokoll anzufertigen. Die Protokolle sindbis zum Ende des Kurses fertig zu stellen. Die einzelnen Gruppen stellenihre Ergebnisse am letzten Kurstag vor.3

Mainz, den:Unterschrift des/ der Kursteilnehmer/ Innen:II.SICHERHEITSTECHNISCHE RICHTLINIEN1. Mäntel, Taschen usw. sind in den Spinden abzulegen.2. Essen, Trinken, Rauchen ist am Arbeitsplatz nicht erlaubt. Das Mitbringenvon Nahrungsmitteln in den Arbeitsraum ist nicht zugelassen.3. Das Tragen eines hochgeschlossenen Baumwollkittels ist erforderlich.4. Das Tragen von offenen Schuhen, sowie das Tragen von O.P.- Schuhenund ähnlichen ohne Riemen ist unzulässig.5. Das Pipettieren mit dem Mund ist nicht zugelassen.6. Das Tragen von Kontaktlinsen ist mit dem Augenarzt abzusprechen.7. Im Einzelfalle informiert der Kursleiter am Kurstag über sicherheitstechnischeMaßnahmen.8. Nach Beendigung der Arbeiten sind die Hände zu waschen.Zeitplan1. Tag: Mikroskopie und Färbemethoden2. Tag: Wachstum und Hemmung3. Tag: Biochemische Tests4. Tag: Auswertung5. Tag: Klausur5

1. KurstagIII. MIKROSKOPIE1. PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE UND MORPHOLOGIEBakterien sind Kleinstlebewesen deren Einzelzellen nur mikroskopischerkennbar sind. Man unterscheidet folgende Zellformen:Stäbchen (kurz, mittel, lang): LactobacillusKokkobacillus: MethanobrevibacterKokken: MicrococcusKokken in Ketten, Diplokokken: StreptococcusKokken in Paketen: SarcinaKokken in Trauben: StaphylococcusSpirillen: SpirillumVibrionen: VibrioSpirochaeten: SpirochaetaMycelbildung: StreptomycetesGestielte Bakterien: PlanctomycesFruchtkörperbildung: MyxococcusUnregelmäßige Formen: ThermoplasmaBakterien werden unter Ölimmersion mikroskopiert. Hierbei ist zu beachten,dass nur Objektive verwendet werden, die für Immersionsöl konstruiert undentsprechend gekennzeichnet sind. Das Immersionsöl wird mit einemTropfen auf das Deckglas gebracht, das Objektiv vorsichtig auf das Objekteingestellt. Nach Abschluss der Untersuchung wird das Objektiv mit einemweichen Papier abgewischt. Immersionsöl ist toxisch, daher ist jederKontakt zu vermeiden.Organismen:Micrococcus luteus, Escherichia coli K12, Rhodospirillum rubrum.Durchführung:Entnahme von Mikroorganismen aus einem Kulturröhrchen für mikroskopischeUntersuchungen.Material: Mikroorganismen-Kultur, Brenner, Impföse, Reagenzglasständer,Objektträger mit Deckgläsern:1. Auf einen Objektträger einen Tropfen Wasser geben. Kulturröhrchen indie linke Hand, Impföse zwischen Daumen, Zeige- und Mittelfinger derrechten Hand nehmen (Schreibhaltung). Öse und unteren Teil desKollehalters ausglühen bzw. abflammen.6

2. Verschluss des Röhrchens, mit dem Handrücken nach unten, zwischenMittel- und Ringfinger der rechten Hand nehmen und entfernen, ohneihn abzulegen. Sofort die Öffnung des waagrecht gehaltenen Röhrchensabflammen. Impföse ohne Randberührung einführen, abkühlen lassenund etwas Zellmaterial entnehmen. Nach Abflammen der Öffnung dasRöhrchen verschließen und wegstellen. Zellmaterial in dem TropfenWasser auf dem Objektträger suspendieren.3. Deckglas auflegen und unter Ölimmersion mikroskopieren. Zeichnunganfertigen.4. Objektträger in ein Gefäß mit Ethanol ablegen, ggf. Objekttisch reinigen.7

2. FÄRBUNGENMethylenblau-FärbungBakterien und Hefen lassen sich am einfachsten durch den basischenAnilinfarbstoff Methylenblau anfärben.Organismus:Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae).Durchführung:1. Etwas Bäckerhefe mit einem Tropfen Wasser auf einem fettfreienObjektträger mit der Impföse verreiben.2. 1-2 Tropfen wässrige Methylenblaulösung auftropfen und mit derImpföse vermischen.3. Methylenblaulösung 2 min wirken lassen.4. Deckglas auflegen und mikroskopieren.Auswertung:Die lebenden Zellen sind nicht gefärbt, die Toten sind blau gefärbt.Reagenzien:Wässrige Methylenblaulösung:0,5 g Methylenblau in 100 ml Ringerlösung lösen.Ringerlösung: 225 mg NaCl, 10 mg KCl, 5 mg NaHCO 3 , 12 mg CaCl 2 in100 ml H 2 Ooder Methylenblaulösung nach Löffler (Fertigpräparat der Fa. Merck).30 ml gesättigte alkoholische Stammlösung von Methylenblau in 100 mlwässrige 0,01%ige KOH geben, zum Gebrauch 1:10 mit dest. Wasserverdünnen, ggf. filtrieren.KapseldarstellungDie Zellwände vieler Bakterien sind mit Kapseln umgeben. Kapseln sindSchleimhüllen, die kein Species-Merkmal und nicht lebensnotwendig sind,jedoch pathogene Keime gegen Phagocytose resistent machen. Bei vielenMikroorganismen kommt es zu einer ausgesprochenen Schleimabsonderung,wenn sie auf Saccharose kultiviert werden. Ein bekanntesBeispiel dafür ist Azotobacter chroococcum, der saccharosehaltigesMedium in kurzer Zeit in Gallerte umwandelt, die aus Dextran besteht. DieUmwandlung der Saccharose erfolgt durch extrazelluläres Enzym.Kapseln werden lichtmikroskopisch durch Negativfärbung nachgewiesen,durch Zusatz eines Farbstoffes (Tusche), der nicht in die Kapsel eindringt.8

