Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8 Experimenteller Teil
8.3.10.2 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids
SRBS-pY241
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen
(Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der
ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM
spezial.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen
(Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid
(Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc)
wurde die automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden
verwendet: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-
His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Met-OH.
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
Fmoc -Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (111→)
MALDI-TOF-MS: 1082,4 m/z
Berechnet: C48H68N13O12S2 + (exacte 1082,4546 m/z)
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Tyr[PO(OBzl)OH]-OH (5 eq.)
unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA. angeknüpft. Es
wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen. Auch die Anknüpfung der nächsten
Aminosäure (Fmoc-Ile-OH) erfolgte wie eben beschrieben manuell.
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.
Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschreiben vorgegangen.
Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-
Asp(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc) und Fmoc-
Thr(tBu)-OH.
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.
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