Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Die SPR-Messungen erfolgten an einem Biacore T100 Gerät (Biacore, Uppsala,<br />
Schweden) unter Verwendung eines CM5-Sensorchips (ebenfalls von Biacore). Alle<br />
Messungen erfolgten bei 25°C. Die Streptavidin-Immobilisierung erfolgte mittels<br />
EDC/NHS-Aktivierung unter Verwendung der oben beschriebenen Lösungen analog<br />
der im Handbuch [126] beschriebenen Vorgehensweise. Die Flussrate betrug<br />
10 µl/min. Zur Immobilisierung des Liganden wurde eine Injektionszeit von 900<br />
Sekunden gewählt. Zusätzlich zur Messzelle wurde eine Referenzzelle hergestellt.<br />
Diese wurde analog der Bindungsmesszelle beladen, jedoch ohne Injektion des<br />
Liganden. Nach erfolgreicher Streptavidin-Immobilisierung wurden mit einer<br />
Flussrate von 40 µl/min und einer Injektionszeit von 90 Sekunden die<br />
Verdünnungsreihen (0,3-700 µM bzw. 0,01-10 mM) der einzelnen Peptide<br />
vermessen. Nach jeder Peptidinjektion erfolgte eine Regeneration der Oberfläche<br />
durch Behandlung mit HBS-N Puffer für 300 Sekunden bei einer Flussrate von 40<br />
µl/min. Zur Auswertung wurde das zum Gerät gehörende Programm Biacore T100<br />
Evaluation Software (Version 1.1) verwendet. Bei allen herangezogenen Daten<br />
handelt es sich um Differenzmesswerte (Signal der Referenzzelle subtrahiert vom<br />
Signal der Bindungsmesszelle). Die erhaltenen Sensorgramme wurden durch<br />
Anwendung der steady-state-affinity ausgewertet.<br />
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