Organismus:Azotobacter chroococcum, 48 h auf Kapselmedium kultiviert.Durchführung:1. Einen Tropfen Tusche auf einen fettfreien Objektträger tropfen.2. Unter sterilen Vorsichtsmaßnahmen mit Impföse etwas Material von derSchrägkultur entnehmen und mit Tusche vermischen.3. Deckglas auflegen und unter Ölimmersion mikroskopieren.Auswertung:Die Kapseln erscheinen hell in dunkler Umgebung.Reagenzien:Zeichentusche, 1:3 mit Wasser verdünnt.Kapselmedium:5% Saccharose (steril filtriert)1% Pepton0,5% Hefeextrakt0,5% NaCl0,05% MgSO 40,05% MnSO 40,01% Tween 802% AgarpH 6,2Autoklaviert 20 min bei 120 °CSporen-FärbungMikroorganismen, die zur Familie der Bacillaceae gehören, bildenEndosporen. Sporen sind infolge ihres hohen Lichtbrechungsindexes imMikroskop erkennbar und können im Zweifelsfall durch Färbung sichtbargemacht werden.Organismus:Bacillus sphaericus, 24 h in flüssigem Sporenmedium kultiviert.Durchführung:1. Auf einem fettfreien Objektträger unter sterilen Vorsichtsmaßnahmen miteiner Impföse etwas Bakteriensuspension entnehmen und mit einemzweiten Objektträger zu einem feinen Film ausziehen.2. Auf Färbebank legen und lufttrocknen lassen.3. Hitzefixieren, d.h. 3 Mal durch die obere Flamme ziehen.9

4. Objektträger auf Färbebank legen, mit Malachitgrünlösung bedecken,20 s mit der Flamme bis zur Dampfbildung erhitzen (nicht kochen) undweitere 40 s einwirken lassen.5. Mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche abspülen.6. 5 min mit Safraninlösung gegen färben.7. Mit dest. Wasser abspülen.8. Deckglas auflegen und unter Ölimmersion mikroskopieren.Auswertung:Die Sporen sind grün gefärbt, der Zellinhalt rot.Reagenzien:5 %ige wässrige Malachitgrünlösung.0,5 %ige wässrige Safraninlösung.Sporenmedium:1,0 % Stärke0,3 % Fleischextrakt0,1 % Bacto-Pepton0,2 % KNO 3Volutin-Färbung (Die folgenden Färbungen werden am 2. Tagdurchgeführt)Viele Organismen speichern Phosphorsäure in Form von Polyphosphatgranula.Sie werden nach der Erstbeschreibung an Spirillumvolutans auch Volutin-Granula oder nach der charakteristischen Farbänderungmetachromatische Granula genannt. Volutin wird bevorzugt inälteren Zellen gebildet. Es ist mit basischen Farbstoffen (z.B. Methylenblau)nachweisbar.Organismus:Schizosaccharomyces pombe, 7 Tage auf Sabouraud-Agar kultiviert.Durchführung:1. Einen Tropfen alkoholische Methylenblaulösung auf einen fettfreienObjektträger bringen.2. Unter sterilen Vorsichtsmaßnahmen eine Öse Zellmasse vomSchrägröhrchen mit der Methylenblaulösung vermischen.3. 2-3 min einwirken lassen.10

