Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8 Experimenteller Teil
8.5.3 Enzymgekoppelter Farbreaktionstest
Kontrollversuche
Jeweils 10 mg (ca. 7800 Kugeln) TentaGel S-NH2 (neg. Kontrolle), sowie an
TentaGel gebundene Peptide [as231 pos und as232 neg] und Biotin (pos. Kontrolle)
wurden in jeweils einer 5 ml-Spritze mit PE-Fritte eingewogen. Falls nicht anders
beschrieben, wurde das Harz 2x5 min und 4x1 min mit PBS und anschließend 5x1
min mit Wasser gewaschen. Zum Blocken von unspezifischen Bindungen wurden die
Harzkugeln über Nacht mit 0,1% Gelatine (w/v) in Wasser behandelt. Das Harz
wurde anschließend 1x15 min und 4x1 min mit 0,1% Tween in PBS und 4x1min mit
0,1% Tween, 0,1% Gelatine in PBS gewaschen. Nun folgte eine 3.5 h Inkubation mit
der Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lösung. Das nicht gebundene
überschüssige SA-AP Konjugat wurde mit 0,1% Tween in PBS (15x1 min) weg-
gewaschen. Anschließend wurde das Harz mit TBS umgepuffert (15x1 min).
Daraufhin wurden die Harzkugeln mit Färbelösung versetzt. Nach 30 min wurde die
enzymatische Reaktion durch Zugabe von 0,1 N HCl gestoppt. Schließlich wurden
die Harzkugeln 5x1 min mit Wasser gewaschen, in Petrischalen überführt und unter
dem Mikroskop betrachtet.
Screening der Bibliothek 86
In einer 5 ml-Spritze mit PE-Fritte wurden 195 mg (ca. 12.700 Harzkugeln) der
festphasengebundenen Bibliothek eingewogen. Nach Entfernen der säurelabilen
Schutzgruppen wurde das Harz ausführlich mit Wasser und PBS gewaschen und
schließlich wie im voran stehenden Abschnitt (Kontrollversuche) beschrieben
behandelt. Die Identifizierung der Hitsequenzen wird im nachfolgenden Abschnitt
beschrieben.
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