Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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5 Anwendung der Methode<br />
Die Immobilisierung des Streptavidins auf dem Chip erfolgte nach dem von Biacore<br />
empfohlenen Standardprotokoll [126] durch Aktivierung der Carboxylgruppe auf der<br />
Dextranoberfläche mit N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und<br />
N-Hydroxysuccinimid (NHS). Durch die Aktivierung bildet sich ein Aktivester, der<br />
dann mit primären Aminofunktionen des Streptavidins (ε-Aminofunktion der Lysin-<br />
seitenkette) reagieren kann (Abb. 5.13). Nach der Belegung der Oberfläche mit<br />
Streptavidin wurden noch aktive Carboxylfunktionen durch Injektion von Ethanolamin<br />
gecappt. Eine der vier Messzellen des CM5-Chips wurde als Referenzzelle<br />
verwendet. Ihre Behandlung erfolgte analog zur Messzelle, jedoch ohne Streptavidin-<br />
injektion.<br />
Die Bindungsstudien erfolgten mit den oben beschriebenen Peptiden (93/92, 97/96,<br />
95/94). Zunächst wurden die Messungen mit Peptidlösungen in einem<br />
Konzentrationsbereich von 0,33-677 µM im Falle der linearen bzw. 0,36-731 µM im<br />
Falle der cyclischen Peptide durchgeführt. Die Lösungen wurden als 1:1 Verdün-<br />
nungsreihe hergestellt. Zur Regenerierung der Chipoberfläche musste lediglich mit<br />
Laufpuffer gespült werden. Die Auswertung erfolgte als Differenzmessung, hierfür<br />
wurde das Signal der Referenzzelle vom Signal der eigentlichen Bindungsmesszelle<br />
subtrahiert. Somit kann sichergestellt werden, dass ausschließlich die tatsächlich<br />
auftretende Interaktion zwischen Streptavidin (Ligand) und Peptid (Analyt) untersucht<br />
wird. Die erhalten Sensorgramme wurden durch Anwendung der Steady-State-<br />
Affinity-Methode mit der Herstellersoftware ausgewertet.<br />
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