Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8 Experimenteller Teil
und zweimal je 2 Minuten mit Wasser gewaschen. Die vereinigte Abspalt- und
Waschlösung wird am Stickstoff-Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Trockne
eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen (eventuell zuerst einige
Tropfen Acetonitril zum Lösen), mit flüssigem Stickstoff ausgefroren und lyophilisiert.
AAV 18 Peptidabspaltung vom Arylhydrazid-Harz
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze
mit PE-Fritte eingewogen und mit DCM quellen lassen. Es werden je 2 eq (bezogen
auf das Harz) einer äquimolaren Lösung aus NBS und Pyridin in DCM (0,017 M) zum
Harz gegeben und 10 Minuten damit behandelt. Anschließend wird das Harz mit
DCM gewaschen (10x1 min). Daraufhin werden 5 eq. des Nucleophils (am besten 4-
Bromanilin) in DCM gelöst, so dass sich eine 0,03 M Lösung ergab. Das Harz wird
über Nacht damit behandelt. Anschließend wird je viermal für 1 Minute mit DCM,
Acetonitril und Methanol gewaschen. Die vereinigte Abspalt- und Waschlösung
werden am Vakuum eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
AAV 19 Peptidabspaltung vom RinkAmid-Harz
Die Abspaltung des Peptids verläuft simultan mit der Abspaltung der säurelabilen
Schutzgruppen.
Testabspaltung für anschließende MALDI-TOF Analyse
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (1 ml) überführt und mit 100% TFA behandelt.
Nach ca. 20 Minuten wird die Lösung unter Stickstoffgegenstrom eingeengt.
Anschließend erfolgt ein kurzer spindown in der Zentrifuge. Zum Rückstand werden
5 µl 0,1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:1) addiert, um das vom Harz abgespaltene
Peptid aufzunehmen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl Matrixlösung (gesättigte α-
Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:1)) werden auf dem
MALDI-target gemischt und können nach Kristallisation analysiert werden.
Abspaltung von mehreren Harzkugeln
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze
mit PE-Fritte eingewogen. Das Harz wird für drei Stunden mit einer Lösung aus
TFA/TIS/Wasser (95:2.5:2.5) (0.5 ml für 100 mg Harz) geschüttelt. Die Lösung wird
dann in das 10-15 fache Volumen eiskalten tert-Butylmethylether getropft, wobei das
Peptid ausfällt. Man behandelt das Harz noch ein weiteres Mal mit der Abspaltlösung
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