Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8 Experimenteller Teil
8.3.8.1 Tryptischer Verdau an der festen Phase
Eine Einwegspritze mit PE-Fritte wurde mit etwa 5 mg Harz as152 (cyclisch ohne
PGs) bestückt. Zum Einstellen des pH-Wertes wurde das Harz einmal 20 min und
fünfmal 2 min mit Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 8, 50 mM) gewaschen.
1,46 mg Trypsin wurden in 500 µl Puffer gelöst (0,124 mM), zum Harz aufgezogen
und über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag wurde siebenmal je eine Minute mit
Puffer und sechsmal je eine Minute mit Methanol gewaschen. Zum Abspalten des
Peptids vom Harz wurde nach AAV 14 vorgegangen.
8.3.8.2 Tryptischer Verdau in Lösung
1 mg des vollständig entschützten cyclischen Peptids wurde in 150 µl Ammonium-
hydrogencarbonat-Puffer (pH 8, 50 mM) gelöst, so dass eine 5,2 mM Lösung
entstand. 0,3 mg Trypsin wurden in 200 µl Puffer gelöst, so dass eine 0,064 mM
Lösung entstand. Nun wurden 10 µl der Trypsinlösung zur Peptidlösung pipettiert.
Anschließend wurden 10 µl dieser Lösung in die Trypsinlösung pipettiert. Somit
wurden zwei Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Trypsin und Peptid
erhalten. Nach sieben Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von Methanol
(ca. 3 Tropfen) gestoppt und die Lösung anschließend lyophilisiert.
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