Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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5 Anwendung der Methode<br />
(pH 7-9.2) liegt. Wie die Fotos in Abb. 5.5 (obere Reihe) zeigen, konnten jetzt<br />
optimale Ergebnisse erzielt werden. Sowohl das Harz, welches das positive<br />
Kontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 a) als auch das biotinylierte Harz (Abb. 5.5 b) sind<br />
gleichmäßig von einem tiefschwarzvioletten „Lack“ überzogen. Das Harz welches<br />
das Negativkontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 c), sowie das unbeladene TentaGel-Harz<br />
(Abb. 5.5 d) sind hingegen farblos.<br />
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86<br />
Abb. 5.6 Das Screening. A) Vorbereitung der OBOC-Cyclopeptidbibliothek. B) Strept-<br />
avidinbindung. C) Auslösung der Farbreaktion.<br />
Das Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 erfolgte nach den oben<br />
beschriebenen optimierten Bedingungen (Abschnitt 5.3.1). Hierzu wurden zunächst<br />
durch Zugabe von TFA/TIS/Wasser alle säurelabilen Schutzgruppen entfernt.<br />
Daraufhin wurde das Peptidylharz ausführlich mit Wasser und PBS-Puffer<br />
gewaschen. Das Harz wird dabei auf pH 7,4 eingestellt. In diesem Bereich liegt der<br />
pI-Wert des Streptavidins. Das heißt, hier ist das Protein in der Gesamtladung<br />
neutral und somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf<br />
Erkennung zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen<br />
Harzkugeln und Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Komplex (SA-AP-Komplex) zu<br />
vermeiden, wurden die Harzkugeln über Nacht durch Inkubation mit Gelatine<br />
geblockt. Nach gründlichem Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween + 0.1%<br />
Gelatine) erfolgte dann eine dreistündige Inkubation mit SA-AP Konjugat, die<br />
eigentliche Rezeptor-Ligand Screening-„Reaktion“. Anschließend wurden nicht<br />
gebundene SA-AP-Komplexe durch Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween)<br />
entfernt. Zur Aktivierung der Alkalischen Phosphatase erfolgt nun eine pH-<br />
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