Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz
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Neue Methoden zur Sequenzierung<br />
festphasengebundener<br />
Cyclopeptide<br />
Dissertation<br />
zur Erlangung des akademischen Grades<br />
eines Doktors der Naturwissenschaften<br />
an der <strong>Universität</strong> <strong>Konstanz</strong><br />
vorgelegt von<br />
<strong>Angelika</strong> <strong>Semmler</strong><br />
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion<br />
Fachbereich Chemie<br />
<strong>Universität</strong> <strong>Konstanz</strong><br />
Oktober 2009
Dissertation der <strong>Universität</strong> <strong>Konstanz</strong><br />
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2009<br />
1. Referent: Prof. Dr. Valentin Wittmann<br />
2. Referent: Prof. Dr. Dr. h. c. Michael Przybylski<br />
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Gerhard Müller
meinem Großvater Albert Anton Höfert
Vorwort<br />
Vorwort<br />
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von September 2005 bis Oktober 2009 in<br />
der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann im Fachbereich Chemie der<br />
<strong>Universität</strong> <strong>Konstanz</strong>.<br />
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann für die Überlassung des<br />
sehr interessanten und herausfordernden Themas und die freundliche Aufnahme in<br />
die Arbeitsgruppe, sowie für das in mich gesetzte Vertrauen.<br />
Herrn Prof. Dr. Michael Przybylski danke ich für die Übernahme des Zweitgut-<br />
achtens.<br />
Da wissenschaftliche Arbeit immer auch Diskussion, Kooperation und gegenseitige<br />
Unterstützung bedeutet, möchte ich mich bei einigen Menschen bedanken:<br />
Dominik Wöll für hilfreiche Diskussionen bei den Photolyse-Experimenten, Diana<br />
Klingler für gemeinsame Gehversuche und manche spannende Stunde am LC-MS,<br />
Markus Wieland und Astrid Joachimi für Unterstützung bei den SPR-Experimenten<br />
und Anke Friemel für die Aufnahme der NMR-Spektren.<br />
Ein besonderer Dank gebührt allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der<br />
Arbeitsgruppen Wittmann und Möller für eine wirklich tolle gemeinsame Zeit.<br />
Besonders hervorheben möchte ich meine Laborkolleginnen Claudia Meßmer und<br />
Mônica Boldt, mit denen so manch bitterer Labortag doch noch süß wurde. Für das<br />
Suchen und Finden von Fehlern im Manuskript möchte ich mich bei Anja Meißner,<br />
Henning Beckmann, Dominik Gauß und Christian Risinger bedanken. Außerdem<br />
möchte ich Dominik „Dömi“ Gauß für die gemeinsame Peptidos-Zeit danken. Der<br />
Laborerstbesetzung Frank Sicherl, Franklin John, Marco Worch, Caroline Maierhofer<br />
und Daniel Specker danke ich für die herzliche Aufnahme und viele lustige Grillfeste.<br />
Für den gemeinsamen Weg vom ersten Tag an der Uni <strong>Konstanz</strong> bis zum letzten,<br />
danke ich Magnus Schmidt und Henning Beckmann.<br />
I
Vorwort<br />
Natürlich gibt es ein Leben außerhalb des Labors. Auch da war Christian immer für<br />
mich da, ich danke Dir. Außerdem möchte ich meiner Familie und vor allem meiner<br />
Mutter Resi danken, die immer an mich geglaubt hat. Für die Möglichkeit zum<br />
Abschalten und Auspowern danke ich dem Masters-Team des RV Neptun; vor allem<br />
meinen Mädels vom Doppelvierer (Anja, Conny und Claudia) danke ich für viele<br />
gemeinsame Kilometer bei jedem Wetter.<br />
II
Inhaltsverzeichnis<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
ABKÜRZUNGEN VII<br />
1 EINLEITUNG 1<br />
1.1 Cyclische Peptide – Was ist ihr Nutzen? 1<br />
1.2 Cyclopeptidbibliotheken 4<br />
1.3 Die Problematik der Analytik 6<br />
1.3.1 Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus OBOC-Bibliotheken 6<br />
1.3.2 Sonderfall cyclische Peptide 8<br />
1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray 10<br />
2 AUFGABENSTELLUNG 13<br />
2.1 Analytik von Cyclopeptiden 13<br />
2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden 14<br />
3 SOLLBRUCHSTELLEN 15<br />
3.1 Photolabile Sollbruchstelle 15<br />
3.2 Methionin als Sollbruchstelle 26<br />
3.2.1 Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle 30<br />
3.3 Tryptophan als Sollbruchstelle 40<br />
3.4 Enzymatische Sollbruchstelle 44<br />
3.5 Ringöffnung durch Edman-Abbau 46<br />
III
Inhaltsverzeichnis<br />
4 ANALYTIK 47<br />
4.1 De-novo-Sequenzierung 47<br />
4.1.1 Massenspektrometrische Untersuchung der Bibliothek von cyclischen Peptiden mit photolabiler<br />
Sollbruchstelle 50<br />
4.1.2 Massenspektrometrische Untersuchung nach Anwendung der Met-Sollbruchstelle 51<br />
4.2 Partieller Edman-Abbau (PED) 56<br />
4.2.1 Die Mikrosequenzierung – der klassische Edman-Abbau 56<br />
4.2.2 Partieller Edman-Abbau (PED) – die Leitersequenzierung 58<br />
4.2.3 Erweiterung des PEDs auf OBOC-Cyclopeptidbibliotheken 59<br />
5 ANWENDUNG DER METHODE 71<br />
5.1 Streptavidin: Ein biologisches Modelltarget 71<br />
5.2 Aufbau einer OBOC-Cyclopeptidbibliothek 75<br />
5.3 Das Screening 77<br />
5.3.1 Etablierung des Screenings 78<br />
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 81<br />
5.4 Die Hitbead-Peptidsequenzen 83<br />
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten 86<br />
5.5.1 Synthese der ausgesuchten Peptidsequenzen 87<br />
5.5.2 SPR-Experimente 88<br />
6 SYNTHESE FLUORESZENZMARKIERTER PHOSPHOPEPTIDE 95<br />
6.1 Darstellung von Phosphopeptiden 95<br />
6.2 Auswahl des Fluoreszenzlabels 98<br />
6.3 Synthese der beiden Peptide Y241 und pY241 99<br />
6.4 Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230 102<br />
IV
Inhaltsverzeichnis<br />
7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 109<br />
7.1 Analytik von Cyclopeptiden 109<br />
7.2 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide 114<br />
8 EXPERIMENTELLER TEIL 117<br />
8.1 Allgemeine Angaben zur Analytik 117<br />
8.1.1 HPLC 117<br />
8.1.2 Massenspektrometrie 117<br />
8.1.3 Kernresonanzspektroskopie 118<br />
8.1.4 Infrarotspektroskopie 119<br />
8.1.5 UV-Vis-Absorptionsspektroskopie 119<br />
8.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften für die SPPS 120<br />
8.3 Synthetisierte Peptide 131<br />
8.3.1 Synthese der photolabilen cyclischen Peptide 8-12 131<br />
8.3.2 Synthese des cyclischen Peptids 31 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle 134<br />
8.3.3 Synthese des cyclischen Peptids 41 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle 136<br />
8.3.4 Synthese des Peptids 51/52 zur Stabilitätsuntersuchung des Glykolamid-Linkers und des HMBA-<br />
Linkers 138<br />
8.3.5 Synthese des festphasengebundenen Peptids 63 zur Untersuchung der Trp-Xaa Sollbruchstelle 140<br />
8.3.6 Synthese des festphasengebundenen Peptids 66 zur Untersuchung von Trp als Linker 141<br />
8.3.7 Synthese des festphasengebundenen Peptids 77 als Modellpeptid zur Etablierung des Partiellen<br />
Edman-Abbaus (PED) 142<br />
8.3.8 Synthese des Peptids 71 zur Untersuchung einer enzymatischen Ringöffnung 143<br />
8.3.9 Synthese der Peptide (92-97) zur Bestimmung der KD-Werte 147<br />
8.3.10 Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide 150<br />
8.4 Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im PED 156<br />
8.4.1 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Val) 81 156<br />
8.4.2 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-hydantoin 82 157<br />
8.5 On-bead-Screening 158<br />
8.5.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das Screening: 158<br />
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2 159<br />
8.5.3 Enzymgekoppelter Farbreaktionstest 160<br />
8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung 161<br />
V
Inhaltsverzeichnis<br />
8.6 SPR-Experimente zur Bestimmung der KD-Werte 162<br />
8.6.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die SPR-Experimente 162<br />
8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente 163<br />
9 LITERATURVERZEICHNIS 165<br />
10 ANHANG 171<br />
VI
Abkürzungen<br />
Abkürzungen<br />
Die Abkürzungen der Aminosäuren und Peptide richtet sich nach den Vorschlägen<br />
der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur. Diese können auf<br />
folgender Internetseite abgerufen werden URL: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb.<br />
Cyclische Peptide werden durch ein vorgestelltes cyclo gekennzeichnet. Im Fall einer<br />
Seitenketten-Cyclisierung sind die an der Ringbildung beteiligten Aminosäuren<br />
unterstrichen.<br />
AAV allgemeine Arbeitsvorschrift<br />
Abb. Abbildung<br />
abs. absolut<br />
Ac Acetyl<br />
All Allyl<br />
Alloc Allyloxycarbonyl<br />
AP Alkalische Phosphatase<br />
aq. wässrig<br />
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indoylphoshat-Dinatriumsalz<br />
BNPS 2-Bromo-2-(2-nitrophenylsulfenyl)<br />
Boc<br />
tert. Butyloxycarbonyl<br />
BrCN Bromcyan<br />
Bu Butyl<br />
Bzl Benzyl<br />
bzw beziehungsweise<br />
c Konzentration<br />
ca. circa (ungefähr)<br />
CHCA α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure<br />
COSY correlation spectroscopy<br />
DCC N,N’-Dicyclohexhylcarbodiimid<br />
DCM Dichlormethan<br />
DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure<br />
DIPEA Diisopropylethylamin<br />
VII
Abkürzungen<br />
DMF N,N’-Dimethylformamid<br />
EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid<br />
EDT Ethandithiol<br />
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay<br />
ESI Elektrospray-Ionisation<br />
eq. Äquivalente<br />
Fl Fluoreszenzlabel<br />
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl<br />
GC Gaschromatographie<br />
h Stunde<br />
HATU O-Azabenzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluoro-<br />
phosphat<br />
HBTU O-Benzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat<br />
HMBA 4-Hydroxymethylbenzoesäure<br />
HOAt Hydroxyazabenzotriazol<br />
HOBt Hydroxybenzotriazol<br />
Hsl Homoserinlacton<br />
HSQC heteronuclear single quantum correlation<br />
IC50 Inhibitionskonstante<br />
ID Innendurchmesser<br />
IR Infrarot<br />
J Kopplungskonstante<br />
KD Dissoziationskonstante<br />
kDa kilo Dalton<br />
M Molar<br />
MALDI matrix assisted laser desorption ionisiation<br />
Me Methyl<br />
MeCN Acetonitril<br />
MeIm Methylimidazol<br />
MHz Megahertz<br />
min Minuten<br />
ml Milliliter<br />
MS Massenspektrometrie<br />
MSNT 1-(Mesitylene-2-sulphonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazole<br />
VIII
NBT p-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid<br />
NBS N-Bromsuccinimid<br />
neg. negativ<br />
NHS N-Hydroxysuccinimid<br />
NMP n-Methylpyrrolidin<br />
NMR nuclear magnetic resonance (Kernspinresonanz)<br />
Nu Nucleophil<br />
OBOC one-bead-one-compound<br />
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl<br />
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung<br />
PE Polyethylen<br />
PED partial edman degradation (partieller Edman-Abbau)<br />
Pip Piperidin<br />
PITC Phenylisothiocyanat<br />
Pll Photolabilerlinker<br />
pos. positiv<br />
PTH 3-Phenyl-2-thiohydantoin<br />
pY Phosphotyrosin<br />
Abkürzungen<br />
PyAOP 7-Azabenzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexa-<br />
fluorophosphat<br />
PyBOP Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluoro-<br />
phosphat<br />
Pyr Pyridin<br />
ROESY rotating frame nuclear Overhauser and exchange spectroscopy<br />
RP-HPLC Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie<br />
RU resonance units<br />
SA Streptavidin<br />
SH2 Scr-homology-2<br />
SPPS solid phase peptide synthesis<br />
SPR surface plasmon resonance (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz)<br />
SRBS Sulforhodamin-B-sulfonyl<br />
Su Succinimid<br />
TBS Tris-gepufferte Salzlösung<br />
TFA Trifluoressigsäure<br />
IX
Abkürzungen<br />
TG Tenta Gel<br />
Thi Thienylalanin<br />
THF Tetrahydrofuran<br />
TIS Triisopropylsilan<br />
TNBS 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure<br />
TOF time of flight<br />
TOCSY total correlation spectroscopy<br />
tR Retentionszeit<br />
Tris Tri(hydroxymethyl)-aminomethan<br />
Trt Trityl<br />
UV Ultraviolett<br />
Xaa beliebige Aminosäure<br />
X
1 Einleitung<br />
1.1 Cyclische Peptide – Was ist ihr Nutzen?<br />
1 Einleitung<br />
Cyclische Peptide sind in der Natur weit verbreitet. Man kann sie in Pflanzen,<br />
Pilzen [1] , maritimen Schwämmen, anderen einfachen marinen Lebewesen und<br />
Bakterien nachweisen. [2, 3] Wie andere Naturstoffe auch, zeigen viele cyclische<br />
Peptide ein vielversprechendes therapeutisches Potential. Durch ihre<br />
Aminosäurebausteine sind sie dem menschlichen Organismus nicht fremd. Im<br />
Vergleich zu ihren linearen Analoga weisen sie eine höhere metabolische Stabilität<br />
(verminderter enzymatischer Abbau in vivo) auf, wodurch eine größere<br />
Wirkungsdauer bei medizinischem Einsatz zu erwarten ist. Zudem wird die kon-<br />
formative Flexibilität des Peptidrückgrats durch die cyclische Form beträchtlich<br />
reduziert. Dies kann eine deutliche Erhöhung der Bindungsaffinität und der<br />
Rezeptorselektivität hervorrufen. Desweiteren wurde eine erhöhte Membrandurch-<br />
gängigkeit postuliert, welche jedoch noch diskutiert wird [4] .<br />
Auch heute schon stellen cyclische Peptide eine Verbindungsklasse dar, die<br />
entscheidende Beiträge zur Behandlung von Krankheiten leisten konnten.<br />
Cyclosporin A 1, auch Ciclosporin, als Medikament unter Sandimmun (Novartis),<br />
Cicloral (Hexal) und Ciclosporin Pro (Teva) bekannt (Abb. 1.1), ein Immuno-<br />
suppressivum, wird als Calcineurin-Inhibitor vor allem in der Transplantationsmedizin<br />
verwendet. Der Wirkstoff bindet an Calcineurin und blockiert im Zellplasma so die<br />
Bindung an NF-AT (nuclear factor activating t-Cell), ein Gen-regulierendes Protein. In<br />
aktivierten T-Zellen ist Calcineurin für die Dephosphorylierung von NF-AT<br />
verantwortlich. Daraufhin kann NF-AT in den Zellen transloziert werden und dort die<br />
Transkription von zahlreichen Zytokinen und Zelloberflächenrezeptoren (u. a.<br />
Interleukin-2 und Gamma-Interferon) aktivieren. Als Arzneimittel eingesetzt führt<br />
Cyclosporin A also zu einer eingeschränkten Aktivität des Immunsystems und senkt<br />
somit zum Beispiel das Risiko der Organabstoßung nach einer Transplantation.<br />
1
1 Einleitung<br />
Echinocandin 2 (Abb. 1.1) gab einer ganzen Substanzgruppe ihren Namen. Zur<br />
Wirkstoffklasse der Antimykotika zugehörig, werden sie zur Behandlung von<br />
Pilzinfektionen eingesetzt. Echinocandine inhibieren die β(1-3)-D-Glucan Synthase,<br />
ein Enzym zur Synthese von β(1-3)-D-Glucan. Dieses ist ein wichtiger Baustein für<br />
den Aufbau von Zellwänden in Pilzen.<br />
Das cyclische Depsipeptid Daptomycin 3 (Abb. 1.1), als Medikament unter Cubicin<br />
bekannt (Cubist Pharmaceuticals), ist ein Antibiotikum. Der Arzneistoff wird vor allem<br />
bei Haut- und Weichteilinfektionen mit gram-positiven Problemkeimen eingesetzt.<br />
Oftmals ist der Wirkstoff auch dann noch wirksam, wenn andere Antibiotika aufgrund<br />
von Resistenzen bei der Therapie versagen.<br />
2<br />
Abb. 1.1: Beispiele für cyclische Peptide in der Therapie. Ciclosporin 1, ein Immuno-<br />
suppressivum, Echinocandin 2, ein Antimykotikum und Deptamycin 3, ein<br />
Antibiotikum.