8. Abgießen, vorsichtig in 96 %igen Ethanol eintauchen, bis keineFarbwolken mehr aufsteigen.9. Mit Wasser nachspülen.10. Mit verdünnter Karbol-Fuchsinlösung 10 s gegen färben.11. Mit Wasser abspülen.12. Deckglas auflegen und unter Ölimmersion mikroskopieren.Auswertung:Micrococcus ist dunkelviolett gefärbt = grampositiv.E.coli ist rot gefärbt = gramnegativ.Reagenzien:Karbol-Gentianaviolett Fertigpräparat der Fa. Merck.Zusammensetzung: 10 ml gesättigte alkoholische Gentianaviolettlösung mit90 ml frisch hergestellter 2,5 %iger wässriger Phenollösung versetzen.Lugol´sche Lösung Fertigpräparat der Fa. Merck.Zusammensetzung: 1 g Jod und 2 g Kaliumjodid zerreiben und in 300 mlWasser lösen.Karbol-Fuchsinlösung Fertigpräparat der Fa. Merck.Zusammensetzung: 10 ml gesättigte alkoholische Fuchsinlösung mit 90 ml5%iger Phenollösung versetzen, 1:10 verdünnen).Standard-I-Nährmedium:(g/l)Spezialpepton 15,6Hefeextrakt 2,8Natriumchlorid 5,6D(+)-Glukose 1,0Agar-Agar 12,0Lipid-FärbungLipide werden in Form von kleinen, stark lichtbrechenden Kügelchen in denZellen von Bakterien (PHB), Hefen (Triglyceride) und anderen Pilzengespeichert. Das Ausmaß der Lipidspeicherung wird durch das Alter derZellen und die Zusammensetzung des Nährmediums bestimmt.Besonders reich an Lipoiden sind z.B. Rhizobium leguminosarum,Mycobacterium tuberculosis und Geotrichum candidum.Der Nachweis von Lipiden erfolgt durch Färbung mit lipidlöslichen Farben,vor allem Diazo- und Polyazo-Farben wie Congorot, Sudan IV undSudanschwarz B. Sudanschwarz B färbt nicht nur Neutralfette, sondernauch Phosphatide.Organismus:12

Pichia jadinii, 7 Tage auf Sabouraud-Agar kultiviert.Durchführung:1. Mit einer Pasteurpipette einen Tropfen Wasser auf einen fettfreienObjektträger tropfen.2. Unter sterilen Vorsichtsmaßnahmen mit der Impföse etwas Material vonder Schrägkultur entnehmen und mit einem zweiten Objektträger zueinem feinen Film ausziehen.3. Präparat lufttrocknen, anschließend Hitze fixieren.4. Objektträger mit Sudanschwarz B – Lösung übergießen und Farbe 15min einwirken lassen.5. Farbe abgießen, mit Filterpapier oder Kleenex abtrocknen, lufttrocknen.6. In Ethyllactat eintauchen, bis keine Farbe mehr abgeht (Pinzettebenutzen).7. Mit Filterpapier trocknen.8. 10 s mit Safraninlösung gegen färben, mit Wasser abspülen.9. Deckglas auflegen und unter Ölimmersion mikroskopieren.Auswertung:Die Lipideinschlüsse sind schwarzblau gefärbt, der Zellinhalt rot.Reagenzien:Sudanschwarz B: 0,3 g in 75 ml 95 %igem Ethanol lösen und mitIonenaustauscherwasser auf 100 ml auffüllen.0,5%ige wässrige Safraninlösung.Sabouraud-Agar:(g/l)Spezialpepton 10,0D(+)-Glukose 20,0Agar-Agar 17,0Phasenkontrastmikroskop13

Das Phasenkontrastmikroskop von Zernike (1934) gestattet lebende Objekte mitHilfe des Mikroskops bei großer Beleuchtungsapertur (d.h. bei hoher Auflösung)kontrastreich abzubilden, ohne sie durch Farbstoffe anzufärben und damit zuverändern.Der Phasenunterschied zwischen dem Licht, das das Objekt durchlaufen hat,gegenüber dem am Objekt vorbeigehenden Untergrundlicht wird dabei zurErzeugung eines Kontrastes ausgenutzt. Man verändert das Untergrundlicht inPhase und Amplitude so, dass es im reellen Zwischenbild das vom Objektveränderte Licht, das zu einem Bild des Objektes gesammelt wird, möglichstauslöscht. Dadurch erscheint das Objekt dunkel auf hellem Grund: „positiverPhasenkontrast“. Man kann das Untergrundlicht auch so verändern, dass dasObjekt hell auf dunklem Grund erscheint: „negativer Phasenkontrast“.Voraussetzung ist, dass irgendwo im Strahlengang das Untergrundlicht getrennt vondem vom Objekt beeinflussten Licht verändert werden kann. Bei der Köhler´schenBeleuchtungsanordnung ist das in der hinteren Brennebene des Objektivs der Fall:dort wird das Untergrundlicht gesammelt (weil es parallel einfällt) und ergibt einstark verkleinertes Bild der Aperturblende des Kondensors und der in dieser Blendeabgebildeten Lichtquelle. Das auf das Objekt treffende Licht ist dagegen nicht mehrparallel, sondern wird vom Objekt gebeugt und gestreut und geht von ihm divergentaus. Deshalb wird es erst weit hinter der Brennebene des Objektivs, nämlich in derEbene des reellen Zwischenbildes, gesammelt und erfüllt in der hinterenBrennebene des Objektivs einen großen Querschnitt. Hier also kann dasUntergrundlicht, das nur einen sehr kleinen Teil der Brennebene ausfüllt (reelles,stark verkleinertes Bild der Kondensor-Aperturblende), verändert werden, ohne dassgleichzeitig das Objektlicht wesentlich beeinflusst wird.Man bringt hier eine Platte aus optisch dichtem Material (Gipskristall in Form undGröße des Bildes der Kondensor-Aperturblende) so an, dass dieses Bild von derPlatte abgedeckt wird. Das Untergrundlicht muss also vollständig diesePhasenplatte durchlaufen. Die Dicke der Platte wird so bemessen, dass die Phasedes Untergrundlichtes beim Durchlaufen dieser Platte um so viel verschoben wird,dass die Differenz zu dem ebenfalls in der Phase verschobenen Objektlichtsmöglichst genau 180° beträgt. Wenn nun außerdem durch Grautönung derPhasenplatte die Amplitude des Untergrundlichtes der des Objektlichtes angepasstwird, löscht es im reellen Zwischenbild das Objektlicht vollständig aus, d.h., dassObjekt erscheint schwarz auf hellem Untergrund. Das kann streng genommen, nurbei einer Wellenlänge des Lichtes erreicht werden.Dicke und Grautönung der Phasenplatte müssten den verschiedenen Dicken undDichten der verschiedenen Objekte jeweils angepasst werden, um eine vollständigeAuslöschung und damit maximalen Kontrast zu erhalten. Zernike hat tatsächlich mitauswechselbaren Platten gearbeitet. Es hat sich aber gezeigt, dass man in derPraxis Dicke und Grautönung der Phasenplatte auf mittlere Werte der in Fragekommenden Objekte abstimmen kann und dann für die meisten Objekte mit einerPlatte auskommt.Eine ringförmige Kondensor-Aperturblende ist für das Phasenkontrastverfahren ausverschiedenen Gründen viel günstiger als eine kreisförmige, die durch die üblicheIrisblende gebildet wird. Ihr Durchmesser wird – je nach Objektiv – so groß wiemöglich gewählt, denn er bestimmt die Beleuchtungsapertur und beeinflusst damitdie Auflösung. Mehrere solcher Ringblenden mit verschiedenen Durchmessern(verschiedenen Objektiven entsprechend) sind im Kondensor auf einerRevolverscheibe angeordnet. In den Phasenkontrastobjektiven sind denRingblenden entsprechende ringförmige Phasenplatten angebracht. Man muss für14

