Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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4 Analytik<br />
Unsere Wahl für den Linker fiel auf Methionin. (Die Verwendung von Methionin als<br />
Sollbruchstelle wurde in Abschnitt 3.2 ausführlich beschrieben und diskutiert). Auch<br />
in diesem Peptid wurde die bereits erwähnte Massenspacersequenz -βAla-Pro-Pro-<br />
Arg- eingebaut. Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 75 erfolgte nach<br />
Standard-Fmoc-SPPS-Bedingungen am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf<br />
wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach<br />
Abspaltung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe erfolgte die Seitenkettencyclisierung<br />
nach Aktivierung mit PyBOP. Mit der abschließenden Testabspaltung wurde das<br />
Peptid charakterisiert.<br />
Mit dem nun vorliegenden Cyclopeptid 77 wurden erste partielle Edman-Abbau-<br />
Experimente durchgeführt. Zunächst wurde mit einer größeren Menge Harz (2 mg,<br />
ca. 1.600 Harzkugeln) begonnen, um eventuelle Probleme der Nachweisempfindlich-<br />
keit zu umgehen. Im ersten Schritt erfolgte die Abspaltung der noch am Peptid<br />
vorhandenen säurelabilen Schutzgruppen (Boc und Pbf) durch eine ausführliche<br />
TFA-Behandlung der Harzkugeln. Daraufhin wurde das Harz ausgiebig mit<br />
Dichlormethan, Acetonitril und Wasser gewaschen. Das anschließende Waschen der<br />
Kugeln mit Pyridin sowie einer Mischung aus gleichen Teilen Pyridin, Wasser und<br />
0,1% Triethylamin garantierte einen unprotonierten N-Terminus. Nur wenn am<br />
N-Terminus ein freies Elektronenpaar vorliegt, kann der nucleophile Angriff an das<br />
Edman-Reagenz (PITC) erfolgen. Für die Kupplung wurde zum Harz eine unmittelbar<br />
vor dem Gebrauch hergestellte Lösung von PITC und FmocOSu in Pyridin (ca. 30:1)<br />
aufgezogen. Das festphasengebundene Peptid lag nun also als Phenylthiocarbamat-<br />
Derivat bzw. mit Fmoc gecappt vor. Der Kupplung folgten einige Waschschritte mit<br />
Pyridin, Acetonitril und Dichlormethan zum Entfernen der überschüssigen<br />
Reagenzien. Durch Behandlung des Peptidylharzes mit TFA erfolgte die Abspaltung<br />
der N-terminalen Aminosäure, so dass ein „neuer“ freier N-Terminus vorliegt. Beim<br />
ersten Abbauschritt, der Ringöffnung, verbleibt das N-terminale Aminosäurederivat<br />
über die Seitenkettenverbrückung im Molekül erhalten. Bei den darauffolgenden<br />
Zyklen wurde die jeweils entstehende Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure aus dem<br />
Molekül gespalten und anschließend weggewaschen. Durch Waschen der Harz-<br />
kugeln und Einstellen basischer Bedingungen begann ein neuer Abbauzyklus.<br />
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