1 Einleitung<br />
Neben ihrem breiten Einsatzbereich als Wirkstoffe eignen sich cyclische Peptide,<br />
aufgrund ihrer hohen Rezeptorselektivität und Bindungsaffinität, auch als molekulare<br />
Hilfsmittel in der Diagnostik. So kann beispielsweise rheumatische Arthritis mit dem<br />
sogenannten anti-CCP-Test mit einer Sensitivität von nahezu 80% und einer<br />
Spezifität von nahezu 98% nachgewiesen werden. [5] Zur Diagnostik wird im Blut nach<br />
Rheumafaktoren (RF-Antikörpern) gesucht. Peptide, bei denen Arginin durch das<br />
Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD) in Citrullin umgewandelt wurde, konnten als<br />
natürliches Antigen mit rheumatoider Arthritis in Zusammenhang gebracht werden.<br />
Antikörper gegen citrullinierte Peptid-/Protein-Antigene (ACPA) gelten als<br />
sogenannter Biomarker für die rheumatoide Arthritis und werden in einem ELISA<br />
(enzym-linked immunosorbent assay) nachgewiesen. Es gelang, ein synthetisches<br />
cyclisches Peptid darzustellen, das sich vom natürlichen Antigen ableitet und eine<br />
deutlich erhöhte Bindungsaffinität zu diesem Antikörper aufweist. Für den Anti-CCP-<br />
Test wird dieses cyclische citrullinierte Peptid (ccp) an der Oberfläche von<br />
Mikrotiterplatten immobilisiert. Daraufhin erfolgt eine Inkubation mit dem Antikörper<br />
(ACPA in Patientenserum). Durch erneute Inkubation mit einem anti-humanen IgG-<br />
Peroxidase-Konjugat und anschließender Farbreaktion kann der Biomarker ACPA<br />
nachgewiesen werden. Diese Entwicklung hat nicht nur zu einer deutlichen<br />
Verbesserung in der Labordiagnostik geführt, sondern ermöglicht auch die Diagnose<br />
der Krankheit in frühen Stadien.<br />
Desweiteren eignen sich cyclische Peptide auch als molekulare Werkzeuge bei der<br />
Suche nach einem hoch affinen Rezeptor (oder beim Verständnis des Struktur-<br />
Wirkungs-Mechanismus). [6] Die konformative Einschränkung der cyclischen Peptide<br />
erleichtert die Bestimmung der für die biologische Wirkung bedeutenden drei-<br />
dimensionalen Struktur der aktiven Substanzen.<br />
3
1 Einleitung<br />
1.2 Cyclopeptidbibliotheken<br />
Die Auswahl an Methoden zur Darstellung von Cyclopeptidbibliotheken ist<br />
inzwischen sehr groß. Prinzipiell eignen sich alle Methoden, die auch für die<br />
Synthese von Bibliotheken linearer Peptide zur Verfügung stehen; da man<br />
üblicherweise zunächst die lineare Peptidsequenz synthetisiert und anschließend<br />
unter Einsatz einer gezielten Schutzgruppenstrategie eine selektive Cyclisierung<br />
vornehmen kann. Gängige Verfahren zur Synthese von Peptidbibliotheken sind<br />
Multiple-Pin-Methode, [7] Tea-Bag-Methode, [8] Split-Mix-Methode, [9, 10] lichtgesteuerte<br />
Synthese [11] und Spot-Synthese [12] Viele dieser Methoden erfordern jedoch eine<br />
spezielle und vor allem teure Laborausstattung. Bei der sogenannten Split-Mix-<br />
Methode [9, 10] ist das nicht der Fall, weshalb sie häufig die Methode der Wahl ist.<br />
Abb. 1.2 Das Prinzip der Split-Mix-Methode.<br />
Bei der von Furka vorgestellten Split-Mix-Methode wird das Harz vor dem ersten<br />
Reaktionsschritt in mehrere gleich große Aliquote aufgeteilt (engl. split) und separat<br />
mit dem entsprechenden Reaktionsbaustein zur Reaktion gebracht. Nach der<br />
Reaktion werden die Harzaliquote vereinigt (engl. mixed) und nach der Aufarbeitung<br />
erneut aufgeteilt, um den zweiten Baustein anzukuppeln (Abb. 1.2). Dieser Zyklus,<br />
bestehend aus Aufteilen, Reaktion und Vereinigen, wird solange wiederholt, bis die<br />
gewünschte Anzahl der Schritte erreicht ist. Man erhält eine Bibliothek mit<br />
4
1 Einleitung<br />
N = a x Komponenten, wobei a die Anzahl der Reaktionsbausteine pro Zyklus und x<br />
die Anzahl der Zyklen ist. Da sich pro Reaktionsgefäß immer nur ein Reaktand in<br />
Lösung befindet, können alle Reaktionen, trotz unterschiedlicher Kinetik, bis zum<br />
vollständigen Umsatz geführt werden. Das vorrangige Ziel von Furka bestand in der<br />
Darstellung von Peptidmischungen innerhalb kürzester Zeit.<br />
1991 erkannten Lam et al. ein weiteres Potential von Split-Mix-Bibliotheken. [13] Auf<br />
jeder Harzkugel einer Substanzbibliothek befindet sich nur eine Verbindung in<br />
vielfacher Kopie (One-Bead-One-Compound, OBOC). Verzichtet man also auf die<br />
Abspaltung des Peptids vom Harz, kann man eine große Anzahl von Peptiden testen<br />
und anschließend getrennt identifizieren. Um sicherzustellen, dass jede theoretisch<br />
mögliche Verbindung in der Bibliothek enthalten ist, muss die Anzahl der<br />
eingesetzten Harzkugeln groß genug sein. Statistische Musterrechnungen hierzu<br />
können den Publikationen von Burgess et al. [14] und Zhao et al. [15] entnommen<br />
werden.<br />
5
1 Einleitung<br />
1.3 Die Problematik der Analytik<br />
1.3.1 Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus OBOC-Bibliotheken<br />
Der Preis, den man für die hohe Syntheseeffizienz der OBOC-Bibliotheken zu zahlen<br />
hat, ist die Notwendigkeit einer eindeutigen Substanzidentifikation jeder positiv<br />
getesteten Kugel. Zur Sequenzierung von linearen Hitpeptiden aus einer OBOC-<br />
Bibliothek stehen vier verschiedene Methoden zur Wahl. Diese sind im Fließschema<br />
in Abb. 1.3 dargestellt.<br />
Abb. 1.3 Methode zur Ermittlung der Peptidsequenz, die sich auf einer als positiv<br />
getesteten Harzkugel aus einer OBOC-Bibliothek befindet.<br />
Bei der Leitersynthese [16] wird das Problem der Analytik bereits während der<br />
Synthese, das heißt dem Split-Mix-Aufbau der Bibliothek, bedacht. Hierzu wird bei<br />
jedem Kupplungsschritt ein kleiner Teil der im Aufbau befindlichen Peptidsequenz<br />
gecappt, beispielsweise durch Zugabe von 5% Ac-Ala-OH oder der entsprechenden<br />
Boc-geschützten Aminosäure. Die weiteren Arbeitsschritte verlaufen analog zum<br />
6
1 Einleitung<br />
Split-Mix-Protokoll. Nach dem Screening werden die positiv getesteten Kugeln<br />
aussortiert. Die an der Kugel gebundene Peptidleiter muss nur noch abgespalten<br />
werden und steht dann zur massenspektrometrischen Analyse zur Verfügung. Aus<br />
den erhaltenen Massenspektren kann nun die Sequenz ausgelesen werden. Der<br />
große Nachteil dieser Methode ist, dass das One-Bead-One-Compound Prinzip<br />
verloren geht, da sich beim Screening die ganze Peptidleiter auf der Kugel befindet<br />
und somit alle „Leitersprossen“ als potentielle aktive Verbindungen zur Verfügung<br />
stehen. In späteren Veröffentlichungen [17] versuchte man, dieses Problem durch eine<br />
Aufteilung der Kugel in äußere und innere Schale (biphasic beads) zu umgehen. Die<br />
Synthese wird dabei so modifiziert, dass beim Screening der Bibliothek die eigentlich<br />
zu testende Substanz dem Target/Rezeptor auf der äußeren Schale angeboten wird,<br />
während sich die zur Verschlüsselung mitsynthetisierte Peptidleiter im Innern der<br />
Kugel befindet.<br />
Ganz ohne Verschlüsselung kommen hingegen tandem-MS, Edman-Abbau und die<br />
Leitersequenzierung aus. Zur rein massenspektrometrischen Sequenzierung<br />
(tandem-MS) von aktiven Peptiden aus OBOC-Bibliotheken wird das Peptid vor der<br />
Probenvorbereitung von der Kugel gespalten. [18] Während der massenspektro-<br />
metrischen Charakterisierung wird das intakte Peptidion im Massenspektrometer<br />
isoliert und anschließend fragmentiert. Aus den erhaltenen Peptidfragment-<br />
ionsignalen können dann Rückschlüsse auf die Peptidsequenz gezogen werden. Für<br />
die Durchführung solcher Experimente benötigt man jedoch ein speziell zur<br />
Sequenzierung ausgestattetes Massenspektrometer, das die Möglichkeit bietet,<br />
Peptidionen zu isolieren und zu fragmentieren. [19-23] Während meiner Diplomarbeit<br />
konnte ich zeigen, dass harzgebundene Peptide mittels MALDI-FTICR-MS/MS<br />
sequenzierbar sind. [24] Durch den Einsatz eines photolabilen Linkers erfolgte die<br />
Abspaltung des Peptids vom Harz durch den Laserstrahl der MALDI-Quelle, wodurch<br />
ein vorheriges Abspalten vom Harz entfiel. Die Gruppe um Albericio zeigte eine<br />
Sequenzierung mittels MALDI-TOF/TOF-MS. [25] Die Abspaltung des Peptids erfolgte<br />
hierbei direkt auf dem MALDI-Target durch Einwirkung von Ammoniakdampf<br />
(Spaltung des HMBA-Linkers). Zur weiteren Probenpräparation musste lediglich<br />
Matrix addiert werden.<br />
7
1 Einleitung<br />
Eine weitere Möglichkeit der direkten Sequenzierung von Peptiden, die sich auf<br />
Hitbeads aus einem Screening befinden, bietet der Edman-Abbau, auch Mikro-<br />
sequenzierung genannt. Hier wird jede positiv getestete Kugel einzeln der<br />
klassischen Mikrosequenzierung zugeführt. Ein vorheriges Abspalten des Peptids<br />
vom Harz ist nicht erforderlich, da während des Abbaus Aminosäure für Aminosäure<br />
vom Harz gespalten und anschließend mittels RP-HPLC detektiert wird. Mit einer<br />
Sequenzierungsrate von 3-4 Kugeln pro Tag ist diese Methode jedoch sehr zeit-<br />
intensiv und eignet sich dadurch nur bedingt zum Einsatz im Hochdurchsatz-<br />
verfahren.<br />
Die Leitersequenzierung [26] , welche partiellen Edman-Abbau mit anschließender<br />
MALDI-TOF Massenspektrometrie umfasst, wurde ursprünglich als zeitsparende<br />
Methode zur Sequenzierung von Peptiden in Lösung eingeführt. Die Gruppe um Pei<br />
übertrug diese Methode auf festphasengebundene Peptide aus OBOC-<br />
Bibliotheken. [27] Hierzu werden alle Kugeln, die eine positiv getestete Peptidsequenz<br />
tragen, vereinigt und anschließend einem gemeinsamen partiellen Edman-Abbau<br />
unterzogen. Der partielle Abbau wird durch die Behandlung mit einer Mischung aus<br />
PITC (zur Spaltung) und Fmoc-OSu (zum Capping) realisiert. Am Ende erhält man<br />
auch hier eine Fragmentleiter, welche mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF-<br />
MS) nachgewiesen wird.<br />
1.3.2 Sonderfall cyclische Peptide<br />
Möchte man eine rein massenspektrometrische Sequenzanalyse (tandem-MS/<br />
De-novo-Sequenzierung) auf einen kombinatorischen Ansatz anwenden, so ist der<br />
Erhalt aller Fragmentionen zur vollständigen und eindeutigen Sequenzierung<br />
unbedingt notwendig. Demnach muss die Wahrscheinlichkeit eines Bindungsbruchs<br />
zwischen den Aminosäuren im gesamten Peptid gleich groß sein. Wird dieses<br />
Prinzip zur Sequenzierung cyclischer Peptide verwendet, so sollte der Bruch des<br />
peptidischen Rings an jeder beliebigen Stelle gleich wahrscheinlich sein. Die dadurch<br />
erhaltenen linearen Peptidfragmente haben eine gemeinsame Zusammensetzung<br />
der Aminosäuren, somit eine identische Masse, aber eine unterschiedliche<br />
Aminosäuresequenz. Weitere Fragmentierungen führen zu immer komplexeren<br />
Spektren. [28] In der Gruppe von Ghadiri wurde ein Computerprogramm entwickelt,<br />
8
1 Einleitung<br />
welches LC-MS/MS-Spektren automatisiert aus- bzw. bewertet. Das Programm ist<br />
speziell auf cyclische Peptide aus OBOC-Bibliotheken zugeschnitten und<br />
berücksichtigt durch die Split-Mix-Synthese vorhandene Sequenzinformationen, wie<br />
eingesetzte Aminosäuren, sowie die Anzahl und Häufigkeit der Aufspaltungen. Zur<br />
Auswertung können jedoch keine Peaklisten, sondern lediglich die erhaltenen<br />
Rohdaten von Hitachi 3DQ-ion trap Massenspektrometern herangezogen werden. [29]<br />
a<br />
E<br />
A b<br />
D C<br />
B<br />
a<br />
b<br />
A B C D E<br />
B C D E A<br />
C D E A B<br />
D E A B C<br />
E A B C D<br />
Abb. 1.4 Die Isolierung und anschließende Fragmentierung eines cyclischen Peptids im<br />
Massenspektrometer führt zu einer Reihe von Fragmentionen mit identischer<br />
molekularen Masse aber unterschiedlicher Aminosäurensequenz.<br />
Soll zur Sequenzierung eines cyclischen Peptids eine auf Edman-Chemie<br />
basierende Sequenzierungsmethode (Microsequenzierung oder Leitersequen-<br />
zierung) zum Einsatz kommen, ist das Vorhandensein des freien N-Terminus<br />
unbedingt notwendig.<br />
Eine präanalytische, also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende,<br />
Umwandlung der cyclischen Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich<br />
besseren Zugang zur Sequenzinformation mittels massenspektrometrischer und<br />
Edman-basierter Methoden ermöglichen.<br />
9
1 Einleitung<br />
1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray<br />
Scr-homology-2-(SH2)-Domänen sind eine von vielen Familien innerhalb der<br />
Proteindomänen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Signaltransduktion<br />
vermitteln. Wie andere Domänen auch, sind SH2-Domänen über eine konservierte<br />
Region in der Aminosäuresequenz definiert. Die charakteristische Faltung dieser 100<br />
Aminosäuren umfassenden Domäne ermöglicht eine spezifische Erkennung und<br />
Bindung an Phosphotyrosin-beinhaltende Liganden. Phosphotyrosin (pY) bein-<br />
haltende Protein-Protein Wechselwirkungen, wie zum Beispiel solche, die durch<br />
SH2-Domänen ermöglicht werden, sind eines der primary means, um Signalproteine<br />
zu rekrutieren und spielen daher eine Hauptrolle bei der Signalübermittlung. SH2-<br />
Domänen wurden in Enzymen, Adapterproteinen, Regulationsuntereinheiten von<br />
Signalproteinen, Gerüstproteinen, Transkriptionsfaktoren und onkogenen Proteinen<br />
gefunden. Diese Proteine sind fest eingebunden in den Prozess der Signalüber-<br />
mittlung, da sie als Verbindung zwischen Rezeptor und nachgeordneten Signal-<br />
moleküle fungieren. Sie vermitteln Signale zwischen Zellen und regulieren die<br />
Kinaseaktivität bestimmter Proteine. [30] Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine<br />
10<br />
Abb. 1.5 C-terminale Aminosäuresequenz [222-252] des CEACAM3 Proteins. Die<br />
beiden Tyrosine (Y230 und Y241) sind fettgedruckt hervorgehoben.<br />
Ausgehend von diesen beiden Y, sieben Aminosäuren in der Sequenz in<br />
Richtung C- und N-Terminus, ergeben sich die zwei ITAM-ähnlichen<br />
Sequenzen (Peptid Y230 beziehungsweise Y241), die unterstrichen<br />
hervorgehoben sind.