jedes Objektiv jeweils die passende Ringblende im Kondensor einschalten. Beivielen Mikroskopen sind die Objektive mit der Nummer der Ringblende (1,2 oder 3)versehen.Für das Phasenkontrastverfahren sind demnach besondere Objektive (mitPhasenplatte) und ein besonderer Kondensor (mit Ringblende) erforderlich.Phasenkontrastmikroskopie: Strahlengang bei eingestellter KöhlerscherBeleuchtung(Quelle: D. Gerlach, Das Lichtmikroskop)15

2. KurstagIV. WACHSTUM UND HEMMUNGVolutin-Färbungen (Fortführung) s. S. 10.Nährmedien für MikroorganismenZur Kultur von Mikroorganismen werden Nährmedien benötigt. Nährmediensind entweder natürliche Produkte wie z.B. Milch, Fruchtsäfte oder Extrakte,Hydrolysate von Naturprodukten oder künstlich zusammengesetzte Lösungen,deren Bestandteile, Konzentrationen der Bestandteile, pH-Wert undPufferkapazität sich nach den Ansprüchen der einzelnen Organismen oder denjeweiligen Untersuchungen richten.Zum Ansetzen von Submerskulturen werden Nährlösungen, für Oberflächenkulturenin der Regel meist Nährböden angesetzt; wobei man unterNährböden Nährlösungen versteht, denen ein Verfestigungsmittel zugesetztwird.1. Nährlösungen1.1 Natürliche (=komplexe) Substrate wie z.B. Malzextrakt, Peptonwasser,Casein.1.2 Synthetische Nährlösungen, die ausschließlich aus chemisch definiertenSubstanzen bestehen.1.3 Kombinierte Nährlösungen aus chemisch reinen Substanzen mitnatürlichen Zusätzen wie Frucht- und Gemüsesäfte.1.4 Erläuterungen:1.4.1 Extrakte: Unter Erhitzung gewonnene wässrige Auszüge,die zu Pulver eingedampft werden.Fleischextrakt:Hefeextrakt:Malzextrakt:Gewinnung aus enzymatisch verdautem Fleisch,enthält Polypeptide, die nicht mehr koagulierbarsind sowie Aminosäuren.Gewinnung aus autolysierter Bierhefe; enthältAminosäuren, hoher Gehalt an Vitaminen der B-Gruppe.Gewinnung aus Gerstenmalz; enthält hohenGehalt an Kohlenhydraten, besonders an Maltose.16

