Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

5.3 Das Screening
5 Anwendung der Methode
Für den Nachweis der synthetisierten Bibliothek auf biologische Aktivität (Rezeptor-
Ligand-Erkennung) wurde ein Enzym-verknüpfter Farbreaktionstest [122] durchgeführt.
Abb. 5.3: Durchführung eines on-bead-assays mit Rezeptor-Protein/Alkalische
Phosphatase- Konjugat.
Der Ligand ist bei diesem sogenannten on-bead-assay kovalent an die feste Phase
gebunden. Die Umgebung muss zunächst den idealen Bindungsbedingungen des
Rezeptors angepasst werden. Beispielsweise sollte der pH-Wert dem pI-Wert des
Rezeptors entsprechen. Das heißt, die Gesamtladung des Rezeptors ist neutral,
somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf Erkennung
zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen Harzkugeln und
Rezeptor zu vermeiden, wird die feste Phase beispielsweise mit BSA, Gelatine oder
Milchpulver geblockt. Nun sind die Harzkugeln für die eigentliche Ligand-Rezeptor-
Erkennung vorbereitet, die Inkubation mit dem Rezeptor kann durchgeführt werden.
Nach ausführlichem Wegwaschen des ungebundenen Rezeptors erfolgt eine
Änderung des pH-Wertes zur Aktivierung des am Rezeptor konjugierten Enzyms.
Dieses Enzym agiert in der anschließenden Farbreaktion als Katalysator. Bei der
Farbreaktion (Abb. 5.4) fungiert die Alkalische Phosphatase als Katalysator bei der
Hydrolyse von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) 87 zu 5-Brom-4-
chlorindoxyl 88. Das entstandene Indoxyl fällt nach anschließender Oxidation (durch
Luftsauerstoff bzw. NBT) als tiefblauer Indigo-Farbstoff 89 aus. Nitroblau-
Tetrazoliumchlorid (NBT) 90 wird durch Reduktion zunächst zum roten
Formazanfarbstoff, der durch eine weitere Reduktion zum blauen
Di-Formazanfarbstoff 91 wird und ebenfalls ausfällt. Die beiden ausgefallenen Farb-
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