1 Einleitung<br />
der Haupinformationsleitungen der zellulären Verständigung. Eine Störung im SH2-<br />
Domänen-abhängigen Signalweg kann oftmals direkt oder indirekt mit<br />
Humanerkrankungen in Verbindung gebracht werden.<br />
Die Arbeitsgruppe um Prof. Christof Hauck (Fachbereich Biologie, <strong>Universität</strong><br />
<strong>Konstanz</strong>) beschäftigt sich ausführlich mit der Aufklärung der Rolle der ITAM<br />
(immunoreceptor tyrosine based activation motif)-ähnlichen Sequenzen von<br />
CEACAM3 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) in<br />
Signalwegen (Abb. 1.5). Mit Hilfe eines SH2-Domänen-Mikroarrays soll ermittelt<br />
werden, an welche SH2-Domänen die ITAM-ähnlichen Sequenzen von CEACAM3<br />
binden. Hierzu soll eine mit unterschiedlichen SH2-Domänen versehene Glas-<br />
oberfläche mit einem synthetischen Peptid, welches Phosphotyrosin beinhaltet und<br />
mit einem Fluoreszenzlabel versehen wurde, inkubiert werden. Findet eine Ligand-<br />
Proteinwechselwirkung statt, kann diese im Chipreader mittels Fluoreszenz sichtbar<br />
gemacht werden (Abb. 1.6). Durch die Identifikation der SH2-Domänen, an die der zu<br />
erforschende Ligand bindet, kann nachgewiesen werden, an welchem Signalweg<br />
dieser Ligand beteiligt ist. [31]<br />
Abb. 1.6 SH2-Domänen-Mikroarray: a) Der Glasträger wird mit unterschiedlichen SH2-<br />
Domänen versehen. b) Inkubation mit einem Phosphotyrosin beinhaltenden<br />
und fluoreszenzmarkierten Peptid (möglicher Ligand). c) Ligand bindet nur am<br />
passenden Rezeptor und kann über Fluoreszenz nachgewiesen werden.<br />
11
2 Aufgabenstellung<br />
2.1 Analytik von Cyclopeptiden<br />
2 Aufgabenstellung<br />
In der Natur sind cyclische Peptide weit verbreitet. In vielen Fällen weisen sie eine<br />
hohe biologische Aktivität auf und stellen somit eine potentielle Substanzklasse für<br />
Wirkstoffe, Leitstrukturen und molekulare Werkzeuge dar. Die Split-Mix-Synthese [10]<br />
ermöglicht eine effiziente und schnelle Darstellung cyclischer OBOC-<br />
Peptidbibliotheken [13] mit einer großen Mitgliederzahl. Nach dem Screening, dem<br />
Test der Mitglieder auf Aktivität, stößt man jedoch bei der Analytik der Hitbeads auf<br />
den Engpass der Methode. Zur Identifikation der aktiven Komponente steht lediglich<br />
eine einzelne Harzkugel zur Verfügung. An diese sind je nach Beladungsdichte<br />
typischerweise zwischen 100 pmol und 5 nmol der aktiven Verbindung gebunden.<br />
Aufgrund ihrer hohen Sensitivität können Massenspektrometrie und auch auf Edman-<br />
Abbau basierte Methoden zur Analytik solch geringer Peptidmengen herangezogen<br />
werden. Neben der geringen Substanzmenge weisen OBOC-Cyclopeptid-<br />
bibliotheken jedoch noch eine weitere analytische Herausforderung auf. Sie besitzen<br />
oft keinen freien N-Terminus und sind somit für die Chemie des Edman-Abbaus nicht<br />
zugänglich. Auch in der Massenspektrometrie liefern sie aufgrund ihrer cyclischen<br />
Verbrückung meist keine eindeutig auswertbaren Spektren. [28] Eine präanalytische,<br />
also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende, Transformation der cyclischen<br />
Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich besseren Zugang sowohl zu massen-<br />
spektrometrischen, als auch zu Edman-basierten Methoden ermöglichen.<br />
Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer effizienten Methode zur Sequenzierung<br />
cyclischer Peptide, die als aktive Substanzen aus einer OBOC-Bibliothek her-<br />
vorgingen. Zunächst sollte die Einführung und Spaltung molekularer Sollbruchstellen<br />
zur gezielten Peptidringöffnung untersucht werden. Die daraus resultierenden,<br />
vormals cyclischen, Peptide sollten anschließend zuverlässig mit in unseren<br />
Laboratorien zur Verfügung stehenden Methoden sequenziert werden. Nach der<br />
Entwicklung der Methode sollte ihr Nutzen anhand einer konkreten Anwendung<br />
gezeigt werden. Die durch die Anwendung gefundenen Cyclopeptide sollten<br />
schließlich auf Ihre Bindungsaktivität hin untersucht werden.<br />
13
2 Aufgabenstellung<br />
2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden<br />
Für den Einsatz im SH2-Domänen-Mikroarray (mehr dazu in Kapitel 1.4) sollten die<br />
in Abb. 2.1 gezeigten Peptide Y241 und Y230 synthetisiert werden. Die Tyrosine<br />
sollten in jeder der beiden Sequenzen als Phosphotyrosin (aktive Peptide: pY241<br />
und pY230) beziehungsweise als Tyrosin (Negativkontrolle: Y241 und Y230)<br />
vorliegen, so dass sich vier synthetische Peptide ergeben. Die Peptide sollten als<br />
Peptidylsäuren erhalten werden. Für den Einsatz im Mikroarray sollten die Peptide<br />
mit einem mit dem Chip-Reader kompatiblen Fluoreszenzlabel versehen werden.<br />
14<br />
Abb. 2.1 Die fluoreszenzmarkierten Peptide (Fl = Fluoreszenzlabel).
3 Sollbruchstellen<br />
3 Sollbruchstellen<br />
Für eine spätere Sequenzierung cyclischer Peptide müssen diese, wie in der<br />
Einleitung beschrieben, in lineare Peptide überführt werden. Zunächst wurden daher<br />
mehrere Herangehensweisen experimentell untersucht, um eine Sollbruchstelle in<br />
den peptidischen Ring einzubringen. Denkbar sind chemische und enzymatische<br />
Sollbruchstellen. Der Ring muss erst geöffnet werden und anschließend das lineare<br />
Peptid von der Kugel gespalten werden. Auf den Einsatz von Disulfidbrücken, eine<br />
Verbrückung über Cysteinseitenketten, wurde bewusst verzichtet, da ein selektives<br />
und stabiles Öffnen bzw. Schließen des peptidischen Rings auf diese Weise als<br />
problematisch eingestuft wird. [32-34]<br />
3.1 Photolabile Sollbruchstelle<br />
Lichtinduzierte Spaltungsreaktionen ermöglichen eine Erweiterung der Orthogonalität<br />
von Linkern und Schutzgruppen in der präparativen organischen und kombi-<br />
natorischen Synthese auf eine weitere Dimension. Die photolytische Spaltung<br />
verläuft unter sehr milden Reaktionsbedingungen und kommt ohne Erwärmen und<br />
ohne Zusatz von Reagenzien aus. Ein erster Ansatz bestand daher im Einbau einer<br />
photolabilen Sollbruchstelle.<br />
Abb. 3.1 Zwei von Holmes et al. entwickelte photolabile Linker. Nach photoinduzierter<br />
Reaktion erhält man eine Peptidylsäure (wenn X=O), beziehungsweise ein<br />
Peptidylamid (wenn X=N).<br />
Die in Abb. 3.1 gezeigte Verbindung 4 enthält einen kommerziell erhältlichen<br />
photolabilen Linker [35, 36] , wie er auch in meiner Diplomarbeit verwendet wurde. Durch<br />
Laserbestrahlung (Stickstofflaser, 337 nm), zum Beispiel während der Laser-<br />
15
3 Sollbruchstellen<br />
induzierten Ionisierung im MALDI-Experiment, kann das Peptid direkt vom Harz<br />
gespalten werden. Ein vorheriges Abspalten zur Probenvorbereitung ist nicht<br />
notwendig. Im Rahmen meiner Diplomarbeit konnte ich jedoch feststellen, dass die<br />
Esterverknüpfung in Verbindung 4 unter Standard-Abspaltbedingungen von<br />
säurelabilen Schutzgruppen (TFA/TIS/Wasser (95:2,5:2,5)) nicht vollständig stabil ist.<br />
Die Amidverknüpfung zwischen Peptid und Linker in Verbindung 5 sollte diese<br />
Säurelabilität hingegen nicht aufweisen. Da es sich bei diesem Linker um eine<br />
Verbindung mit Carboxyl- und Aminogruppe handelt, also eine „Amino-Säure“-<br />
Funktionalität vorliegt, sollte diese Verbindung innerhalb einer Peptidkette auch als<br />
Sollbruchstelle nutzbar sein. Wird die Verbindung als Linker zwischen fester Phase<br />
und Peptid und zugleich im Peptidzyklus verwendet, so sollte eine gleichzeitige<br />
Abspaltung des Peptids von der festen Phase und eine Peptidringöffnung möglich<br />
sein (Abb. 3.2). Der für den Aufbau von Verbindung 5 notwendige Baustein 7 ist<br />
kommerziell nicht erhältlich.<br />
Abb. 3.2 Wird der photolabile Linker zwischen Peptid und Harzkugel und im cyclischen<br />
Peptid verwendet, so sollte durch Bestrahlung der Peptidzyklus gezielt<br />
geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten werden.<br />
Abb. 3.3 zeigt diesen kommerziell nicht erhältlichen Linker 7, der freundlicherweise<br />
im organischen Grundpraktikum unter der Leitung von Herrn Dr. Huhn nach einer<br />
Vorschrift von Holmes et al. dargestellt wurde. [35] Ausgehend von 4-Hydroxy-3-meth-<br />
oxyacetophenon kann dieser in sieben Stufen mit einer Literaturausbeute von 56%<br />
synthetisiert werden.<br />
16
3 Sollbruchstellen<br />
Abb. 3.3 Der Fmoc-geschützte photolabile Linker (Fmoc-Pll-OH) 7 kann ausgehend von<br />
4-Hydroxy-3-methoxy-acetophenon 6 in sieben Schritten synthetisiert werden.<br />
Um zunächst die photolabile Sollbruchstelle untersuchen zu können, wurde eine<br />
kleine Bibliothek von cyclischen Peptiden an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert<br />
(Abb. 3.4). Die Verwendung des SieberAmid-Linkers ermöglichte das Abspalten der<br />
cyclischen Peptide, ohne den Ring zu öffnen. So konnte eine anschließende<br />
Charakterisierung und eine Studie der Spaltung der Sollbruchstelle folgen.<br />
Abb. 3.4 Durch parallele Synthese erhaltene Bibliothek von Cyclopeptiden.<br />
Abb. 3.5 zeigt exemplarisch für alle Peptide den Syntheseweg zur Darstellung von<br />
Peptid 8. Die Synthese der linearen Vorläufersequenz erfolgte im<br />
10 µmol Ansatz am Peptidsynthesizer unter Fmoc-Bedingungen. Der Synthese-<br />
verlauf wurde über eine Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Die<br />
photolabile Aminosäure 7, welche später als Sollbruchstelle im Ring fungiert, wurde<br />
manuell angeknüpft. Nach vollständiger Elongation der Peptide wurde die<br />
N-terminale Fmoc-Gruppe abgespalten. Anschließend wurde das Peptidylharz mit<br />
Pd(0) und Diaminoboran-Komplex in DCM behandelt, um die Allyl-Schutzgruppe der<br />
Glutaminsäurenseitenkette zu entfernen. Die Cyclisierung erfolgte über eine<br />
17
3 Sollbruchstellen<br />
N-Terminus-zu-Carbonsäureseitenkette-Amidverknüpfung. Dazu wurde die Carboxyl-<br />
gruppe der Glutaminseitenkette mit PyBOP/HOBt und DIPEA aktiviert. Nach jedem<br />
wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung des Peptids von der festen<br />
Phase und eine anschließende Charakterisierung mittels RP-HPLC und offline-MS.<br />
18<br />
Fmoc-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-SieberAmid-<br />
HN<br />
N<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
N<br />
H<br />
NH<br />
O<br />
H<br />
N<br />
1) 20% Piperidin in DMF<br />
2) Fmoc-Pll-OH 7 /HOBt/<br />
HBTU/DIPEA<br />
(4 eq: 6 eq: 4 eq: 8 eq), 19h<br />
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-SieberAmid-<br />
4) [Pd(PPh 3) 4]/(CH 3) 2NHBH 3(0,8 eq: 15 eq)<br />
5) 20% Piperidin in DMF<br />
H-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu-Lys(Boc)-SieberAmid-<br />
6) PyBOP/HOBt/DIEA<br />
(5 eq: 5 eq: 10eq), 18,5h<br />
O<br />
MeO<br />
O<br />
N<br />
H<br />
NO 2<br />
O<br />
H<br />
N<br />
NH<br />
O<br />
HN<br />
O<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
SieberAmid<br />
17<br />
TFA/TIS/H20 13 14<br />
TFA/TIS/H20 15 16<br />
TFA/TIS/H 20<br />
TFA/TIS/H20 19 8<br />
Abb. 3.5 Nach automatisierter Elongation des linearen Vorläuferpeptids 13 wurde<br />
manuell die photolabile Aminosäure 7 (Fmoc-Pll-OH) angeknüpft. Nach<br />
Abspaltung der Fmoc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte die Cyclisierung. Nach<br />
jedem wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung mit<br />
anschließender RP-HPLC-offline-MS-Charakterisierung. Den Syntheseweg<br />
durchliefen alle fünf Bibliotheksmitglieder (Peptid 8-12) getrennt nacheinander.<br />
18
3 Sollbruchstellen<br />
Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 3.6 dargestellt. Zur<br />
Peptidsequenzierung wurden massenspektrometrische Untersuchungen<br />
vorgenommen, die in Abschnitt 4.1.1 näher beschrieben werden.<br />
Abb. 3.6 RP-HPLC-Diagramm der Testabspaltungen während der Synthese von 8. Die<br />
Peak-Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektro-<br />
metrisch untersucht.<br />
Säule: C18 Nucleosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte<br />
Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 30 min (MeCN<br />
und H2O mit 0.1% TFA).<br />
In den Chromatogrammen der cyclischen Peptide 8-12 traten immer zwei<br />
Hauptpeaks auf (Abb. 3.6 in grün abgebildet), welche massenspektrometrisch nicht<br />
zu unterscheiden waren. Da die photolabile Aminosäure 7 eine chirale Verbindung<br />
ist, die nicht enantiomerenrein in der SPPS eingesetzt wurde, entstehen<br />
Diastereomere. Möglicherweise sind diese nach der Cyclisierung in ihrer<br />
Konformation soweit eingeschränkt, dass sie sich chromatographisch voneinander<br />
trennen lassen. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde das cyclische Peptid 10<br />
erneut synthetisiert, beide Produkte aufgetrennt und NMR-spektroskopisch<br />
untersucht. Die Synthese erfolgte wie bereits oben beschrieben.<br />
19
3 Sollbruchstellen<br />
Abb. 3.7 RP-HPLC-Diagramm nach einer Testabspaltung des photolabilen cyclischen<br />
Peptids 10 mit 1% TFA. Unter diesen Bedingungen bleibt die Boc-<br />
Schutzgruppe weitestgehend im Peptid erhalten. Deutlich zu erkennen sind<br />
zwei Produktpeaks pro Peptid.<br />
Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte<br />
Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradienten: 10-85% MeCN in 20 min. Beiden<br />
Eluenten (Wasser und MeCN) wurde je 0.1% TFA zugesetzt.<br />
Abb. 3.7 zeigt das Chromatogramm eines analytischen RP-HPLC-Laufes nach einer<br />
Testabspaltung des Peptids 10. Unter den bei der Testabspaltung verwendeten<br />
Standard-SieberAmid-Abspaltbedingungen (TFA/TIS/DCM (1:1:98)) bleibt die Boc-<br />
Schutzgruppe weitestgehend auf der Aminogruppe der Lysinseitenkette erhalten. Die<br />
quantitative Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte durch Behandlung mit<br />
TFA/TIS/DCM (95:2,5:2,5), wodurch simultan die Boc-Schutzgruppe entfernt wurde.<br />
Mittels präparativer RP-HPLC wurden die beiden Komponenten voneinander<br />
getrennt. Zur NMR-spektroskopischen Untersuchung wurden von beiden Produkten<br />
COSY-, HSQC-, TOCSY- und ROESY-Experimente durchgeführt. Die Durchführung<br />
eines NOESY-Experiments ist für diese Verbindung nicht sinnvoll, da die Intensität<br />