1.4.2 Peptone: Gewinnung aus niedermolekularen Eiweißen ausnativem Eiweiß auf enzymatischem Weg. Je nachAusgangsprotein und verwendetem Enzym besitztdas Pepton eine charakteristische Zusammensetzung.Pepton aus Casein: Gewinnung durch Aufschluss von Casein durchTrypsinEigenschaften: frei von vergärbaren Kohlenhydraten,hoher Tryptophangehalt.Pepton:Pepton aus Sojabohnenmehl:(z.B. Tryptone, Handelsname).Gewinnung aus Fleisch, tryptisch verdaut.Gewinnung aus Fleisch, peptisch verdaut.Gewinnung aus entfettetem Sojabohnenmehl,papainisch verdaut.Eigenschaften: hoher Gehalt an Kohlenhydratenund Vitaminen, besonders Thiamin1.4.3 Hydrolysate: Gewinnung von niedermolekularen Eiweißen ausnativem Eiweiß auf anorganischem Weg.Caseinhydrolysat:Gewinnung aus Casein durch SäurehydrolyseEigenschaften: Leicht reduzierter Gehalt anStickstoff und Aminosäuren durch Säurehydrolyse,äußerst geringer Vitamingehalt, daher geeignetesNährbodensubstrat für Vitamin B 12 – Untersuchungen.Caseinhydrolysat vitaminfrei enthält keine Vitamine oder Wuchsstoffe.1.4.4 Mischpeptone:Proteose-Peptone:Tryptose:Gewinnung aus Pepton, papainisch verdaut.Mischpepton mit hohem Anteil an tryptischaufgeschlossenen Proteinen.1.4.5 Substanzen für synthetische Nährmedien:C-Quelle (z.B. Glucose, Acetat).N-Quelle (z.B. Ammoniumsalze).S-Quelle (H 2 S, Cystein, SO 4 2- ).Anorganische Salze, Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Vitamine).1.5 Verfestigungsmittel zur Herstellung von Nährböden1.5.1 Agar-AgarGewinnung: aus Rotalgen.17

Chemische Zusammensetzung: Polysaccharid.Verhalten einer ca. 1,5%igen Lösung:Schmelzen: 95-100 °C (Sol).Festwerden: 35-45 °C (stabiles Gel).Sterilisation: bis 135 °C, meist 121 °C 20 min.Schädigungen: Verliert bei mehrmaligem Verflüssigen sehr gering dieGelierfähigkeit, Nährböden mit einem pH-Wert

2.3 Malzextrakt-Agar (für Hefen und Pilze):3% Malzextrakt.0,3 % Pepton aus Sojamehl.1,5 % Agar-Agar.Sterilisation 20 min bei 121 °C.2.4 Hefeextrakt-Pepton-Agar (für Hefen und Pilze):1% Hefeextrakt.2% Pepton aus Fleisch.2% Glucose.0,1% KH 2 PO 4 .1,3% Agar-Agar.Sterilisation 20 min bei 121 °C.Nährbodengrundlagen-BezeichnungsvergleichDIFCO OXOID MERCKYeast extract Yeast extract HefeextraktBeef extract Beef extract FleischextraktMalt extract Malt extract MalzextraktPeptone Peptone P Pepton aus Fleisch, peptisch= Fleischpepton PTryptone Tryptone Pepton aus Casein, tryptisch= CaseinpeptonTryptose Peptone Bacteriological Pepton aus Fleisch, tryptisch= FleischpeptonCasitone --- Caseinhydrolysat, pankreatischCasamino acid Caseinhydrolysat (acid) Caseinhydrolysat, säurehydrolysiertCasamino acid, vitamin free --- Caseinhydrolysat, säurehydrolysiert,vitaminfreiProteosepeptone Proteosepeptone ProteosepeptonNeopeptone Tryptose TryptoseLiteraturangabe: Merck: „Nährböden für die Mikrobiologie“; Bezeichnungsvergleich.19

Maßnahmen zur Abtötung oder Entfernung von MikroorganismenJe nach Anwendungsbereich werden folgende Begriffe benutzt:Sterilisation, Tyndallisation, Pasteurisieren, Kurzzeiterhitzen, Hocherhitzen, Entkeimung,Desinfektion.Wenn im Folgenden die wichtigsten Sterilisationsmethoden beschrieben werden, sobedeutet das keineswegs, dass bei deren Anwendung in jedem Fall eine absoluteKeimfreiheit erreicht wird. Die Methode richtet sich stets nach den Bedingungen, dieman an den Versuch stellt. Für viele Zwecke genügt eine Teilentkeimung, z.B. dieAbtötung der vegetativen Zellen.1. Sterilisation:Definition: Sterilisation heißt Abtötung oder Inaktivierung der Organismendurch Heißluft, feuchte Hitze, Bestrahlung und chemische Mittel.1.1 Das Abflammen ist die häufigste Schnellsterilisationsmethode für Impfösen,Pinzetten u.ä..1.2 Heißluftsterilisation:Die Sterilisation durch trockene Heißluft wird für hitzeunempfindlicheGegenstände wie Glas angewendet. Die Gefäße werden mit Alufolie o.ä.verschlossen. Um eine Reinfektion zu verhindern, werden Pipetten inPipettenbüchsen sterilisiert. Minimale Sterilisationszeit: 60 min bei 180 °C.1.3 Sterilisation durch feuchte Hitze:Sterilisation durch feuchte Hitze wird für Nährlösungen, Textilien u.ä.angewendet. Sie kann im strömenden, gesättigten, luftfreien Wasserdampferfolgen oder im geschlossenen System unter Druck, wenn die Temperatur überdem Siedepunkt liegen soll.Die vegetativen Zellen von Bakterien und Pilzen werden bei einerTemperatur von 60 °C innerhalb von 5-10 min abgetötet. Sporen dagegenbei 120 °C (2 bar) innerhalb von 20 min.1.3.1 Fraktionierte Sterilisation (Tyndallisation)Definition: Tyndallisation heißt fraktioniertes Erhitzen an drei aufeinanderfolgenden Tagen je 30 min bei 100 °C. In der Zwischenzeit werden dieLösungen bebrütet. Eventuell vorhandene Sporen keimen aus und werdenbeim darauf folgenden Erhitzen abgetötet. Diese Methode kann für Substrate(z.B. Nährmedien) angewendet werden, in denen Sporen auskeimen können.Teilentkeimung durch Hitze:1.3.2 Pasteurisieren: 5-10 min bei 75 °C.1.3.3 Kurzzeiterhitzen: 20 s bei 71-74 °C.1.3.4 Hocherhitzen: 2-5 s bei 85-87 °C.20

