Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
4 Analytik<br />
des intakten Peptidions (in Abb. 4.5 unten) verdeutlicht diese Tatsache. Sieht man<br />
von der Fragmentierung der Pbf-Schutzgruppe und der Aminofunktion am C-<br />
Terminus ab, ist das Mutterion (intaktes Peptid) im Wesentlichen nur an einer Stelle<br />
gebrochen, nämlich N-terminal zu Prolin. Die weitere Fragmentierung dieses Ions<br />
(MS(3)-Spektrum) ergab zwar Informationen über die Sequenz, jedoch handelt es<br />
sich dabei um Signale mit einer Intensität von 0,4-19% (Tabelle 4). Die Information<br />
wurde also mehr gesucht als gefunden. Hiermit sind wir an einer Schwachstelle der<br />
De-novo-Sequenzierung angelangt.<br />
Eine ideale Dissoziationsmethode sollte die Bindungen des Peptidrückgrats wahllos<br />
brechen, unabhängig von Peptidlänge, Ladung, m/z-Verhältnis, sterischer Anord-<br />
nung, Aminosäurenzusammensetzung und –abfolge. Eine solche Methode existiert<br />
jedoch nicht. [80] Während der stoßinduzierten Fragmentierung (CID) wird dem<br />
Mutterion in sehr kurzer Zeit (Pico- bis Mikrosekunden) Energie zugeführt, was zum<br />
Bruch der schwächsten Bindung im Molekül führt. Diese schwächste Bindung ist eine<br />
protonierte Amidbindung. Innerhalb eines Peptids besitzen Amidstickstoffe jedoch<br />
unterschiedliche pKb-Werte; somit unterscheiden sie sich in ihrer Labilität und<br />
verhalten sich nicht ideal. [81] Die N-terminale Seite von Prolin gilt als äußerst labile<br />
Stelle. Diese Beobachtung wird in der Literatur als Prolin-Effekt bezeichnet [82] . Hier<br />
führt nicht, wie früher angenommen, die Protonenaffinität von Prolin zur<br />
Fragmentierung, sondern die sterische Instabilität der Prolin-Bindung. [83-85] Es<br />
existiert eine Vielzahl von zum Teil kontrovers diskutierten massenspektrometrischer<br />
Fragementierungsmechanismen, einige davon wurden von Zhang [81] zusammen-<br />
getragen.<br />
Ein weiterer kritischer Punkt ist die Probenkonzentration und -menge. Alle in der<br />
Arbeit durchgeführten De-novo-Sequenzierungsexperimente erfolgten nach einer<br />
Testabspaltung vom Harz. Hierzu wurde das Peptid von 0,5-10 mg Harz, was in etwa<br />
400-8000 Harzkugeln entspricht, abgespalten und anschließend in 50-100 µl<br />
Lösungsmittel aufgenommen. Bei einem kombinatorischen Ansatz stünde jedoch nur<br />
eine einzige Harzkugel zur Verfügung. Zur erfolgreichen Durchführung der MS(n)-<br />
Experimente am für diese Arbeit zur Verfügung stehenden Massenspektrometer<br />
(Esquire3000 plus ohne Nanoquelle) werden ca. 50 µl Probenlösung benötigt. Dies<br />
würde einer 3 µM-Lösung entsprechen, was unter der Nachweisgrenze des Geräts<br />
liegt.<br />
54