der erhalten Signale von der molaren Masse abhängt und bei ca. 1000 g/mol gegen<br />
Null geht. Die vollständige Auswertung der erhaltenen Datensätze bestätigt, dass es<br />
sich um zwei cyclische Peptide der gleichen Sequenz mit vermutlich<br />
unterschiedlicher Konfiguration handelt. Abb. 3.8 zeigt exemplarisch einen Ausschnitt<br />
aus einem ROESY-Spektrum, aus dem die Sequenz ausgelesen werden kann. Alle<br />
weiteren NMR-Daten können dem Anhang entnommen werden.<br />
20
3 Sollbruchstellen<br />
Abb. 3.8 Ausschnitt aus dem 600-MHz-ROESY-Spektrum von Peptid 10 (nach prä-<br />
parativer Auftrennung; Fraktion tR = 9,7min). Schematisch eingezeichnet ist<br />
die Zuordnung der Peptidsequenz. Die Kreuzsignale sind mit der in Cara [37]<br />
üblichen Nomenklatur bezeichnet. Die zur Auswertung verwendeten Signale<br />
sind mit gelb hervorgehoben und zur besseren Verständlichkeit mit Nummern<br />
versehen, die sich in der Struktur oben wieder finden.<br />
21
3 Sollbruchstellen<br />
Abb. 3.9 Denkbarer Reaktionsmechanismus der photolytischen Spaltung. [38]<br />
Für eine kinetische Untersuchung der photolytischen Sollbruchstelle wurde Peptid 9<br />
herangezogen. Durch Behandlung des Harzes mit 1% TFA wurde das Boc-<br />
geschützte Peptid 9 von der festen Phase gespalten und anschließend<br />
gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus Aceto-<br />
nitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%) (v/v)<br />
gelöst und in ein HPLC-Probegefäß überführt. Anschließend erfolgte eine<br />
Bestrahlung der Peptidlösung mit UV-Licht (366 nm) für 20, 60, 120, 180, 240 und<br />
360 Sekunden. Ein hypothetischer Reaktionsmechanismus kann Abb. 3.9<br />
entnommen werden. [38] Nach Ablauf der Bestrahlungsdauer wurden RP-HPLC-<br />
Chromatogramme von je 10 µl Peptidlösung aufgenommen. In Abb. 3.10 ist eine<br />
Auswahl der erhaltenen Chromatogramme dargestellt. Vor der Bestrahlung zeigt das<br />
Chromatogramm den Doppelpeak (rot hervorgehoben) des cyclischen Peptids 9 bei<br />
Retentionszeiten von 13,3 und 13,6 min. Im Verlauf der Reaktion nimmt dieser<br />
Eduktpeak, wie erwartet, ab. Synchron zu seinem Verschwinden, wurde die<br />
Entstehung eines Produkts (blau hervorgehoben) bei einer Retentionszeit von 12,6<br />
min beobachtet, dessen UV-Spektrum leicht bathochrom verschoben ist. Das neu<br />
gebildete Produkt zeigte das Phänomen des Doppelpeaks nicht, was nicht weiter<br />
verwunderte, da während der Photoreaktion das Chiralitätszentrum verloren geht. Mit<br />
zunehmendem Reaktionsverlauf ist eine weitere Produktbildung (tR 13,2 min, grün<br />
hervorgehoben) zu erkennen. Da zwischen den einzelnen Bestrahlungszyklen immer<br />
ein HPLC-Lauf erfolgte, lag die Vermutung nahe, dass es sich hierbei nicht um eine<br />
photolytische Reaktion, sondern um eine Zersetzung des photolytischen Spalt-<br />
produktes handeln könnte. Deshalb wurde die Peptidlösung nach der letzten<br />
22
3 Sollbruchstellen<br />
Bestrahlung für 62 Stunden im Kühlschrank gelagert und erneut mittels RP-HPLC<br />
untersucht. Ein Vergleich der Chromatogramme zeigte eine deutliche Abnahme des<br />
photolytischen Spaltproduktes (blau hervorgehoben) und eine Zunahme der neuen<br />
Komponente mit einer Retentionszeit von 13,2 min. Somit konnte die Vermutung<br />
bestätigt werden, dass das gewünschte Produkt der photolytischen Ringöffnung nicht<br />
stabil ist. Durch Ermittlung der Peakflächen bei tR 12,6 min und tR 13,6 min, welche<br />
zu den Stoffmengen proportional sind, und Auftragung dieser gegen die<br />
Bestrahlungsdauer, wurde das Diagramm in Abb. 3.11 erhalten. Auch hier wurde<br />
deutlich, dass es sich zunächst um eine direkte Umwandlung des Edukts zum<br />
Produkt handelte. Die Kinetik der direkten Umwandlung entspricht der einer Reaktion<br />
1. Ordnung. Mit fortschreitendem Reaktionsverlauf wandelt sich das Primärprodukt<br />
zu einer neuen Verbindung um.<br />
Abb. 3.10 RP-HPLC-Diagramme von Peptid 9 nach unterschiedlicher Bestrahlungsdauer<br />
mit 366 nm. Die rot unterlegten Peaks stellen das cyclische Peptid 9 dar. Das<br />
photolytische Spaltprodukt ist in blau unterlegt und wandelt sich ohne<br />
Bestrahlung in eine neue Verbindung um. Diese ist grün unterlegt.<br />
Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min und einem<br />
Gradienten von 10-85% MeCN in 20 min verwendet. Beiden Eluenten (Wasser<br />
und MeCN) wurden je 0,1% TFA zugesetzt.<br />
23
3 Sollbruchstellen<br />
Abb. 3.11 Die Kinetik zeigt in rot die Abnahme des Edukts. In schwarz ist die Entstehung<br />
des Primärproduktes zu sehen.<br />
Auch andere Arbeitsgruppen haben bei der photolytischen Spaltung dieses Linkers<br />
diverse Nebenreaktionen, wie beispielsweise Dimerisierungen und nucleophile<br />
Angriffe durch primäre Amine oder Thiole, beobachtet. [39, 40] Oftmals konnten die<br />
Nebenprodukte allerdings nicht identifiziert werden. [39, 41] Anhand der erhaltenen<br />
HPLC-, UV- und MS-Daten konnte auch in unserem Fall keine weitere Aussage über<br />
das entstandene Nebenprodukt gemacht werden.<br />
Um weitere Informationen über das durch Photolyse erhaltene Peptidprodukt zu<br />
gewinnen, wurde das cyclische Peptid 10 erneut synthetisiert und mit 1% TFA vom<br />
Harz gespalten. Für die anschließende Photolyse wurde das lyophilisierte Peptid 10<br />
in Acetonitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%)<br />
(v/v) gelöst und 420 Sekunden mit UV-Licht bestrahlt. Die bestrahlte Lösung wurde<br />
im Kühlschrank für 24 Stunden verwahrt und anschließend mittels präparativer RP-<br />
HPLC aufgereinigt. Zur NMR-spektroskopischen Charakterisierung wurden COSY-,<br />
24
3 Sollbruchstellen<br />
HSQC-, TOCSY- und ROESY-Experimente durchgeführt. Vergleicht man den<br />
erhaltenen Datensatz mit dem Datensatz des cyclischen Peptids, so bemerkt man<br />
einige Unterschiede: Die Spur der Aminofunktion der Sollbruchstelle (Verknüpfung<br />
zwischen photolabiler Aminosäure und Glutaminsäure) fehlt im TOCSY-Spektrum.<br />
Die Signale der CHCH3-Gruppe am Pll-Aromaten sind weiterhin zu sehen. Der vierte<br />
Substituent am Pll-Aromaten, im Edukt die Nitrogruppe, ist jedoch unklar. Im HSQC-<br />
Spektrum ist eine deutliche Veränderung an der kx-Position der Pll-Kette zu sehen.<br />
Das freie Amin in der Glutaminseitenkette fehlt. Die Signale der Protonen im Pll-<br />
Aromaten verändern sich fast nicht. Eine vollständige Identifizierung der Verbindung<br />
war jedoch leider nicht möglich.<br />
Da man für MS-Identifizierungen der Peptidsequenz auf stabile und eindeutige<br />
Produkte angewiesen ist, ist diese Sollbruchstelle für diesen Zweck nicht geeignet.<br />
25
3 Sollbruchstellen<br />
3.2 Methionin als Sollbruchstelle<br />
Bereits in den 1960er Jahren beschrieben Gross und Witkop die Bromcyan-<br />
vermittelte selektive Spaltung von Peptidbindungen, an denen die Carbonylgruppe<br />
eines Methionins beteiligt ist. [42, 43] Bis heute ist dies die wichtigste nichtenzymatische<br />
Spaltung von Proteinen und Polypeptiden in der Biochemie. Inglis und Edman<br />
befassten sich mit Studien zu Kinetik und Mechanismus dieser Spaltung. [44] Der<br />
heute in Lehrbüchern [45] verbreitete Mechanismus ist in Abb. 3.12 dargestellt.<br />
Die hoch selektive Transformation beginnt mit einer S-Alkylierung des Methioninrests<br />
durch Bromcyan-Behandlung unter wässrig sauren Bedingungen. Die Elektronen des<br />
Cyan-Kohlenstoffs sind in Richtung des elektronegativeren Bromids verschoben.<br />
Dies führt zu einer positiven Teilladung am Kohlenstoff, welche einen nucleophilen<br />
Angriff des Sulfids (Methionin) ermöglicht. Es folgt eine intramolekulare Cyclisierung,<br />
bei der Methylthiocyanat 22 als gute Abgangsgruppe eliminiert wird. Nach saurer<br />
Hydrolyse des entstandenen Iminolactons gelangt man zum C-terminalen<br />
Homoserinlacton (Hsl) 26 und einem freien Amin.<br />
26<br />
Abb. 3.12 Mechanismus der BrCN-Spaltung, wie er üblicherweise in Lehrbüchern zu<br />
finden ist. [45]
3 Sollbruchstellen<br />
Neben der Bromcyanspaltung zur Fragmentierung von Polypeptiden findet man in<br />
der Literatur auch zahlreiche Beispiele, in denen Methionin als Linkergruppe in der<br />
SPPS eingesetzt wurde. [16, 21, 27, 46-50] Nach der Standard-Fmoc-SPPS wird das<br />
Peptid dabei üblicherweise durch Behandlung mit einer Lösung, bestehend aus<br />
BrCN in 70% wässriger TFA (70 mg/ml), vom Harz abgespalten.<br />
Abb. 3.13 Cyclisches Peptid mit Methionin als Linker zum Harz und Sollbruchstelle im<br />
Peptidzyklus. Durch Behandlung mit BrCN wird das Peptid vom Harz<br />
gespalten und der Ring geöffnet. Man erhält ein lineares Peptid in Lösung.<br />
Inspiriert von diesen Arbeiten kam der Gedanke auf, Methionin nicht nur als Linker,<br />
sondern zusätzlich als Sollbruchstelle im cyclischen Peptid zu verwenden. Wird ein<br />
solches System einer BrCN-Behandlung ausgesetzt, so sollte simultan das Peptid<br />
vom Harz gespalten und der peptidische Ring geöffnet werden. Man erhält ein<br />
lineares Peptid in Lösung, welches nun einer Sequenzierung unterzogen werden<br />
kann.<br />
Um das Potential von Methionin als Sollbruchstelle im Zyklus zu überprüfen, wurde<br />
zunächst Peptid 27-33 an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.14). Im<br />
Hinblick auf eine spätere Sequenzierung des Peptids mittels Massenspektrometrie,<br />
wurde zwischen dem Peptidzyklus und dem Trägerharz eine kurze Massenspacer-<br />
sequenz, bestehend aus -βAla-Pro-Pro-Arg-, synthetisiert. Der Spacer nutzt in<br />
zweierlei Hinsicht. Erstens bringt er die zur Sequenzierung notwendigen Peptid-<br />
fragmente in einen Massenbereich größer 500 m/z und somit über den<br />
Massenbereich der Matrix-Hintergrund-Signale im MALDI-Experiment. Zum Zweiten<br />
wird durch die Anwesenheit von Arginin eine positive Ladung im Peptid gesichert,<br />
welche für die massenspektrometrische Detektion nötig ist.<br />
27
3 Sollbruchstellen<br />
28<br />
Abb. 3.14 Synthese des cyclischen Peptids 33 und anschließende Ringöffnung mit<br />
BrCN-Behandlung.<br />
Abb. 3.15 RP-HPLC von Testabspaltungen während der Synthese von 33. Die Peak-<br />
Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektrometrisch<br />
untersucht.<br />
Säule: C18 Nucleosil 100-5, ID 4 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte<br />
Detektorwellenlänge war 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 20 min (MeCN<br />
und H2O mit 0,1% Ameisensäure).
3 Sollbruchstellen<br />
Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 27 erfolgte unter Standard-Fmoc-SPPS<br />
am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der<br />
Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach Entschützung des N-Terminus und der<br />
Carboxylgruppe der Glutaminsäureseitenkette erfolgte zwischen diesen die<br />
Cyclisierung unter Verwendung von PyBOP. Die Reaktionsbedingungen können der<br />
Abb. 3.14 entnommen werden. Zur Untersuchung der Sollbruchstelle wurde das<br />
harzgebundene Cyclopeptid 31 anschließend über Nacht mit Bromcyan in wässrig<br />
saurer Lösung behandelt. Alle Schritte wurden mittels RP-HPLC und nachfolgender<br />
Massenspektrometrie analysiert (Abb. 3.15). In den Chromatogrammen der Peptide<br />
28, 30 und 32 wurden je zwei Hauptpeaks beobachtet. Die massenspektrometrische<br />
offline-Charakterisierung ergab, dass es sich bei den Peaks mit niedrigerer<br />
Retentionszeit (17,921 min, 13,395 min und 13,710 min) jeweils um das<br />
entsprechende Peptid handelte, bei dem Methionin oxidiert vorliegt. Aus den<br />
Chromatogrammen in Abb. 3.15 wird ebenfalls ersichtlich, dass das cyclische Peptid<br />
32 durch Behandlung mit BrCN zum linearen Peptid 33 umgewandelt werden kann.<br />
Methionin ist somit als Sollbruchstelle in cyclischen Peptiden durchaus geeignet.<br />
Die daran anschließenden massenspektrometrischen Sequenzierungsexperimente<br />
sind in Abschnitt 4.1.2 ausführlich beschrieben. Wie dort ausführlich erläutert stellte<br />
sich die rein massenspektometrische Sequenzierung als ungeeignet heraus, somit<br />
erübrigte sich die Anwendung einer simultanen Ringöffnung und Harzspaltung.<br />
Der partielle Edman-Abbau (PED) zeigte sich dagegen als geeigneter zur<br />
Sequenzierung (eine ausführliche Beschreibung hierzu befindet sich in Kapitel 4).<br />
Dies stellt jedoch besondere Anforderungen an den Linker. Ein simultanes<br />
Peptidringöffnen und Abspalten des Peptides vom Harz ist bei dieser Methode nicht<br />
mehr möglich. Alle Schritte müssen festphasengebunden vonstatten gehen und erst<br />
unmittelbar vor der Analytik darf das Peptid vom Harz gespalten werden.<br />
29
3 Sollbruchstellen<br />
3.2.1 Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle<br />
In den oben beschriebenen Experimenten wurde Methionin als Sollbruchstelle und<br />
Linker verwendet. Somit wurde durch die Behandlung mit Bromcyan der Peptidzyklus<br />
geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten. Soll die Bromcyan-<br />
vermittelte Ringöffnung jedoch ohne simultane Abspaltung des Peptids vom Harz<br />
erfolgen, benötigt man einen Linker, der allen verwendeten Bedingungen standhält.<br />
Zur Darstellung des cyclischen Peptids werden folgende Bedingungen verwendet:<br />
Die Standard-Bedingungen der Fmoc-SPPS (20% Piperidin in DMF bzw. NMP),<br />
Entfernung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe (Pd(0) und Nucleophil) und<br />
Abspaltung der säurelabilen Boc-, Trt-, t-Bu- und Pbf-Schutzgruppen (95%TFA aq.).<br />
Zum Öffnen des Peptidzyklus wird eine Bromcyan-Spaltung durchgeführt (BrCN in<br />
70% TFA aq.). Außerdem sollen die festphasengebundenen cyclischen Peptide<br />
einem Screening unterzogen werden (Abschnitt 5.3), welches im wässrigen Milieu<br />
zwischen pH=1-9 verläuft; auch hierbei darf der Linker nicht reagieren. Da sich<br />
herausstellte, dass der partielle Edman-Abbau die geeignetste Methode zur<br />
Sequenzierung ist, muss der Linker schließlich auch zu diesen Bedingungen<br />
kompatibel sein.<br />
Peptid-Synthese<br />
vor dem Screening<br />
30<br />
Abb. 3.16 Ein geeigneter Linker muss zu allen hier aufgeführten Bedingungen<br />
kompatibel sein.