1.4 Entkeimung durch ionisierende Strahlung:UV-Strahlung wird in der Regel zur Entkeimung von Räumen verwendet.1.5 Chemische Mittel:Für die Sterilisation von Einmalartikeln ist Begasung mit Äthylenoxid in einemGemisch aus Stickstoff und CO 2 anwendbar. (Allerdings problematisch:Umweltbelastung).2. Entkeimung durch Keimabtrennung:Definition: Die Entkeimung durch Keimabtrennung erfolgt durch Ober- oderUnterdruckfiltration. Dabei werden alle Organismen (lebende und tote) einerbestimmten Größe abgetrennt. Die Abtrennung ist abhängig von derFilterbeschaffenheit.Man unterscheidet:2.1 Filter mit Siebeffekt (Membranfilter, Glasfritten).2.2 Filter mit Sieb- und Absorptionseffekt (Asbestfilter, Kiesel- u. Kohlefilter).2.2.1 Siebfilter: Siebfilter bestehen im Wesentlichen aus homogenem Material, dasgeometrisch angeordnet ist. Die Porengröße ist definiert.Vorteile: Geringe Ablösung von Filtermaterial in das Medium, Organismenbleiben an der Oberfläche. Material chemisch inert. Konzentrierenvon Mikroorganismen. Membranfilter können auf Nährbödengelegt oder verascht oder durchsichtig gemacht werden.Nachteile: Die Abscheidungen bleiben an der Oberfläche hängen, daher verstopfendie Filter verhältnismäßig schnell (Druckverluste müssenin Kauf genommen werden). Die mechanische Belastbarkeit istgering (zerreißen).2.2.2 Tiefenfilter: (Mit Sieb- u. Absorptionseffekt) bestehen aus kompakten Schichtenoder Geweben mit unregelmäßig gelagertem Material. Die Flüssigkeitdurchdringt in verschiedenen Richtungen das Filter, wobei kleineTeilchen hauptsächlich durch Absorption zurückgehalten werden. DerWirkungsgrad solcher Filter ist abhängig von der Fasergröße, derOberflächenbeschaffenheit, der Dicke und Polarität der einzelnenFasern, Tiefenfilter haben keine definierte Porengröße.Vorteile: Tiefenfilter entfernen eine große Menge von Einzelteilchen, sieverstopfen langsam. Tiefenfilter sind gegen mechanischeBelastungen sehr stabil.Nachteile: Keine definierte Porengröße, infolge des inhomogenenFiltermaterials kann eine Materialauswanderung in das Filtratstattfinden, z.B. von Asbestfasern.Tiefenfilter sind mit Siebfiltern kombinierbar.21

3. Desinfektion:Definition: Desinfektion heißt Ausschaltung aller pathogenen Keime, auchsporenbildende Formen. Die meisten Desinfektionsmittel erzielen eineTeildesinfektion.22

Reagenzgläser werden für die Kultivierung von Mikroorganismen mit Wattestopfenverschlossen. Die Stopfen dürfen nicht nass werden, da sonst der Gasaustauschbehindert würde und eine Infektionsquelle entstehen würde. Sofern dem Nährmediumein Verfestigungsmittel (Agar-Agar) zugesetzt ist, unterscheidet man zwischenHochschicht- und Schrägagarröhrchen.Größere Volumina von Flüssigkeitskulturen aerober Mikroorganismen werden inErlenmeyerkolben, Steilbrustflaschen und in Fernbachkolben angelegt.abErlenmeyer-Kolben mit Schikanen24

ImpftechnikenIn der Mikrobiologie versteht man unter Impfen die Übertragung lebenderMikroorganismen auf oder in ein Nährmedium. Dazu bedient man sich verschiedenerImpfgeräte. Mit der Impföse werden vorwiegend Agarnährböden und kleinere Mengenflüssiger Nährmedien beimpft. Die Impföse besteht aus einem 5-6 cm langen Draht ausPlatin-Iridium oder einer hitzebeständigen Stahllegierung, der in einem Halter(Kollehalter) montiert ist. Der Draht ist am vorderen zu einem Ring gebogen, der jenach Durchmesser und Drahtdicke verschiedene Mengen an Zellmasse aufnehmenkann.Der Drigalski-Spatel dient der gleichmäßigen Verteilung von einer Mikroorganismensuspensionauf einer festen Nährbodenoberfläche.Definierte Mengen von Mikroorganismensuspensionen und Verdünnungsmedienwerden mit sterilen Pipetten aufgezogen und übertragen.25

