Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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3 Sollbruchstellen<br />
Zur Erstellung der Eichgeraden wurden pro Harz zwei definierte Mengen<br />
Peptidylharz eingewogen, abgespalten und anschließend pro Einwaage eine<br />
Peptidlösung erstellt. Daraus wurden HPLC-Läufe mit 25, 30 und 50 µl<br />
Injektionsvolumen durchgeführt. Dabei wurde angenommen, dass beide Linker<br />
während der säureinduzierten Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen stabil sind<br />
und dass die abschließende Spaltung des Peptids vom Harz quantitativ verläuft.<br />
Beim näheren Betrachten der Eichgeraden (Abb. 3.22) fällt auf, dass die ermittelten<br />
Werte, die aus derselben Lösung, aber unterschiedlichen Injektionsvolumina<br />
entstanden sind, sehr gut auf einer Gerade liegen. Zwischen den verschiedenen<br />
Lösungen gibt es jedoch deutliche Unterschiede, vor allem im Fall der beiden<br />
Glycolamidester-Harz Datenreihen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass der Fehler<br />
nicht bei der HPLC-Anlage (Präzision der Probeninjektion, Ermittlung der<br />
Peakfläche), sondern bereits zuvor gesucht werden muss. Hier gibt es viele mögliche<br />
Fehlerquellen, wie das ungenaue Einwiegen (verursacht zum Beispiel durch fehlende<br />
Wägepräzision und/oder statische Aufladung), eine nicht hundertprozentig<br />
reproduzierbare Abspaltreaktion und die anschließende Probenpräparation<br />
(Löslichkeit, Pipettieren). Da das Ziel eine Abschätzung der Linkerstabilität bei<br />
verschiedenen Reaktionsbedingungen war, liegen die Messwerte dennoch in einem<br />
verwertbaren Rahmen. Aus den erhaltenen Werten kann abgelesen werden, ob die<br />
Behandlung mit den getesteten Bedingungen problematisch ist. In Folge dessen<br />
kann abgeschätzt werden, ob mit einem Verlust des Peptids von der festen Phase zu<br />
rechnen ist.<br />
Der Blick in Tabelle 2 zeigt, dass beide Linker nicht die gewünschte Stabilität<br />
besitzen. Der größte Verlust des Peptids vom Harz wurde in beiden Fällen bei der<br />
Behandlung mit TBS-Puffer beobachtet. Während eines typsichen Screenings-<br />
prozesses findet unter diesen Bedingungen üblicherweise eine durch AP-katalysierte<br />
enzymatische Anfärbereaktion zum Visualisieren der Rezeptor-Ligand-<br />
Bindungsreaktion statt. Um dieses Problem zu umgehen, könnte man statt eines AP-<br />
Konjugats ein Peroxidase-Konjugat verwenden, wodurch die Änderung des pH-<br />
Wertes ins Alkalische überflüssig werden würde. Neben der Instabilität bei TBS-<br />
Puffer, weisen beide Linker eine Labilität gegenüber TFA auf. Im Einzelnen<br />
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