3.2.1.1 Der Arylhydrazin-Linker<br />
3 Sollbruchstellen<br />
Die meisten in der Literatur beschriebenen Linker zeichnen sich dadurch aus, dass<br />
sie leicht spaltbar sind. Der von uns gesuchte Linker muss jedoch ein äußerst breites<br />
Spektrum an chemischen Reaktionen (Bedingungen) überstehen. Eine oftmals<br />
erweiterte Stabilität besitzen sogenannte safety-catch Linker. Ihre Besonderheit<br />
besteht darin, dass man sie vor der Abspaltung vom Harz zunächst aktivieren muss.<br />
Das heißt, sie sind zunächst in ihrer Ausgangsform inert und werden erst während<br />
des vorletzten Syntheseschritts unter speziellen Bedingungen chemisch aktiviert.<br />
Diese Aktivierung erlaubt anschließend eine Freisetzung des gewünschten Produkts<br />
unter milden Bedingungen. Ein auf diesem Prinzip beruhender Linker ist der<br />
Arylhydrazin-Linker. Die Hydrazid-Gruppe wurde bereits vor vierzig Jahren als<br />
Carboxyl-Schutzgruppe in der Peptidsynthese eingesetzt [51, 52] und findet heute als<br />
Linker in der SPPS Verwendung. [53] Der Arylhydrazin-Linker ist inert zu den<br />
Abspaltbedingungen der Boc-, Fmoc- und Alloc-Schutzgruppe. Wie in Abb. 3.17<br />
abgebildet, wird das Hydrazid erst durch Oxidation, üblicherweise mit NBS oder<br />
Cu(II)-Acetat, in die hoch reaktive Azoverbindung umgewandelt, welche mit<br />
Nucleophilen unter Spaltung des Linkers abreagiert. Auf diesem Weg können je nach<br />
verwendetem Nucleophil C-terminale Peptidsäuren, [54] -ester, [54, 55] [54, 56]<br />
-amide,<br />
-thioester, [56] -p-nitrophenole, [57] -lipide [58] und cyclische Peptide [59] erhalten werden.<br />
Abb. 3.17 Abspaltung des Arylhydrazin-Linkers. Erst nach oxidativer Aktivierung kann mit<br />
einem Nucleophil das Peptid vom Harz gespalten werden.<br />
31
3 Sollbruchstellen<br />
Um die Eignung des Arylhydrazin-Linkers für unsere Zwecke zu untersuchen, wurde<br />
zunächst nach optimalen Abspaltbedingungen gesucht. Da die Abspaltung der<br />
Peptidleiter (durch partiellen Edman-Abbau an der festen Phase erzeugt) als letzter<br />
Schritt vor der massenspektrometrischen Charakterisierung erfolgen soll, wurde<br />
versucht, über das Nucleophil beim Abspalten ein Bromisotopenlabel einzuführen.<br />
Durch das somit im Molekül enthaltene charakteristische Isotopenverteilungmuster,<br />
wird die Auswertung der Massenspektren erleichtert. Zunächst wurde das<br />
kommerziell erhältliche Fmoc-geschützte Arylhydrazin-Harz 34 mit Fmoc-βAla-OH<br />
beladen. Zum Drosseln der Beladungsdichte wurde eine Mischung aus Fmoc- und<br />
Boc-βAla-OH (1:1) verwendet. Für die zu untersuchende Abspaltung wurde der<br />
Linker durch Behandlung mit einer Lösung aus NBS, Pyridin und DCM aktiviert und<br />
anschließend mit verschiedenen Nucleophilen umgesetzt (Abb. 3.18).<br />
Abb. 3.18 Das kommerziell erhältliche NovaSyn-TG-Harz 34 wurde mit Aminosäure<br />
beladen. Zur Optimierung der Abspalt-Bedingungen wurde das Harz nach<br />
oxidativer Aktivierung mit folgenden Nucleophilen behandelt: Methanol (35), 2-<br />
Brombenzylalkohol (36), 4-Brombenzylalkohol (37) und 4-Bromanilin (38).<br />
Eine RP-HPLC Analyse der NBS-Aktivierungslösung ergab, dass das Harz während<br />
und nach der Aktivierung äußerst hydrolyseempfindlich ist. Bei Verwendung von<br />
nicht ausreichend wasserfreien Reagenzien wurde die Aminosäure bereits vor<br />
Zugabe des Nucleophils als freie Säure vom Harz abgespalten. Unter Verwendung<br />
der Alkohole 35-37 als Nucleophile zeigte die Analyse der Abspaltlösungen neben<br />
32
3 Sollbruchstellen<br />
Aminosäureestern überwiegend die hydrolysierten Aminosäuren. Gründe für die<br />
Entstehung dieser Hydrolyseprodukte könnten wiederum nicht wasserfreie<br />
Reaktionsbedingungen oder wässrig-saure HPLC-Eluenten sein. Bei der<br />
Verwendung von 36 beziehungsweise 37 als Nucleophil ist auch eine erhöhte<br />
Labilität der Benzylposition während der Ionisierung im Massenspektrometer<br />
denkbar. Verwendet man ein Amin als Nucleophil, greifen die beiden zuletzt<br />
genannten Punkte nicht, da man dann ein stabiles Amid entsteht. Wurde 4-Brom-<br />
anilin 38 als Nucleophil eingesetzt, zeigte die RP-HPLC Analyse nur wenig<br />
Aminosäure (Hydrolyse) und viel Aminosäureamid, weshalb in den darauffolgenden<br />
Experimenten 4-Bromanilin als Nucleophil zum Abspalten verwendet wurde. Um die<br />
Stabilität des Linkers in der geplanten Synthese zu testen, wurde das Peptid 39 am<br />
Synthesizer (20 µmol-Ansatz mit Leitfähigkeitsmonitoring) unter Standard-Fmoc-Be-<br />
dingungen synthetisiert. Der weitere, nicht automatisierte Syntheseweg ist in Abb.<br />
3.19 aufgeführt.<br />
Abb. 3.19 Synthese des festphasengebunden Peptids 43.<br />
Zunächst wurde die Allyl-Schutzgruppe, sowie die Fmoc-Schutzgruppe entfernt und<br />
nach Aktivierung der Carboxylgruppe mit PyBOP cyclisiert. Vom nun cyclischen<br />
Peptid 41 wurde die säurelabile Pbf-Schutzgruppe entfernt und anschließend wurde<br />
durch Behandlung mit BrCN-Lösung der Zyklus geöffnet. Zur Überprüfung der<br />
33
3 Sollbruchstellen<br />
Stabilität des Linkers, wurde die saure Pbf-Abspaltlösung und die anschließenden<br />
Waschlösungen, sowie die BrCN-Spaltlösung und alle folgenden Waschlösungen<br />
mittels MALDI-TOF-MS untersucht. In der Pbf-Abspaltlösung wurde kein Peptid<br />
gefunden; der Linker scheint unter diesen Umständen stabil zu sein. In der BrCN-<br />
Lösung wurde jedoch deutlich nachweisbar hydrolysiertes Peptid gefunden. Somit ist<br />
der Arylhydrazin-Linker nicht stabil unter den verwendeten Bedingungen und eignet<br />
sich folglich nicht.<br />
3.2.1.2 Glykolamid- und Benzamidester (HMBA) als Linker<br />
Glykolamid- und Benzamidester-Linker werden in der Literatur in zweifacher Hinsicht<br />
als stabil beschrieben. Einerseits halten sie den basischen Bedingungen der<br />
Standard-Fmoc-SPPS stand. Andererseits gelten sie auch als stabil gegenüber den<br />
säureinduzierten Seitenkettenschutzgruppenabspaltbedingungen. Die Abspaltung<br />
erfolgt unter basischen, nucleophilen Bedingungen. Auf diesem Weg lässt sich eine<br />
Vielzahl C-terminal modifizierter Peptide darstellen (Tabelle 1).<br />
Tabelle 1 Durch Behandlung mit verschiedenen nucleophilen Reagenzien kann eine<br />
Vielzahl unterschiedlicher C-terminal modifizierter Peptide erhalten werden. [60-<br />
63]<br />
Linker Reagenzien -R Ausbeute Lit.<br />
46<br />
i PrOH/H2O/NaOH -OH 93-97%<br />
46 und 45 Puffer pH 7-8,3 -OH 64-79%<br />
46 und 45 NH3/THF -NH2 90%<br />
46 und 45 NH3/MeOH -NH2 95%<br />
46 und 45 NH3/ i PrOH -NH2 58%<br />
45 H2NEt/NMP -NHEt 16%<br />
45 H2NBu/TEA/THF -NHBu 13%<br />
45 MeOH/DIPEA/DMF -OMe 32%<br />
45 PrOH/TEA/THF -OPr 25%<br />
45 H2NNH2/DMF -NHNH2 23%<br />
34<br />
[61]<br />
[63]<br />
[62]<br />
[62]<br />
[62]<br />
[60]<br />
[60]<br />
[60]<br />
[60]<br />
[60]
3 Sollbruchstellen<br />
Beide Linker wurden auf ihre Stabilität in unserem System überprüft (Abb. 3.16). Zur<br />
Bestimmung der Stabilität der Glykolamidestergruppe als Linker wurde ausgehend<br />
von TentaGel-S-NH2-Harz nach Baleux [61] das Bromacetamid-Harz 47 erhalten,<br />
welches anschließend mit der C-terminalen Aminosäure beladen wurde. [64] Zum<br />
Cappen von etwaigen freien Aminen wurde das Harz abschließend mit einer 10%-<br />
igen Essigsäureanhydridlösung behandelt. Nach dem Trocknen wurde die<br />
Beladungsdichte bestimmt (0,332 mmol/g).<br />
Abb. 3.20 Darstellung des Glykolamid-Harzes 48 zur weiteren Verwendung in der SPPS.<br />
Die Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes (NovaSyn TG) 49 mit der<br />
ersten Aminosäure erfolgte mit der MSNT/MeIm-Methode [32] (Abb. 3.21).<br />
Anschließend wurde mit Benzoylchlorid gecappt. Die ermittelte Beladungsdichte<br />
betrug 0,18 mmol/g.<br />
Abb. 3.21 Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes 49 mit der ersten<br />
Amniosäure.<br />
An beiden nun vorliegenden mit Fmoc-Alanin vorbeladenen Harzen (48 und 50)<br />
wurde mittels automatisierter Fmoc-SPPS im 20 µmol-Ansatz die kurze<br />
Peptidsequenz 51 bzw. 52 synthetisiert. Bray et al. [63] weisen darauf hin, dass<br />
während der Synthese das Peptid zum Teil vom Harz gespalten wird. In den beiden<br />
von mir durchgeführten Synthesen wurde im UV-Monitoring kein Einbruch<br />
beobachtet; somit scheint der Linker während der Peptidsynthese stabil zu sein. Um<br />
35
3 Sollbruchstellen<br />
Probleme von ungewollter Fmoc-Abspaltung unter basischen Linker-Spalt-<br />
bedingungen zu umgehen, erfolgte eine manuelle Abspaltung der N-terminal<br />
verbliebenen Fmoc-Schutzgruppe (20% Piperidin). Anschließend wurde der<br />
N-Terminus acetyliert, um das freie Amin zu cappen. Zum Abspalten des vollständig<br />
geschützten Peptids wurde ein Teil des Harzes über Nacht mit einer<br />
Propylaminlösung behandelt, gewaschen (DMF, MeOH, Wasser) und die vereinigten<br />
Lösungen eingeengt. Nach Lyophilisieren wurde das Peptid mittels RP-HPLC und<br />
anschließender ESI-Massenspektrometrie charakterisiert. Für darauffolgende<br />
Stabilitätstests und Quantifizierungen wurde eine definierte Menge Harz eingewogen,<br />
die säurelabilen Schutzgruppen abgespalten, das Harz den zu untersuchenden<br />
Reaktionsbedingungen ausgesetzt und das Peptid anschließend abgespalten. Durch<br />
Integration des Produktpeaks im RP-HPLC-Chromatogramm (bei tR=15,4 min)<br />
konnte das Peptid quantifiziert werden.<br />
36<br />
Abb. 3.22 Eichgerade der Glycolamidester-Datenreihe. Für die Datenreihe in magenta<br />
wurden 2,4 mg 52 eingewogen. Die blaue Datenreihe entstammt einer<br />
Einwaage von 1,7 mg 52.
3 Sollbruchstellen<br />
Zur Erstellung der Eichgeraden wurden pro Harz zwei definierte Mengen<br />
Peptidylharz eingewogen, abgespalten und anschließend pro Einwaage eine<br />
Peptidlösung erstellt. Daraus wurden HPLC-Läufe mit 25, 30 und 50 µl<br />
Injektionsvolumen durchgeführt. Dabei wurde angenommen, dass beide Linker<br />
während der säureinduzierten Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen stabil sind<br />
und dass die abschließende Spaltung des Peptids vom Harz quantitativ verläuft.<br />
Beim näheren Betrachten der Eichgeraden (Abb. 3.22) fällt auf, dass die ermittelten<br />
Werte, die aus derselben Lösung, aber unterschiedlichen Injektionsvolumina<br />
entstanden sind, sehr gut auf einer Gerade liegen. Zwischen den verschiedenen<br />
Lösungen gibt es jedoch deutliche Unterschiede, vor allem im Fall der beiden<br />
Glycolamidester-Harz Datenreihen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass der Fehler<br />
nicht bei der HPLC-Anlage (Präzision der Probeninjektion, Ermittlung der<br />
Peakfläche), sondern bereits zuvor gesucht werden muss. Hier gibt es viele mögliche<br />
Fehlerquellen, wie das ungenaue Einwiegen (verursacht zum Beispiel durch fehlende<br />
Wägepräzision und/oder statische Aufladung), eine nicht hundertprozentig<br />
reproduzierbare Abspaltreaktion und die anschließende Probenpräparation<br />
(Löslichkeit, Pipettieren). Da das Ziel eine Abschätzung der Linkerstabilität bei<br />
verschiedenen Reaktionsbedingungen war, liegen die Messwerte dennoch in einem<br />
verwertbaren Rahmen. Aus den erhaltenen Werten kann abgelesen werden, ob die<br />
Behandlung mit den getesteten Bedingungen problematisch ist. In Folge dessen<br />
kann abgeschätzt werden, ob mit einem Verlust des Peptids von der festen Phase zu<br />
rechnen ist.<br />
Der Blick in Tabelle 2 zeigt, dass beide Linker nicht die gewünschte Stabilität<br />
besitzen. Der größte Verlust des Peptids vom Harz wurde in beiden Fällen bei der<br />
Behandlung mit TBS-Puffer beobachtet. Während eines typsichen Screenings-<br />
prozesses findet unter diesen Bedingungen üblicherweise eine durch AP-katalysierte<br />
enzymatische Anfärbereaktion zum Visualisieren der Rezeptor-Ligand-<br />
Bindungsreaktion statt. Um dieses Problem zu umgehen, könnte man statt eines AP-<br />
Konjugats ein Peroxidase-Konjugat verwenden, wodurch die Änderung des pH-<br />
Wertes ins Alkalische überflüssig werden würde. Neben der Instabilität bei TBS-<br />
Puffer, weisen beide Linker eine Labilität gegenüber TFA auf. Im Einzelnen<br />
37
3 Sollbruchstellen<br />
Zweck<br />
Tabelle 2 Quantifizierung des Peptids 53 nach Behandlung mit den aufgelisteten<br />
Reaktionsbedingungen, zur Ermittlung der Stabilität der Linker.<br />
Reaktions-<br />
bedingung<br />
Reaktions-<br />
zeit<br />
Ausbeute in %<br />
(Mittelwert ± Standardabweichung)<br />
Glycolamidester HMBA<br />
Eichgerade 102 ± 22 101 ± 10<br />
Ringöffnung BrCN in TFA aq. 17,5 h 48 ± 6 67 ± 9<br />
Partieller<br />
Edman-Abbau<br />
(PED)<br />
Screening<br />
Seitenketten-<br />
schutzgruppen<br />
Pyridin 17 h 114 ± 17 91 ± 10<br />
Pyr/Wasser/NEt3 1 h 86 ± 15 91 ± 14<br />
PITC/FmocOSu 1 h 106 ± 18 82 ± 8<br />
TFA 18 h 30 ± 5 15 ± 2<br />
PBS-Puffer (pH 7.4) 19 h 59 ± 7 92 ± 12<br />
TBS-Puffer (pH 9.0) 1 h 9 ± 1 47 ± 3<br />
Guanidinium HCl 15 min 100 ± 17 93 ± 10<br />
TFA/TIS/Wasser 3 h 98 ± 15 73 ± 6<br />
Pd(PPh3)4/DMB 2x30 min 116 ± 18 110 ± 10<br />
betrachtet scheint dies mit einer Stabilität von zwei Dritteln noch vertretbar. Da TFA<br />
aber bei der Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, dem partiellen Edman-<br />
Abbau und der Bromcyan-Spaltung verwendet wird, fällt die Labilität in der Summe<br />
zu stark ins Gewicht. Somit werden auch diese beiden Linker als nicht geeignet<br />
betrachtet.<br />
Wie erwartet zeigte sich die Suche nach einem geeigneten Linker als schwierig.<br />
Sowohl der Arylhydrazin-Linker, als auch der Glykolamid- beziehungsweise der<br />
Benzamidester-Linker erwiesen sich als nicht hinreichend stabil unter den von uns<br />
verwendeten Bedingungen. Es konnte kein Linker gefunden werden, der die<br />
Umsetzung der Methionin-Sollbruchstelle und den anschließenden partiellen Edman-<br />
Abbau an der festen Phase ermöglicht.<br />
38
3 Sollbruchstellen<br />
39
3 Sollbruchstellen<br />
3.3 Tryptophan als Sollbruchstelle<br />
Tryptophan besitzt durch seinen reaktiven Indolring in der Seitenkette das Potential<br />
zur chemoselektiven Spaltung der Polypeptidkette. Trotz einer Vielzahl<br />
beschriebener Reagenzien wurden bisher nur wenige praktikable Methoden<br />
publiziert. Das in Abb. 3.23 gezeigte BNPS-Skatol 59 (3-Brom-3-methyl-2-(2-<br />
nitrophenylthio)-3H-indol) ist das gängigste Reagenz zur Spaltung von Trp-Xaa-<br />
Bindungen (C-terminal von Trp). Es ist ein mildes und selektives Oxidationsmittel,<br />
welches unter sauren Bedingungen als Bromoniumionenquelle dient. Durch oxidative<br />
Halogenierung entsteht zunächst eine Oxotryptophan-Zwischenstufe 55. Diese<br />
reagiert zu einem Iminolacton 56. Unter den sauren Reaktionsbedingungen wird<br />
daraufhin die Polypeptidkette C-terminal von Trp gespalten. [65]<br />
40<br />
Abb. 3.23 BNPS-Skatol (59) dient als Bromoniumionenquelle. Über eine oxidative<br />
Halogenierung wird die Trp-Xaa Bindung gespalten.
