Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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5 Anwendung der Methode<br />
Tabelle 6 Übersicht der Versuchsbedingungen zur Optimierung des enzymkatalysierten<br />
Farbreaktionstests. Die wichtigen Unterschiede in den Bedingungen sind fett<br />
hervorgehoben.<br />
Zweck Puffer Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5<br />
Waschen<br />
Wasser 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min<br />
PBS 1x10 min<br />
4x1 min<br />
2x5 min<br />
7x1 min<br />
2x5 min<br />
4x 1min<br />
2x5 min<br />
4x1 min<br />
2x5 min<br />
4x1 min<br />
Blocken 0,1% Gelatine Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht<br />
Waschen<br />
(pH 7,4)<br />
0,1% Tween in<br />
PBS<br />
*: 0,1% Tween,<br />
0,1% Gelatine<br />
in PBS<br />
4x1 min<br />
1x15 min<br />
Anlagern SA-AP in * 2,5 h<br />
Waschen 0,1% Tween in<br />
PBS<br />
6x1 min 1x15 min<br />
4x1 min<br />
1x15 min<br />
4x1 min<br />
1x15 min<br />
4x1 min<br />
5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min<br />
0,1 µg/ml<br />
Umpuffern TBS 2x3 min<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
neu gekauft<br />
10x1 min 9x1 min 15x1 min 15x1 min 15x1min<br />
8x1 min<br />
pH 8,0<br />
8x1 min<br />
1x5 min<br />
pH 8,0<br />
15x1 min<br />
pH 8,0<br />
15x1 min<br />
pH 9,5<br />
15x1 min<br />
pH 9,0<br />
Farbreaktion BCIP/NBT 1 h 5 min 30 min 30 min 30 min<br />
quenchen 0,1 M HCl 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min<br />
Im ersten Versuch erfolgte die Inkubation mit einer Streptavidin/Alkalische-<br />
Phosphatase-Konjugat (SA-AP-Konjugat)-Lösung der Konzentration 0,1 µg/ml.<br />
Selbst nach 1h Farbreaktionszeit war jedoch keine Anfärbung der Kugeln zu<br />
beobachten (Abb. 5.5 Bild h). Daraufhin wurde im zweiten Versuch die SA-AP-<br />
Konjugatkonzentration auf 1 µg/ml erhöht. Bereits nach 5 Minuten konnte eine<br />
deutliche Anfärbung der Harzkugeln in beiden Positivkontrollen beobachtet werden.<br />
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