Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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5 Anwendung der Methode<br />
Abb. 5.5: Mikroskopausschnitte während der Optimierung des Screenings.<br />
Die erste Reihe zeigt optimale Bedingungen (Versuch 5): a) Positivkontroll-<br />
peptid, b) Biotin, c) Negativkontrollpeptid, d) TentaGel.<br />
Die untere Reihe zeigt: e) Positivkontrollpeptid mit altem SA-AP-Konjugat<br />
(Versuch 4), f) Biotin mit altem SA-AP-Konjugat (Versuch 4), g) Negativ-<br />
kontrollpeptid mit zu wenigen Waschschritten (Versuch 2), h) Positivkontroll-<br />
peptid mit zu geringer SA-AP-Konjugatkonzentration.<br />
Beim genaueren Betrachten der Kugeln unter dem Stereomikroskop fiel auf, dass die<br />
beiden Positivkontrollen mit einem hellvioletten Niederschlag überzogen waren;<br />
erwartet wurde jedoch ein tiefviolettschwarzer Überzug. Ein möglicher Grund dafür<br />
könnte eine zu kurze Reaktionszeit der Farbreaktion sein. Desweiteren fielen bei<br />
beiden Negativkontrollen lokale Ablagerungen auf den Kugeln auf, was auf<br />
unspezifische Bindungen hinweisen könnte (Abb. 5.5 Bild g). Diese sollten durch<br />
eine Erhöhung der Waschschritte nach der Inkubation mit SA-AP-Konjugat behoben<br />
werden können. Folglich wurde im dritten Versuch die Farbreaktionszeit auf<br />
30 Minuten erhöht und die Waschschritte nach der SA-AP-Konjugatinkubation je<br />
fünfzehnmal wiederholt. Die lokalen Ablagerungen bei beiden Negativkontrollen<br />
wurden mit der Erhöhung der Waschschritte behoben. Die Anfärbung der<br />
Positivkontrolle nahm zu, war aber immer noch nicht zufriedenstellend. Ein weiterer<br />
Grund für eine nicht optimal verlaufende Farbreaktion könnte der pH-Wert während<br />
der enzymkatalysierten Reaktion sein. Im Versuch 4 wurde deshalb der pH-Wert auf<br />
9,5 erhöht. Dies erbrachte jedoch keine Verbesserung. Im fünften Versuch wurde<br />
neu gekauftes SA-AP-Konjugat verwendet. Der pH-Wert des TBS-Puffers wurde auf<br />
pH 9.0 gesenkt, da ein pH-Wert von 9,5 über der Grenze des Pufferbereichs<br />
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