3 Sollbruchstellen<br />
Die Literaturausbeuten der Spaltung zeigten eine große Variabilität (40-80%).<br />
Sowohl Zeitler et al. [66] als auch Fontana et al. [67] weisen darauf hin, dass der Erfolg<br />
der Spaltung stark vom Reinheitsgrad des Reagenzes abhängt. Es gilt daher stets zu<br />
beachten, dass es sich um ein lichtempfindliches Reagenz handelt, welches sich bei<br />
Raumtemperatur leicht zersetzt.<br />
Häufig beobachtete Nebenreaktionen sind die Oxidation von Methionin (Sulfid zu<br />
Sulfoxid), Disulfidbildung bei Cystein und eine elektrophile Bromierung von<br />
Tyrosin. [68] Durch kurze Reaktionszeiten und Verminderung der Konzentration wurde<br />
versucht, diese möglichst zu eliminieren. [69]<br />
Um die prinzipielle Einsatzmöglichkeit von Tryptophan als Sollbruchstelle in einem<br />
cyclischen Peptid zu untersuchen, wurde das festphasengebundene Peptid 63<br />
herangezogen, welches einen homodeten Zyklus aufweist. (Abb. 3.24) Die Synthese<br />
der linearen Vorläufersequenz 61 erfolgte am Peptidsynthesizer unter Standard-<br />
Fmoc-SPPS-Bedingungen. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels UV-Monitoring<br />
überprüft. Als polymerer Träger diente TentaGel, da dieser in einer späteren<br />
Anwendung der Methode aufgrund seiner guten Quelleigenschaften im wässrigen<br />
Milieu der Träger der Wahl ist. Der Linker, der das Peptid mit dem Harz verbindet,<br />
muss so gewählt werden, dass er den basischen Bedingungen während der SPPS<br />
standhält. Außerdem ist eine Stabilität unter den Abspaltbedingungen der<br />
säurelabilen Schutzgruppen und der Allyl-Schutzgruppe, sowie zur BNPS-Skatol-<br />
Spaltung notwendig. Die Wahl des Linkers fiel hierbei auf Methionin. Als Aminosäure<br />
gewährt es die erforderliche Stabilität. Lediglich bei der oxidativen Halogenierung<br />
mittels BNPS-Skatol könnte es zur Sulfoxid-Bildung kommen; dies ist jedoch mit<br />
einer Reduktion, wie in Abschnitt 4.2.3.3 beschrieben, leicht umkehrbar. Zur<br />
Erleichterung der massenspektrometrischen Charakterisierung und Sequenzierung<br />
wurde auch hier eine Massenspacersequenz –ßAla-ßAla-Arg-Phe(4Br)- am<br />
C-Terminus des Peptids aufgebaut. Diese Spacersequenz sorgt für eine molekulare<br />
Masse größer als 500 Da für alle zur Sequenzierung notwendigen Fragmente. Durch<br />
die Anwesenheit von Arginin ist eine positive Ladung im Peptid gewährleistet. Und<br />
schließlich erleichtert para-Bromphenylalanin, durch das charakteristische<br />
Isotopenverteilungsmuster von Brom, die Auswertung der Massenspektren.<br />
41
3 Sollbruchstellen<br />
Abb. 3.24 Die lineare Vorläufersequenz 61 wurde unter Standard-Fmoc-SPPS am<br />
Synthesizer dargestellt. Nach Abspaltung der Fmoc- und Allyl-Schutzgruppe<br />
erfolgte die Cyclisierung. Nach Entfernen der säurelabilen Schutzgruppen<br />
wurde das homodete Cyclopeptid 63 erhalten.<br />
Die Verknüpfung des eigentlichen cyclischen Peptids mit dem Massenspacer erfolgte<br />
über die Carbonsäure in der Seitenkette der Glutaminsäure; die C-terminale<br />
Carbonsäure war mit einer Allyl-Schutzgruppe blockiert. Der automatisierten SPPS<br />
folgte die sequenzielle Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus und der<br />
Allyl-Schutzgruppe am C-Terminus. Nach Aktivierung der C-terminalen Carbonsäure<br />
wurde das Peptid cyclisiert. Durch eine abschließende Behandlung des Peptidyl-<br />
Harzes mit TFA/TIS/Wasser wurden die säurelabilen Schutzgruppen entfernt und<br />
man erlangte das gewünschte festphasengebundene Peptid 63.<br />
42<br />
Abb. 3.25 Selektive Ringöffnung durch Umsetzung mit BNPS-Skatol.
3 Sollbruchstellen<br />
Zur anschließenden Untersuchung der BNPS-Skatol-vermittelten Trp-Xaa Ring-<br />
öffnung wurden vier gleich große Aliquote des Peptidharzes 63 (~1,4 µmol) unter-<br />
schiedlichen Reaktionsbedingungen ausgesetzt. In allen Fällen wurde das Harz mit<br />
2,8 eq. BNPS-Skatol (3,5 mM Lösung in 88% Essigsäure) behandelt, während<br />
Reaktionszeit und Temperatur jedoch variierten. Nach Reduktion von möglicherweise<br />
oxidierten Methionin-Resten wurde das Peptid durch Behandlung mit saurer BrCN-<br />
Lösung von der festen Phase gespalten (Abb. 3.25). Mittels MALDI-TOF-MS wurde<br />
der Erfolg der Spaltung bewertet. Wie in Tabelle 3 aufgeführt, wurde nach<br />
sechsminütiger Reaktionszeit in beiden Fällen eine Umsetzung zum gewünschten<br />
Produkt (Peptid 65) beobachtet. Jedoch wurde zudem noch Edukt (cyclisches Peptid<br />
64) nachgewiesen. Der jeweils intensivste Peak in beiden Massenspektren konnte<br />
der Oxotryptophan-Zwischenstufe 55 zugeordnet werden. Die Verlängerung der<br />
Reaktionszeit auf 60 Minuten führte leider nicht zur selektiven Umsetzung zum<br />
gewünschten Produkt.<br />
Reaktions-<br />
zeit<br />
6min RT<br />
6min 47°C<br />
Tabelle 3 Untersuchung der BNPS-Skatol-vermittelten Trp-Xaa-Spaltung bei unter-<br />
Temperatur<br />
schiedlichen Reaktionsbedingungen anhand von Peptid 63.<br />
MALDI-TOF-MS<br />
m/z [Int.]<br />
1398,6 m/z [47%]<br />
1414,6 m/z [87%]<br />
1430,6 m/z [54%]<br />
1398,5 m/z [54%]<br />
1414,5 m/z [78%]<br />
1430,5 m/z [36%]<br />
60min RT 1478,5 m/z [52%]] unklar<br />
Beschreibung<br />
cyclo[TrpGlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 64<br />
cyclo[Trp(O)GlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl<br />
GlyHisProGlnGlu(Trp)βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 65<br />
cyclo[TrpGlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 64<br />
cyclo[Trp(O)GlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl<br />
GlyHisProGlnGlu(Trp)βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 65<br />
60min 47°C 1414,6 m/z [67%] cyclo[Trp(O)GlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl<br />
In einem weiteren Experiment wurde die Sollbruchstelle/Linker-Strategie umgekehrt<br />
angewandt. Hierzu wurde also ein Peptid 66 synthetisiert, bei dem die Positionen von<br />
Tryptophan -jetzt als Linker- und Methionin -jetzt am N-Terminus- vertauscht wurden.<br />
Leider glückte die BNPS-Skatol-vermittelte Abspaltung des Peptids vom Harz weder<br />
nach einer Reaktionszeit von 6 min, beziehungsweise 60 min, noch nach<br />
Reaktionszeit über Nacht.<br />
43
3 Sollbruchstellen<br />
Da die gewünschte Spaltung der Trp-Xaa-Bindung nicht in zufriedenstellenderweise<br />
erzielt werden konnte, wurde diese Methode der Peptidzyklusöffnung als<br />
unzureichend selektiv bewertet und verworfen.<br />
3.4 Enzymatische Sollbruchstelle<br />
Eine weitere Möglichkeit, Peptide selektiv zu spalten, bietet der enzymatische<br />
Verdau. Ein hierzu häufig genutztes Enzym ist Trypsin. Trypsin gehört zur Gruppe<br />
der Endopeptidasen, also der Gruppe von Enzymen, die bestimmte Aminosäuren<br />
erkennen und innerhalb der Peptidkette selektiv die Peptidbindung spalten. Die<br />
Trypsin-katalysierte Spaltung der Peptidbindung erfolgt C-terminal nach Lysin,<br />
Arginin und modifiziertem Cystein. Aufgrund der strukturellen Anordnung im aktiven<br />
Zentrum, und dem daraus resultierenden Spaltmechanismus, gehört Trypsin in die<br />
Unterfamilie der Serinproteasen, bei denen ein Serin-Rest das Peptid nucleophil in<br />
der katalytischen Spaltung angreift. Unter basischen Bedingungen, pH 7-8, arbeitet<br />
das Enzym am effektivsten.<br />
Trypsin besteht aus 224 Aminosäuren (23,8 kDa) und ist somit ein eher kleines<br />
Protein. Dennoch stellt sich die Frage, ob Trypsin überhaupt in der Lage ist, ins<br />
Innere der TentaGel-Harzkugel vorzudringen. Dieser Frage gingen Quarrell et al.<br />
nach. [70] Anhand ihrer Ergebnisse aus konfokaler Lasermikroskopie und NMR-<br />
Studien treffen sie die Aussage, dass Enzyme in der Lage sind, TentaGel zu<br />
durchdringen und dabei ihre biologische Aktivität nicht verlieren. Einen guten<br />
Überblick zum Thema „enzymatische Reaktionen an der festen Phase“ gibt ein<br />
Übersichtsartikel von Basso. [71]<br />
Zur Überprüfung der Anwendbarkeit einer enzymatischen Sollbruchstelle in unserem<br />
System wurde am Peptidsynthesizer das lineare Vorläuferpeptid 67 unter Standard-<br />
Fmoc-SPPS-Bedingungen an TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.26). Als Linker<br />
diente Methionin. Nach Abspaltung der Allyl-Schutzgruppe am C-terminalen Ende<br />
der Glutaminsäure, sowie der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus,<br />
44
3 Sollbruchstellen<br />
erfolgte die Cyclisierung des Peptids. Das nun vorliegende rückgratcyclisierte Peptid<br />
71 konnte auf enzymatische Spaltung hin untersucht werden.<br />
Zunächst wurde das cyclische, noch am Harz gebundene Peptid 71 über Nacht mit<br />
Trypsin behandelt. Die anschließende Abspaltung vom Harz und Charakterisierung<br />
mittels HPLC, MALDI und ESI-MS ergaben keine Öffnung des Peptidrings durch<br />
Trypsin. Auch eine Wiederholung des tryptischen Verdaus in Lösung ergab keine<br />
Ringöffnung. Möglicherweise verhilft die Cyclisierung dem Peptid zu einer<br />
enzymatischen Stabilität. Zhao et al. berichten von Peptiden, welche in der linearen<br />
Form einfach mit Trypsin spaltbar sind, jedoch in cyclischer Form vorliegend völlig<br />
stabil sind. [72] Bei den von mir durchgeführten Experimenten handelte es sich um<br />
erste Versuche der prinzipiellen Spaltung. Da jedoch keinerlei Reaktion<br />
nachgewiesen werden konnte, wurde von weiteren Experimenten mit enzymatischem<br />
Verdau abgesehen.<br />
Abb. 3.26 Synthese des festphasengebundenen Cyclopeptids 71, welches durch die<br />
Behandlung mit Trypsin zum linearen Peptid 73 überführt werden soll.<br />
45
3 Sollbruchstellen<br />
3.5 Ringöffnung durch Edman-Abbau<br />
Eine weitere Möglichkeit, cyclische Peptide chemisch zu spalten, bietet die Chemie<br />
des Edman-Abbaus. Diese Art der chemoselektiven Ringöffnung wurde in unserer<br />
Arbeitsgruppe bereits mehrfach angewandt. [73-75] Hierzu werden Peptide verwendet,<br />
bei denen die Cyclisierung über die Seitenketten erfolgte, so dass der N-Terminus<br />
frei zugänglich bleibt. Behandelt man solche Peptide mit den im Edman-Abbau<br />
verwendeten Reagenzien, so erhält man ein lineares Peptid. Das N-terminal<br />
gespaltene Phenylthiohydantoin-Derivat verbleibt über die Seitenkettenverbrückung<br />
im Peptid gebunden (Abb. 3.27).<br />
Abb. 3.27 Erfolgt die Cyclisierung über die Seitenketten, kann ein freier N-Terminus<br />
erhalten werden. Somit ist das cyclische Peptid für den Edman-Abbau<br />
zugänglich.<br />
In unserer Arbeitsgruppe erfolgte die Peptidsequenzierung bisher über Mikro-<br />
sequenzierung, also den klassischen automatisierten Edman-Abbau, der von<br />
externen Laboratorien durchgeführt wurde. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es mir,<br />
diese Sollbruchstelle in den partiellen Edman-Abbau zu integrieren. Eine ausführliche<br />
Beschreibung dazu befindet sich in Abschnitt 4.2.<br />
46
4 Analytik<br />
4 Analytik<br />
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, müssen cyclische Peptide vor ihrer<br />
Sequenzanalyse in lineare Peptide überführt werden. Im vorhergehenden Kapitel<br />
wurden verschiedene Wege aufgezeigt und diskutiert, um eine solche Umwandlung<br />
zu realisieren. Das nun folgende Kapitel beschäftigt sich mit der Frage: Welche<br />
Aminosäurensequenz hat das cyclische, beziehungsweise vormals cyclische, Peptid,<br />
das auf dem Hitbead gebunden war?<br />
4.1 De-novo-Sequenzierung<br />
Die De-novo-Sequenzierung von Peptiden ist ein Verfahren zur Bestimmung der<br />
Aminosäuresequenz (Primärstruktur). Im Gegensatz zum in der Proteomic weit<br />
verbreiteten Peptid-Mapping stehen diesem Verfahren keinerlei Vorkenntnisse<br />
hinsichtlich der DNA- oder Proteinsequenz zur Verfügung. Das heißt, die<br />
Aminosäurensequenz muss nicht „nur“ bestätigt werden, sondern von Neuem (lat.<br />
De novo) -im Sinne von „von Grund auf“- gefunden werden. Diese Sequenz-<br />
verifizierung wird mittels Massenspektrometrie durchgeführt. [76]<br />
Abb. 4.1 Komponenten eines Massenspektrometers.<br />
47
4 Analytik<br />
Abb. 4.2 a) Fragmentierungsschema mit Nomenklatur nach Roepstorff und Biemann.<br />
b) Schema zur sequenzspezifischen Fragmentierung eines Peptids. Durch<br />
Spaltung der Peptidbindung entstehen b- und y-Fragmente als<br />
Produktionen. [76]<br />
Jedes Massenspektrometer besteht, vereinfacht dargestellt, aus einem Interface,<br />
also einer Aneinanderkopplung von Bauteilen (Abb. 4.1). In der ersten Einheit, der<br />
Ionenquelle, werden die Ionen generiert. In der zweiten Einheit, dem<br />
Massenanalysator, werden die Ionen gesammelt und anschließend entsprechend<br />
ihres Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z-Wertes) an die dritte Einheit, den<br />
Detektor, entlassen. Um eine De-novo-Sequenzierung durchführen zu können, muss<br />
das Massenspektrometer die Fähigkeit besitzen, intakte Peptidionen isolieren zu<br />
können, welche anschließend absichtlich in Fragmente gespalten werden. Die<br />
Fragmentierung verläuft hauptsächlich entlang der Peptidkette (Abb. 4.2). Verbleibt<br />
bei der Spaltung die Ladung an den Fragmenten der N-terminalen Serie, so werden<br />
