Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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Gelatine Blocking-Puffer<br />
8 Experimenteller Teil<br />
10 mg Gelatine wurden in einem Messzylinder eingewogen und in 8 ml Wasser auf<br />
einem Wasserbad 10 min gerührt. Anschließend wurde mit Wasser auf 10 ml<br />
aufgefüllt. Die Lösung wurde für jedes Screening frisch hergestellt.<br />
Färbelösung<br />
Zum Anfärben der Harzkugeln wurde eine BCIP/NBT-Färbetablette in 10 ml Wasser<br />
aufgelöst und die entstandene Lösung direkt eingesetzt.<br />
Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat<br />
Das gekaufte Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lyophilisat (1mg) wurde<br />
in 1 ml Wasser gelöst, in 20 aliquoten Teilen auf Caps verteilt und lyophilisiert. Die<br />
gewünschte Verdünnung (1:10000 bzw. 1:1000 bezogen auf 1 mg/ml) wurde<br />
unmittelbar vor den Versuchen durch Verdünnung mit 0,1% Tween, 0,1% Gelatine in<br />
PBS-Puffer hergestellt und nicht verwendete Lösungen wurden verworfen.<br />
Guanidinium-Lösung<br />
57,32 g Guanidinium*HCl (6 M) wurden in 80 ml Wasser gelöst und mit 1N HCl auf<br />
pH 1,0 eingestellt. Anschließend wurde mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.<br />
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2<br />
200 mg TentaGel (130 µm, 0.32 mmol/g, 64 µmol) wurden in einer 5 ml-Spritze mit<br />
PE-Fritte eingewogen und mit 3 ml DMF 10 min quellen lassen. 4 eq. Biotin-N-<br />
Hydroxysuccinimidoester (Biotin-NHS) (87,4 mg, 256 µmol) und 8 eq. DIPEA (87,6<br />
µl, 512 µmol) wurden in 2 ml DMF gelöst, zum Harz aufgezogen und 4 h gekuppelt.<br />
Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit Kaiser- und TNBS-Test (siehe AAV 4)<br />
überprüft. Nach dem Waschen mit DMF (5x1 min) erfolgte ein Capping mit<br />
Essigsäureanhydrid (10% in DMF). Nach erneutem Waschen mit DMF (10x1 min)<br />
und DCM (5x1 min) wurde das Harz im Ölpumpenvakuum getrocknet.<br />
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