Überimpfen von Mikroorganismen aus einem Kulturröhrchen in einanderes mittels ÖseMaterial: Schrägagarkultur, frisches Schrägagarröhrchen, Brenner, Impföse,Reagenzglasständer.Beide Röhrchen in die linke Hand nehmen. Öse und unteren Teil des Kollehaltersausglühen bzw. abflammen. Die beiden Röhrchenverschlüsse mit dem 3. Und 4. Bzw.dem 4. Und 5. Finger nacheinander entfernen und in der Hand behalten. Öffnungen derbeiden Röhrchen abflammen. Mit der abgekühlten Öse Impfmaterial entnehmen undauf der Nährbodenfläche des anderen Röhrchens in Schlangenlinie ausstreichen.Öffnungen abflammen und Röhrchen verschließen. Öse ausglühen und Halterwegstellen. Das beimpfte Röhrchen beschriften.26

Verteilen von Mikroorganismen mit Hilfe des Drigalski-SpatelsMaterial: Mikroorganismensuspension, Agarplatte mit trockener Oberfläche, Gefäß mit70 %igem Alkohohl, Gefäß mit Desinfektionslösung für gebrauchte Pipetten, sterilePipette, Pipettierball, Glasspatel, Brenner.Röhrchen mit der Suspension in die linke Hand, die Pipette in die rechte Hand nehmen.Mit dem 3. Und 4. Finger der rechten Hand den Verschluss des Röhrchens entfernen.Öffnung des Röhrchens kurz abflammen. Pipette in das Gefäß einführen undSuspension aufziehen. Röhrchen abflammen, verschließen und wegstellen. Mit derlinken Hand Deckel der Petrischale anheben und 0,1 ml Suspension auf die Agarflächetropfen. Pipette in das Gefäß mit der Desinfektionslösung stellen. Glasspatel in Alkoholtauchen und diesen durch Anzünden am Bunsenbrenner abbrennen lassen. Mit demsterilisierten abgekühlten Glasspatel die aufgetragene Suspension sorgfältigausstreichen. Dabei die Platte fortwährend drehen und den Spatel in radialen Bahnenhin- und herschieben. Glasspatel in Alkohol stellen, Platte verschließen und beschriften.Trennung eines Gemisches von Mikroorganismen durch Ausstrich (jederTeilnehmer)Für mikrobiologisches Arbeiten ist es häufig erforderlich Reinkulturen herzustellen;Reinkulturen sind aus einer einzelnen Zelle durch vielfache Vermehrunghervorgegangen. Eine einfache Methode zur Gewinnung von Reinkulturen ist derAusstrich.In diesem Versuch soll durch Ausstrich eine Trennung von zwei verschiedenen Hefen(Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra) erreicht werden, die in einerSuspension vorliegen.1. Die vorher über der Bunsenbrennerflamme ausgeglühte Impföse wird in dieaufgeschüttelte Hefesuspension getaucht und dann auf der Oberfläche derHefeextrakt-Pepton-Agarplatte (Vorsicht, nicht einstechen!) einmal entlanggestrichen, siehe Abbildung. Dabei wird der Deckel der Petrischale möglichstwenig geöffnet.2. Danach wird die Impföse kurz in der Flamme des Bunsenbrennersausgeglüht.3. Entsprechend der Abbildung wird, nachdem sich die Öse nach demAuftupfen auf den Agar abgekühlt hat, mit der ausgeglühten Impföse einzweites Mal auf der Agaroberfläche entlang gestrichen, wobei der ersteStrich gekreuzt werden muss. Danach wird die Impföse wieder ausgeglüht.Es ist ratsam, jeweils mehrere parallele Impfstriche auf der Agaroberflächezu machen.4. In entsprechender Weise wird noch zweimal verfahren, wobei jedes Maldie Öse nach dem Ausstreichen ausgeglüht wird.5. Die weiteren Hefeextrakt-Pepton-Agarplatten werden ebenso behandelt undanschließend 2 Tage bei 25 °C bebrütet.27

Die Petrischale wird am Boden mit einem Filzschreiber in drei Teile eingeteilt. Im Feld 1wird zuerst ausgestrichen. Dann wir die Impföse ausgeglüht, im Agar abgekühlt, eineProbe von dem Ende des Ausstriches im Feld 1 entnommen und im Feld 2 wiederausgestrichen. Im Feld 3 sollten Sie nach einem erneuten Ausstrich dann Einzelkolonienerhalten.Schema des AusstrichesAuswertungNach der Bebrütung werden die Hefeextrakt-Pepton-Agarplatten betrachtet. Entlangdem ersten Strich entwickelt sich eine Hefekolonie. Auch der zweite Strich ist häufignoch deutlich als gleichmäßige Kolonie zu erkennen. Diese Kolonie ist dadurchentstanden, dass beim Überstreichen des ersten Striches Hefezellen von der Ösemitgenommen worden sind, die sich auf der Spur des zweiten Striches entwickelthaben. Die folgenden Striche bestehen aus einzelnen punktförmigen weißen undrötlichen Kolonien. Diese Kolonien sind mit großer Wahrscheinlichkeit aus einzelnenHefezellen hervorgegangen. Zur Herstellung von Reinkulturen von Mikroorganismenwird dieses Verfahren mehrmals wiederholt, indem an Stelle der Hefesuspensionjeweils Zellmaterial von einzelnen Kolonien für die weiteren Ausstrichplatten verwendetwird. Außerdem ist natürlich eine mikroskopische Kontrolle erforderlich.Nachweis der Wirkung von Hemmstoffen auf das Wachstum von MikroorganismenViele Stoffe verhindern das Wachstum von Mikroorganismen. Der Wirkungsmechanismusist teilweise unspezifisch oder wenig bekannt. Bei vielen Hemmstoffen bestehenjedoch Vorstellungen über die Wirkungsweise.28