die entsprechenden Fragmente mit a, b, c indiziert. Verbleibt die Ladung dagegen an<br />
den Fragmenten der C-terminalen Serie, werden sie mit x, y, z bezeichnet. Ein<br />
zusätzlicher Index gibt die Zahl der im Fragmention enthaltenen Aminosäurereste an.<br />
Daher läuft dieser Index für die a-, b- und c-Serie in umgekehrter Reihenfolge zur x-,<br />
y- und z-Serie. Diese Benennungsregeln sind als Roepstorff-Fohlman-Biemann-<br />
Nomenklatur bekannt. Bei höherer Fragmentierungsenergie treten noch zusätzliche<br />
48
4 Analytik<br />
Fragmentionen der Seitenketten auf. [77, 78] Aus den Fragmentspektren können dann<br />
Informationen über die Primärstruktur abgeleitet werden. [45]<br />
In der hier vorliegenden Arbeit wurden die MS(n)-Experimente zur De-novo-<br />
Sequenzierung an einem Esquire3000 plus -Massenspektrometer (Bruker Daltonics)<br />
durchgeführt. Das Gerät verfügt über eine API-ESI (atmospheric pressure interface-<br />
electrospray ionization)-Quelle (Abb. 4.3). Hier werden die Ionen generiert, fokussiert<br />
und anschließend zur Ionenfalle transportiert. Die Elektrosprayionisierung findet bei<br />
Atmosphärendruck statt, die anschließende Analyse jedoch im Hochvakuum, was<br />
über eine spezielle Schnittstelle realisiert wird. Das Herzstück des Gerätes bildet die<br />
elektrische Ionenfalle (ion trap, also der Massenanalysator). Hier werden die Ionen in<br />
einem geeigneten elektrischen Feld gefangen gehalten. Die Ionen können für<br />
variable Zeit (Mikrosekunden bis Sekunden) auf stabilen Bahnen gehalten werden.<br />
Zur Aufnahme eines gewöhnlichen Spektrums werden die Ionen schließlich mit Hilfe<br />
von Multipolfeldern nach ansteigendem m/z-Wert aus der Falle ejiziert und mit einer<br />
Konversionsdynode mit Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) nachgewiesen.<br />
Möchte man hingegen ein MS(n)-Experiment zur De-novo-Sequenzierung<br />
durchführen, so muss zunächst das gewünschte intakte Peptidion in der Ionenfalle<br />
isoliert werden. Durch Einstrahlung eines breiten Frequenzspektrums, welches eine<br />
Lücke bei der Resonanzfrequenz des gewünschten Ions besitzt, werden alle anderen<br />
Ionen aus der Ionenfalle entfernt, so dass nur noch das gewünschte Ion (precursor-<br />
ion, Mutter-Ion) vorliegt. Anschließend wird das isolierte Mutter-Ion mit seiner<br />
Resonanzfrequenz angeregt. Die Amplitude bleibt dabei jedoch so gering, dass das<br />
Ion nicht aus der Ionenfalle katapultiert wird. Das so angeregte Ion kollidiert mit in der<br />
Falle befindlichen Heliumatomen, was schließlich zur Fragmentierung führt. Diese<br />
Fragmentierung wird als CID (collision induced dissociation) bezeichnet. [79] Durch<br />
anschließende Massenanalyse wird ein Fragment-Spektrum erhalten. Um den Ablauf<br />
aufzuzeigen, bezeichnet man solche Spektren mit MS („Anzahl der<br />
Isolierungsschritte +1“)/ „Masse des isolierten Ions“. Der Prozess aus Isolierung der<br />
gewünschten Ionenspezies, Fragmentierung und anschließender Massenanalyse<br />
kann mehrfach wiederholt werden. MS(3)/ 966,4 ->572,2 m/z steht beispielsweise für<br />
folgenden Ablauf: Das Ion mit 966,4 m/z wurde isoliert und fragmentiert,<br />
anschließend wurde das dabei entstandene Ion mit 572,2 m/z isoliert und ebenfalls<br />
fragmentiert.<br />
49
4 Analytik<br />
Abb. 4.3 Aufbau des Esquire3000 plus -Massenspektrometers.<br />
4.1.1 Massenspektrometrische Untersuchung der Bibliothek von<br />
cyclischen Peptiden mit photolabiler Sollbruchstelle<br />
Zur massenspektrometrischen Charakterisierung der Bibliothek mit photolabiler<br />
Sollbruchstelle (Peptide 8-12, Synthese in Abschnitt 3.1) wurden die cyclischen<br />
Peptide getrennt voneinander einzeln untersucht. Zur Probenpräparation wurden ca.<br />
5 mg Peptidylharz herangezogen und analog einer Testabspaltung verfahren. Die<br />
anschließend durchgeführten MS(n)-Experimente ergaben, dem ersten Anschein<br />
nach, vielversprechende Resultate. Aus den erhaltenen Spektren, mit Ausnahme des<br />
Spektrums von Peptid 12, konnte über die Massendifferenzen die Sequenz-<br />
information ausgelesen werden und die Peptide der Bibliothek somit eindeutig<br />
unterschieden werden. Bei genauerem Auswerten musste jedoch festgestellt<br />
werden, dass die absoluten m/z-Werte keiner Struktur zugeordnet werden konnten.<br />
50
4 Analytik<br />
Abb. 4.4 MS(2) Spektrum von Peptid 9 (cyclo[Pll-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu]-Lys-NH2)<br />
nach Isolierung und Fragmentierung des intakten Mutter-Ions bei 966,4 m/z.<br />
Abb. 4.4 zeigt, exemplarisch für die Bibliothek, ein MS(2)-Spektrum von Peptid 9.<br />
Wie bereits erwähnt, kann man aus den Massendifferenzen die gewünschte Peptid-<br />
sequenzinformation erhalten. Im Spektrum wurden die m/z-Werte 345,2 und 776,3<br />
rot hervorgehoben. Diese stellen in allen erhaltenen Spektren den Start- bzw<br />
Endpunkt der „Differenzleiter“ dar. Eine molekulare Strukturzuweisung dieser Werte<br />
gelang jedoch nicht. Da es sich bei den eingesetzten Analyten immer um cyclische<br />
Peptide mit intakter photolabiler Sollbruchstelle handelte, ist vermutlich mit einer<br />
Modifikation an dieser „labilen“ Stelle zu rechnen. Die anschließende kinetische<br />
Untersuchung der photolytischen Peptidringöffnung und die NMR-Studien zeigten<br />
jedoch, dass dieses photolabile System nicht geeignet ist. Eine ausführliche<br />
Beschreibung hierzu befindet sich in Abschnitt 3.1.<br />
4.1.2 Massenspektrometrische Untersuchung nach Anwendung<br />
der Met-Sollbruchstelle<br />
Wie in Abschnitt 3.2 beschrieben, konnte anhand des an SieberAmid-Harz<br />
gebundenen Cyclopeptids 31 gezeigt werden, dass sich die Bromcyan-vermittelte<br />
Peptidspaltung zur Cyclopeptidringöffnung nutzen lässt. Zur Vorbereitung der<br />
massenspektrometrischen Sequenzierung wurde eine kleine Menge des harz-<br />
gebundenen cyclischen Peptids 31 (Abb. 3.14) mit BrCN-Lösung behandelt, so dass<br />
eine simultane Ringöffnung und Harzabspaltung erfolgte. Für die Messung wurde<br />
51
4 Analytik<br />
eine Lösung des geöffneten Cyclopeptids 33 ohne vorhergehende Aufreinigung<br />
herangezogen. Das Massenspektrum in Abb. 4.5 oben zeigt das einfach und<br />
zweifach geladene Ion des vormals cyclischen Peptids 33. Die Pbf-Schutzgruppe in<br />
der Arginin-Seitenkette blieb trotz der sauren Bedingungen während der BrCN-<br />
Spaltung im Molekül erhalten. Außerdem weist das Spektrum noch einen Peak auf,<br />
der dem cyclischen Peptid 31 mit oxidiertem Methionin (Methioninsulfoxid)<br />
zugeordnet werden kann. Die Oxidation kann ungewollt während der Kettenver-<br />
längerung der SPPS, der Lagerung oder der Behandlung mit Säure vonstatten<br />
gehen. Da Methioninsulfoxid nicht für die BrCN-Spaltung zugänglich ist, bleibt der<br />
Zyklus in diesem Fall bestehen. Die Ringöffnung des nicht oxidierten cyclischen<br />
Peptids verlief vollständig. Um auch den oxidierten Peptidring mit Bromcyan öffnen<br />
zu können, müsste das Methioninsulfoxid zunächst zu Methionin reduziert werden<br />
(mehr dazu in Abschnitt 4.2.3.3).<br />
52<br />
Abb. 4.5 Oben: „Gewöhnliches“ ESI-Massenspektrum des geöffneten Cyclopeptids 33.<br />
Unten: MS(2)-Spektrum nach Isolierung des Mutter-Ions (1333,1 m/z) und<br />
anschließender Fragmentierung.
4 Analytik<br />
Tabelle 4 Peakliste der erhalten Spektren. Fett hervorgehoben sind die Ionen, die im<br />
MS(n) Isoliert<br />
m/z<br />
nächsten Schritt isoliert und anschließend fragmentiert wurden.<br />
Fragmente<br />
m/z (Int.)<br />
2 1333,1 1316,1 (21%)<br />
1205,0 (100%)<br />
1063,0 (76%)<br />
3 1205,0 1187,9 (36%)<br />
934,8 (100%)<br />
1107,8 (0,4%)<br />
1050,9 (4%)<br />
903,7 (2%)<br />
691,6 (19%)<br />
4 934,8 917,8 (66%)<br />
820,7 (22%)<br />
763,6 (27%)<br />
616,5 (100%)<br />
Beschreibung<br />
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)<br />
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2<br />
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg<br />
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)<br />
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg<br />
H-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2<br />
H-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2<br />
H-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2<br />
H-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2<br />
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z<br />
H-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z<br />
H-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z<br />
H-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z<br />
Ausgehend von einem „gewöhnlichen“ Massenspektrum wurde zunächst immer das<br />
einfachgeladene Ion isoliert und fragmentiert, welches den intensitätsstärksten Peak<br />
im Spektrum lieferte. Dies ergab folgende MS(n)-Reihe: MS -> MS(2)/1333,1 m/z<br />
-> MS(3)/ 1205,0 m/z -> MS(4)/ 934,8 m/z. Auf gleiche Weise wurde mit dem<br />
zweifach geladenen Ion verfahren (MS -> MS(2)/ 667,1 m/z -> MS(3)/603,0 m/z<br />
-> MS(4)/467,9 m/z). Addiert man alle gemessenen MS(n)-Spektren auf, erhält man<br />
das in Abb. 4.6 gezeigte Spektrum. Bei A, B und C handelt es sich um ein Spektrum;<br />
der Übersicht halber wurden die y-Fragmentreihe (A), die b-Fragmentreihe (B), sowie<br />
die Reihe der y-Fragmentionen ohne Pbf-Schutzgruppe und ohne C-terminale<br />
Aminogruppe (C) getrennt voneinander hervorgehoben. Trägt man alle dabei<br />
gefundenen Sequenzinformationen zusammen, so ergibt sich die vollständige<br />
Sequenz. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass eine vollständige<br />
Zuordnung nur deshalb gelang, weil die Sequenz, und somit die gesuchten<br />
Fragmente, aus der Synthese bekannt waren. Eine Sequenzzuordnung aus einem<br />
kombinatorischen Ansatz wäre aus diesen Spektren sicherlich nicht möglich<br />
gewesen, da ein sehr großer Teil der Sequenzinformation auf intensitätsschwachen<br />
Signalen beruht und aus den deutlich erkennbaren Signalen nur wenig Information<br />
gezogen werden kann. Das MS(2)-Spektrum nach Isolierung und Fragmentierung<br />
53
4 Analytik<br />
des intakten Peptidions (in Abb. 4.5 unten) verdeutlicht diese Tatsache. Sieht man<br />
von der Fragmentierung der Pbf-Schutzgruppe und der Aminofunktion am C-<br />
Terminus ab, ist das Mutterion (intaktes Peptid) im Wesentlichen nur an einer Stelle<br />
gebrochen, nämlich N-terminal zu Prolin. Die weitere Fragmentierung dieses Ions<br />
(MS(3)-Spektrum) ergab zwar Informationen über die Sequenz, jedoch handelt es<br />
sich dabei um Signale mit einer Intensität von 0,4-19% (Tabelle 4). Die Information<br />
wurde also mehr gesucht als gefunden. Hiermit sind wir an einer Schwachstelle der<br />
De-novo-Sequenzierung angelangt.<br />
Eine ideale Dissoziationsmethode sollte die Bindungen des Peptidrückgrats wahllos<br />
brechen, unabhängig von Peptidlänge, Ladung, m/z-Verhältnis, sterischer Anord-<br />
nung, Aminosäurenzusammensetzung und –abfolge. Eine solche Methode existiert<br />
jedoch nicht. [80] Während der stoßinduzierten Fragmentierung (CID) wird dem<br />
Mutterion in sehr kurzer Zeit (Pico- bis Mikrosekunden) Energie zugeführt, was zum<br />
Bruch der schwächsten Bindung im Molekül führt. Diese schwächste Bindung ist eine<br />
protonierte Amidbindung. Innerhalb eines Peptids besitzen Amidstickstoffe jedoch<br />
unterschiedliche pKb-Werte; somit unterscheiden sie sich in ihrer Labilität und<br />
verhalten sich nicht ideal. [81] Die N-terminale Seite von Prolin gilt als äußerst labile<br />
Stelle. Diese Beobachtung wird in der Literatur als Prolin-Effekt bezeichnet [82] . Hier<br />
führt nicht, wie früher angenommen, die Protonenaffinität von Prolin zur<br />
Fragmentierung, sondern die sterische Instabilität der Prolin-Bindung. [83-85] Es<br />
existiert eine Vielzahl von zum Teil kontrovers diskutierten massenspektrometrischer<br />
Fragementierungsmechanismen, einige davon wurden von Zhang [81] zusammen-<br />
getragen.<br />
Ein weiterer kritischer Punkt ist die Probenkonzentration und -menge. Alle in der<br />
Arbeit durchgeführten De-novo-Sequenzierungsexperimente erfolgten nach einer<br />
Testabspaltung vom Harz. Hierzu wurde das Peptid von 0,5-10 mg Harz, was in etwa<br />
400-8000 Harzkugeln entspricht, abgespalten und anschließend in 50-100 µl<br />
Lösungsmittel aufgenommen. Bei einem kombinatorischen Ansatz stünde jedoch nur<br />
eine einzige Harzkugel zur Verfügung. Zur erfolgreichen Durchführung der MS(n)-<br />
Experimente am für diese Arbeit zur Verfügung stehenden Massenspektrometer<br />
(Esquire3000 plus ohne Nanoquelle) werden ca. 50 µl Probenlösung benötigt. Dies<br />
würde einer 3 µM-Lösung entsprechen, was unter der Nachweisgrenze des Geräts<br />
liegt.<br />
54
4 Analytik<br />
Abb. 4.6 Summe aller MS(n)-Spektren. A, B und C zeigen jeweils ein und dasselbe<br />
Spektrum. Hervorgehoben sind die unterschiedlichen Fragmentionen-Reihen.<br />
Einfach- und zweifachgeladene Ionen der gleichen molekularen Masse sind<br />
durch gleiche Farbmarkierung gekennzeichnet.<br />
55
4 Analytik<br />
