Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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8 Experimenteller Teil<br />
und lässt über Nacht einwirken. Nach Trocknen am Vakuum wird das vom Harz<br />
abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:2))<br />
aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl Matrixlösung (gesättigte α-Cyano-<br />
4-hydroxyzimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)) werden auf dem MALDI-Target<br />
gemischt und können nach Kristallisation analysiert werden.<br />
Abspaltung von mehreren Harzkugeln<br />
In einer Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wird die gewünschte Menge Harz<br />
eingewogen, die wie oben beschrieben hergestellte Bromcyan-Lösung wird<br />
aufgezogen und wirkt über Nacht ein. Das in der Lösung enthaltene abgespaltene<br />
Peptid wird aus der Spritze gedrückt. Das Harz wird noch zweimal mit 70% TFA in<br />
Wasser nachgespült. Im Stickstoff-Gegenstrom wird die TFA abgedampft. Der<br />
Rückstand wird in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das so erhaltene Peptid<br />
kann anschließend mittels RP-HPLC aufgereinigt und charakterisiert werden.<br />
AAV 15 BNPS-Skatol / Trp–Xaa Spaltung<br />
Unmittelbar vor Gebrauch werden 1,3 mg BNPS in 1 ml Essigsäure (88% aq.) gelöst.<br />
Trp-Xaa Spaltung: Sollbruchstelle im cyclischen Peptid<br />
Zur selektiven Spaltung der Trp-Xaa Bindung (also C-terminal von Trp) wird das<br />
Peptidylharz (ohne Seitenkettenschutzgruppen) mit zuvor frisch zubereiteter BNPS-<br />
Lösung (2,8 eq. in Bezug auf die zu spaltende Trp-Xaa Bindung) behandelt. Danach<br />
wird das Harz dreimal mit 88% Essigsäure, einmal mit Methanol und zehnmal mit<br />
DCM gewaschen. Anschließend wird das Harz am Vakuum getrocknet.<br />
Trp-TG Spaltung: Linker<br />
Das Vorgehen der Reaktion erfolgt analog zur Trp-Xaa Spaltung. Nur wird hier die<br />
BNPS-Lösung, die das abgespaltene Peptid enthält, aufbewahrt. Das Harz wird<br />
viermal mit 88% Essigsäure und zweimal mit Methanol gewaschen. Die<br />
Waschlösung wird mit der BNPS-Peptidlösung vereint. Anschließend wird das<br />
Volumen durch Zugabe von Wasser verdoppelt und lyophilisiert. Das so erhaltene<br />
Lyophilisat wird erneut in Wasser aufgenommen und nochmals lyophilisiert. Das<br />
Peptid kann nun mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert werden.<br />
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