Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Die positiv getesteten violetten Harzkugeln (Hitbeads) wurden mit einer Glaskapillare<br />
separiert und in einer 2 ml–Spritze mit PE-Fritte vereinigt (der PED erfolgte für alle<br />
Hitbeads gemeinsam). Zum Abstreifen des Streptavidin-Alkalische Phosphatase-<br />
Konjugats wurden die Kugeln 1x5 min und 4x1 min mit 6 M Guanidin-HCl Lösung<br />
(pH 1,0) behandelt. Anschließend wurde je 5x1 min mit Wasser und Acetonitril<br />
gewaschen und am Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Zum Waschen und pH-Wert-<br />
Einstellen wurden die Kugeln der Reihe nach mit DCM (3x1 min), Acetonitril (3x1<br />
min), Wasser (3x1 min), Pyridin (3x1 min) und 0,1% Triethylamin in Pyridin/Wasser<br />
(2:1) behandelt. 480 µl FmocOSu-Lösung (5,4 mg in 480 µl Pyridin / 0,03 M) und<br />
54 µl Phenylisothiocyanat (0,45 mmol) wurden unmittelbar vor Gebrauch gemischt,<br />
zum vorbehandelten Harz aufgezogen und 8 min reagieren lassen. Daraufhin wurde<br />
je 3x1 min mit Pyridin, Acetonitril und DCM gewaschen. Nach saurer Spaltung mit<br />
TFA (1x1 min und 2x6 min) erfolgte ein erneuter Durchgang des PED. Die PED-<br />
Zyklen wurden (n+1) mal wiederholt, wobei n die Anzahl der zu sequenzierenden<br />
Aminosäuren darstellt. Beim letzten PED-Durchlauf wurde nach der sauren Spaltung<br />
mit TFA je 3x1 min mit DCM, Pyridin und DCM gewaschen. Mit 20% Piperidin in DMF<br />
(1x1 min, 3x5 min) wurde das Fmoc-Capping aufgehoben und 10x1 min mit DMF<br />
und 5x1 min mit DCM gewaschen. Für die MALDI-TOF Analyse wurden die Kugeln<br />
nun in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in jeden Cap immer<br />
nur eine Kugel sein durfte (unter der Stereolupe überprüfen). Nach einem kurzen<br />
spindown in der Zentrifuge wurden je 10 µl Bromcyan-Lösung (40 mg BrCN in 1 ml<br />
70% TFA aq.) hinzugefügt und über Nacht einwirken lassen. Nach Trocknen am<br />
Vakuum wurde das vom Harz abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in<br />
Wasser/Acetonitril (1:2)) aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl<br />
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)<br />
wurden auf dem MALDI target gemischt.<br />
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