Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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5 Anwendung der Methode<br />
So wurde beispielsweise in der Röntgenstrukturanalyse von Strep-tag I eine<br />
Salzbrücke zwischen GlyGly-OH (C-terminus Strep-tag) und Arg 84 (Streptavidin)<br />
nachgewiesen. Der Einsatz von Glutaminsäure in zweiter Position Richtung<br />
C-Terminus nach HPQ sollte diese Salzbrücke nachahmen können. [115] In beiden<br />
Strep-tag-Sequenzen folgt C-terminal zum HPQ-Motiv ein Phenylalanin und N-<br />
terminal zwei Positionen vor HPQ ein Tryptophan. Dies sollte auch in der Bibliothek<br />
berücksichtigt werden. Außerdem wurde neben Phenylalanin auch noch<br />
Thienylalanin eingesetzt, welches als unnatürliche Aminosäure Phenylalanin<br />
ersetzen kann. [121] Es wurden sechs variable Positionen mit zweimal sieben, einmal<br />
acht und zweimal fünf möglichen Aminosäuren erzeugt. Daraus ergibt sich eine<br />
Mitgliederzahl von 9800 (=5x5x8x7x7) für diese Bibliothek.<br />
Zum Aufbau der OBOC-Cyclopeptidbibliothek wurden 2 g aminofunktionalisiertes<br />
TentaGel (130 µm/ ca. 1,5 Mio. Kugeln) mit Methionin versehen. Mit Standard-Fmoc-<br />
Chemie wurde manuell die Massenspacerpeptidsequenz (βAPPRM-TG) aufgebaut.<br />
Nach Anknüpfung der geschützten Glutaminsäure erfolgte die Synthese der<br />
variablen Bibliothekspeptide nach dem Protokoll der Split-Mix-Synthese. Die<br />
Anknüpfung von Boc-Lys(Alloc)-OH stellte den letzten Schritt im Aufbau der<br />
Peptidkette dar. Die Syntheseeffizienz wurde durch UV-Messung aller Fmoc-<br />
Entschützungsschritte verfolgt. Von der nun vorliegenden Vorläuferbibliothek aus<br />
linearen Peptiden wurden die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen entfernt. Daran<br />
anschließend erfolgte die Cyclisierung der Peptidbibliothek bis im Kaiser-Test und<br />
TNBS-Test keine freien Amine mehr nachzuweisen waren. Die Entschützung der<br />
säurelabilen Schutzgruppen mit TFA/TIS/Wasser erfolgte immer unmittelbar vor dem<br />
Einsatz im biologischen Test. Zur Lagerung wurde die mit Peptidylharz bestückte<br />
Einwegspritze in einem mit Argon gefluteten Schraubdeckelglas im Kühlschrank<br />
aufbewahrt. Da es zu unerwarteten Problemen bei der post-Screening Peptidsequen-<br />
zierung kam, wurde eine identische Bibliothek nochmals auf größeren Harzkugeln<br />
synthetisiert (TentaGel MB300 / 280-320 µm / 65500 Kugeln pro Gramm).<br />
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