Wirkungsweise und Beispiele für antimikrobiell wirksame Mittel:I. Zerstörung oder Veränderung der Zellstruktura) Zerstörung wichtiger Zellbestandteile (z.B. Eiweißdenaturierung durch Alkohol).b) Zerstörung der Zellwand (z.B. durch Lysozym).c) Störung der Funktion der Cytoplasmamembran z.B. durch Phenol und Kresole,kationische Detergentien (z.B. Cetylpyridiniumchlorid), anionische Detergentien(z.B. Seife, Natriumtetradecylsulfat), Antibiotica (z.B. Polymyxin E), mancheFarbstoffe usw.d) Verbindungen von Nukleinsäuren z.B. mit basischen Farbstoffen wie Akriflavin,Gentianaviolett.II. Störung des Energiestoffwechselsa) Reaktion mit Proteinen und Enzymaktivierung durch Schwermetalle.b) Reaktion mit der prosthetischen Gruppe von Enzymen z.B. Cyanid.c) Competitive Hemmung durch CO.d) Verhinderung der oxidativen Phosphorylierung z.B. durch 2,4-Dinitrophenol.III. Störung von Biosynthese und Wachstuma) Verhinderung der normalen Proteinsynthese z.B. durch Aminosäureanaloge wie5-Methyltryptophan, p-Fluorphenylalanin.b) Verhinderung der normalen Nukleinsäuresynthese z.B. durch Purin- undPyrimidinanaloge wie 6-Mercaptopurin, 5-Bromuracil, Mitomycin C (einAntibiotikum, das die DNS-Synthese stört).c) Hemmung der Coenzymsynthese z.B. durch Sulfanilamid.d) Hemmung der Zellwandsynthese z.B. durch Penicillin.Um die Wirkung einer Substanz auf das Wachstum von Mikroorganismen zuprüfen, wird für die qualitative Untersuchung die auxanographische Methode, fürdie quantitative Untersuchung die Hemmstoff-Verdünnungsreihe angewendet. DasPrinzip beider Methoden kann in vielfacher Hinsicht variiert werden.Hemmung des Bakterienwachstums (1x pro Gruppe)a) Qualitativer vergleichender Test zur Bestimmung des Resistenzspektrumsverschiedener Bakterien und eine Hefe:Die Testkeime werden ausgestrichen. Sterile 8 x 1,5 cm große sterileFilterpapierstreifen werden mit 0,2 ml 5 % Streptomycin-Lösung (Eppendorf-Pipette) befeuchtet, mit steriler Pinzette (mit Alkohol abflammen!) senkrecht zuden ausgestrichenen Mikroorganismen auf eine Standard-I-Platte gelegt.Testkeime:Bacillus sphaericusMicrococcus luteusEscherichia coli K12Saccharomyces cerevisiae29

) Plattendiffusionstest:Mit einer sterilen Pipette werden jeweils 0,1 ml einer Bakteriensuspension aufeine Petrischale mit Standar-I-Agar getropft. Ein glasspatel wird kurz in 70%Ethanol getaucht und durch die Bunsenflamme gezogen. Dann wird nachAbkühlen mit dem Glasspatel die Bakteriensuspension gleichmäßig auf derAgaroberfläche verteilt.Vier sterile Filterplättchen (0.6 cm) werden in möglichst großem Abstandvoneinander auf dem erstarrten Keimschichtagar verteilt und leicht angedrückt.In die Mitte wird das Filterblättchen mit der unbekannten Konzentrationgegeben. Jeweils 5 µl der Antibiotikaverdünnungen werden mit einerEppendorf-Pipette auf die Plättchen aufgetragen.Es sind folgende Verdünnungen der Antibiotikum-Lösung herzustellen:Penicillin: Stammlösung: 1600 I.E./ml (mg Penicillin = 1660 I.E.).Konzentrationen: 0.02; 0.04; 0.08; 0.16 I.E. pro 5 µl. Zuerst wird eine 1 : 50Verdünnung, dann 1 : 2 Verdünnungen hergestellt (1 x pro Tisch). DieFilterblättchen werden mit einemBleistift beschriftet.Testkeim: Micrococcus luteusAuswertung a:Die Größen der Hemmzonen werden bestimmt.Auswertung b:Der Durchmesser (mm) der Hemmhöfe ist gegen den Logarithmus derAntibiotikakonzentration (µg/ml) aufzutragen. Die Penicillinkonzentration einerTestlösung (E) ist zu bestimmt. Bleistift, halblogarithmisches Millimeterpapierund Lineal sind mitzubringen.30