In Anbetracht der Inhomogenität der Fragmentierungsstellen und der geringen<br />
Probenmenge wurde ein rein massenspektrometrischer Ansatz zur Sequenzierung<br />
der Hitbead-gebundenen Peptide verworfen.<br />
4.2 Partieller Edman-Abbau (PED)<br />
4.2.1 Die Mikrosequenzierung – der klassische Edman-Abbau<br />
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Peptidsequenzen wurde bereits 1950<br />
von dem schwedischen Wissenschaftler Pehr Edman veröffentlicht. [86, 87] Bei diesem<br />
cyclischen Prozess, der unter dem Namen Edman-Abbau bekannt geworden ist,<br />
handelt es sich um eine Reaktionskaskade, bei der in jedem Reaktionszyklus vom<br />
N-terminalen Ende der Peptidkette eine endständige Aminosäure abgespalten und<br />
identifiziert wird. Die Reaktion besteht aus drei voneinander gut abgegrenzten<br />
Schritten: Kupplung, Spaltung und Konvertierung (Abb. 4.7). Im ersten Schritt, der<br />
Kupplung, wird unter leicht basischen Bedingungen (pH 9) an die freie<br />
N-terminale Aminogruppe der Peptidkette das Edman-Reagenz Phenylisothiocyanat<br />
(PITC) gekoppelt. Es entsteht ein disubstituierter Thioharnstoff, das Phenyl-<br />
carbamoylpeptid (PTC-Peptid). Nach Entfernen des überschüssigen PITC wird das<br />
getrocknete PTC mit wasserfreier Säure, üblicherweise TFA, behandelt. Dabei wird<br />
durch einen nucleophilen Angriff des Schwefelatoms an der Carboxylgruppe der<br />
ersten Peptidbindung die erste Aminosäure als heterocyclisches Derivat, eine<br />
Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure, abgespalten. Befindet sich ein Sauerstoffatom<br />
an der Stelle des Schwefels, wurde also ein Isocyanat anstelle des PITC eingesetzt,<br />
kann das Reagenz zwar auch an die Aminogruppe des Peptids kuppeln, ist aber<br />
nicht zur Ringbildung, und damit auch nicht zur Abspaltung der Aminosäure, fähig.<br />
Im letzten Schritt, der Konvertierung, erfolgt nach der Hydrolyse zur<br />
Phenylthiocarbamoylsäure eine Umlagerung unter Ringschluss zum 3-Phenyl-2-<br />
thiohydantoin (PTH)-Derivat. Die PTH-Aminosäuren können mittels RP-HPLC<br />
identifiziert werden. Durch Optimierung, Automatisierung und technische Weiterent-<br />
wicklungen liegt die Empfindlichkeit heutiger Mikrosequenzierer im femto-molaren<br />
Bereich. [45]<br />
56
N C S<br />
Phenylisothiocyanat<br />
Kupplung<br />
Spaltung<br />
Konvertierung<br />
N<br />
H<br />
S<br />
N<br />
H<br />
R 1<br />
+<br />
H<br />
N<br />
O R 2<br />
H<br />
N<br />
H S O<br />
2-Anilinothiazolin-5-on<br />
N<br />
H<br />
S<br />
N<br />
R 1<br />
H 2O/H<br />
N<br />
H<br />
OH<br />
R 1<br />
O<br />
H 2N<br />
O<br />
OH<br />
+<br />
R 1<br />
N<br />
H<br />
H<br />
N<br />
O R 2<br />
R 3<br />
Peptid<br />
O<br />
H 3N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
R 3<br />
O<br />
Phenylthiocarbamat-Addukt<br />
(PTC-Peptid)<br />
R 2<br />
H 2O<br />
Phenylthiocarbamoylsäure 3-Phenyl-2-thiohydantoin<br />
(PTH-Aminosäure)<br />
Abb. 4.7 Reaktionskaskade des Edman-Abbaus.<br />
O<br />
N<br />
H<br />
R 3<br />
O<br />
O<br />
N<br />
S<br />
N<br />
R 1<br />
H<br />
4 Analytik<br />
Peptid mit freiem<br />
N-Terminus,<br />
neue Runde im<br />
Abbauzyklus<br />
Die Mikrosequenzierung ist eine durchaus häufig in der Literatur anzutreffende<br />
Methode zur Sequenzanalyse von Hitbeads, die aus einem Screening einer OBOC-<br />
Peptidbibliothek hervorgingen. [88] Auch in unserer Arbeitsgruppe wurden Hit-<br />
[73, 74]<br />
sequenzen aus OBOC-Peptidbibliotheken mittels Edman-Abbau charakterisiert.<br />
Ein großer Nachteil dieser Methode ist jedoch der relativ hohe Zeitaufwand. Mit einer<br />
Sequenzierungsrate von bestenfalls 3-4 Hitkugeln pro Tag ist die Methode nur<br />
bedingt für einen Einsatz im Hochdurchsatzverfahren geeignet. Die Erfahrungen<br />
unserer Gruppe zeigten sogar, dass man mit nur einer Kugel pro Tag rechnen sollte.<br />
57
4 Analytik<br />
4.2.2 Partieller Edman-Abbau (PED) – die Leitersequenzierung<br />
Bereits 1993 stellten Chait et al. [26] eine Sequenzierungsmethode vor, bei der dem<br />
Edman-Reagenz (PITC) 5% Phenylisocyanat (PIC) zugesetzt wird: Somit wird das<br />
Peptid zu ca. 95% abgebaut, 5% werden jedoch gecappt; der Abbau ist also partiell.<br />
Durch diese Vorgehensweise erzeugt man eine Peptidleiter, weshalb die Methode<br />
auch als Leitersequenzierung bezeichnet wird. Im Gegensatz zum klassischen<br />
Edman-Abbau wird bei der Leitersequenzierung nicht in jedem Zyklus die<br />
abgespaltene PTH-Aminosäure nachgewiesen. Stattdessen wird nach Durchlaufen<br />
aller Abbauschritte die durch den partiellen Abbau erzeugte Peptidleiter massen-<br />
spektrometrisch charakterisiert (PED-MS). Die Leitersequenzierung darf nicht mit der<br />
Leitersynthese [16] verwechselt werden, bei der die Peptidleiter während der Synthese<br />
bereits aufgebaut wird (hierzu siehe 1.3.1).<br />
Die Gruppe um Pei übertrug die Methode der Leitersequenzierung auf<br />
festphasengebundene Peptide aus OBOC-Bibliotheken [27] . Durch die örtliche<br />
Fixierung der Peptide an die feste Phase ist eine sequenzielle Analyse nicht<br />
notwendig. Vielmehr bietet diese Methode eine parallele Abbaumöglichkeit. Das<br />
heißt, es können mehrere Peptide (Harzkugeln) gemeinsam die Chemie des Abbaus<br />
durchlaufen. Am Ende muss lediglich jede Harzkugel separiert werden, die erzeugte<br />
Peptidleiter muss vom Harz gespalten und massenspektrometrisch analysiert<br />
werden. Dieser parallele Ansatz ermöglicht einen immensen Zeitgewinn gegenüber<br />
dem klassischen Edman-Abbau. In einer Weiterentwicklung der Methode zeigte Pei,<br />
dass man unter Verwendung von Fmoc-OSu als Cappingreagenz, an Stelle von PIC,<br />
die Möglichkeit eines spurlosen partiellen Abbaus nutzen kann [89] . Dieses Vorgehen<br />
wird deshalb als spurlos bezeichnet, weil die capping-Gruppe (Fmoc) nach der<br />
Erzeugung der Leiter abgespalten werden kann. Um das Verfahren des PEDs auch<br />
für die Sequenzierung cyclischer Peptide nutzen zu können, bedienten sie sich dem<br />
biphasic approach [17] . Hierzu wird die Harzkugel in einen äußeren und einen inneren<br />
Bereich aufgeteilt. Die äußere Schale präsentiert dem biologischen Target das<br />
cyclische Peptid, während im inneren Bereich der Kugel das lineare Vorläuferpeptid<br />
einen freien N-Terminus für den Edman-Abbau bereithält. [90] Die Gruppe um Pei<br />
konnte bereits einige Cyclopeptidbibliotheken gegen diverse biologische Targets<br />
screenen und die Hitsequenzen anschließend mit dieser Methode ausfindig<br />
58
4 Analytik<br />
machen [91-94] . Mit dem biphasic approach nimmt man jedoch einen entscheidenden<br />
Nachteil auf sich. Man gibt das OBOC-Prinzip auf. Dies ist jedoch nicht sinnvoll; denn<br />
gerade von cyclischen Peptiden erhofft man sich nicht nur eine sequenzspezifische<br />
Selektivität, sondern vor allem auch eine konformative Selektivität. Das heißt durch<br />
ihre konformative Einschränkung passt das Peptid ideal in die Bindungstasche des<br />
Targets, oder aber es passt nicht. Bei der Anwendung des biphasic approachs liegt<br />
die konformative Einschränkung jedoch nur auf der Außenschale der Kugel vor.<br />
Gelingt es dem biologischen Target wider Erwarten ins Innere der Kugel<br />
einzudringen, so handelt es sich nur noch um sequenzspezifische Selektivität (dies<br />
bedeutet falsch positive Antworten). Außerdem kann durch das Aufteilen der Kugel<br />
die Vollständigkeit der Cyclisierung nicht mehr überprüft werden. Die Cyclisierungs<br />
reaktion stellt jedoch oft eine wesentliche Herausforderung während der Synthese<br />
dar. [95] In unseren Augen ist der Verlust des OBOC-Prinzip eine zu große<br />
Einschränkung, weshalb wir uns gegen diesen Kompromiss entschieden haben.<br />
4.2.3 Erweiterung des PEDs auf OBOC-Cyclopeptidbibliotheken<br />
Um auch cyclischen Peptiden einen Zugang zum PED-MS zu geben, haben wir uns<br />
für eine Seitenketten-Cyclisierung entschieden. Die Idee dabei ist, dass somit der<br />
N-Terminus des Peptids für den Edman-Abbau frei zugänglich bleibt, der Ring<br />
sozusagen über eine Sollbruchstelle verfügt (Abschnitt 3.5 und Abb. 4.8). Unterzieht<br />
man solche seitenkettencyclisierte Peptide einem partiellen Edman-Abbau, so erfolgt<br />
im ersten Abbau-Zyklus die Ringöffnung. Man erhält ein lineares Peptid, welches das<br />
N-terminal gespaltene Phenylthiohydantoin-Derivat über die Seitenketten-<br />
verbrückung gebunden mit sich trägt. Das lineare Peptid kann den Abbauzyklus<br />
erneut durchlaufen, so lange bis alle variabel besetzten Positionen bestimmt wurden.<br />
59
4 Analytik<br />
60<br />
Abb. 4.8 Das Prinzip des partiellen Edman-Abbaus von cyclischen Peptiden mit freiem<br />
N-Terminus.
4.2.3.1 Anwendung des Konzepts auf ein Modellpeptid<br />
Boc-Lys(Alloc)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(0All)- Ala-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Met<br />
1) Pd(PPh 3) 4/BH 3NHMe 2<br />
2) PyBOP/HOBt<br />
Boc-cyclo[Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]- Ala-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Met<br />
BrCN in<br />
70% TFA aq.<br />
75 76<br />
BrCN in<br />
70% TFA aq.<br />
77 78<br />
4 Analytik<br />
Abb. 4.9 Modellpeptid 77. Die Unterstriche zeigen die Aminosäuren, über deren<br />
Seitenkette die Cyclisierung erfolgte.<br />
Zur Überprüfung des Konzepts wurde zunächst ein Modellpeptid 77 synthetisiert<br />
(Abb. 4.9). Im Hinblick auf eine spätere kombinatorische Anwendung erfolgte die<br />
Synthese an TentaGel-Harz, welches optimale Quelleigenschaften in organischen<br />
und wässrigen Lösungen aufweist. Die Anforderungen an eine für das Konzept<br />
geeignete Linkergruppe sind hoch. Der Linker muss sämtlichen Bedingungen der<br />
Cyclopeptidbibliothekssynthese, des Screenings und des partiellen Edman-Abbaus<br />
standhalten (Abb. 4.10). Erst, wenn all diese Schritte durchlaufen wurden, soll eine<br />
quantitative Abspaltung der Peptidleiter von der festen Phase erfolgen.<br />
Abb. 4.10 Ein für das Konzept geeigneter Linker muss den Bedingungen der Synthese,<br />
des Screenings und des partiellen Edman-Abbaus standhalten.<br />
61
4 Analytik<br />
Unsere Wahl für den Linker fiel auf Methionin. (Die Verwendung von Methionin als<br />
Sollbruchstelle wurde in Abschnitt 3.2 ausführlich beschrieben und diskutiert). Auch<br />
in diesem Peptid wurde die bereits erwähnte Massenspacersequenz -βAla-Pro-Pro-<br />
Arg- eingebaut. Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 75 erfolgte nach<br />
Standard-Fmoc-SPPS-Bedingungen am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf<br />
wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach<br />
Abspaltung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe erfolgte die Seitenkettencyclisierung<br />
nach Aktivierung mit PyBOP. Mit der abschließenden Testabspaltung wurde das<br />
Peptid charakterisiert.<br />
Mit dem nun vorliegenden Cyclopeptid 77 wurden erste partielle Edman-Abbau-<br />
Experimente durchgeführt. Zunächst wurde mit einer größeren Menge Harz (2 mg,<br />
ca. 1.600 Harzkugeln) begonnen, um eventuelle Probleme der Nachweisempfindlich-<br />
keit zu umgehen. Im ersten Schritt erfolgte die Abspaltung der noch am Peptid<br />
vorhandenen säurelabilen Schutzgruppen (Boc und Pbf) durch eine ausführliche<br />
TFA-Behandlung der Harzkugeln. Daraufhin wurde das Harz ausgiebig mit<br />
Dichlormethan, Acetonitril und Wasser gewaschen. Das anschließende Waschen der<br />
Kugeln mit Pyridin sowie einer Mischung aus gleichen Teilen Pyridin, Wasser und<br />
0,1% Triethylamin garantierte einen unprotonierten N-Terminus. Nur wenn am<br />
N-Terminus ein freies Elektronenpaar vorliegt, kann der nucleophile Angriff an das<br />
Edman-Reagenz (PITC) erfolgen. Für die Kupplung wurde zum Harz eine unmittelbar<br />
vor dem Gebrauch hergestellte Lösung von PITC und FmocOSu in Pyridin (ca. 30:1)<br />
aufgezogen. Das festphasengebundene Peptid lag nun also als Phenylthiocarbamat-<br />
Derivat bzw. mit Fmoc gecappt vor. Der Kupplung folgten einige Waschschritte mit<br />
Pyridin, Acetonitril und Dichlormethan zum Entfernen der überschüssigen<br />
Reagenzien. Durch Behandlung des Peptidylharzes mit TFA erfolgte die Abspaltung<br />
der N-terminalen Aminosäure, so dass ein „neuer“ freier N-Terminus vorliegt. Beim<br />
ersten Abbauschritt, der Ringöffnung, verbleibt das N-terminale Aminosäurederivat<br />
über die Seitenkettenverbrückung im Molekül erhalten. Bei den darauffolgenden<br />
Zyklen wurde die jeweils entstehende Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure aus dem<br />
Molekül gespalten und anschließend weggewaschen. Durch Waschen der Harz-<br />
kugeln und Einstellen basischer Bedingungen begann ein neuer Abbauzyklus.<br />
62
4 Analytik<br />
Abb. 4.11 MALDI-TOF Massenspektrum der durch partiellen Edman-Abbau erzeugten<br />
Peptidleiter des Modellpeptids 77. Aus den Differenzen der Signale kann die<br />
Peptidsequenz ausgelesen werden.<br />
Der Zyklus wurde so oft wiederholt, bis alle variablen Positionen (deren Anzahl ist<br />
aus der Split-Mix-Synthese bekannt) abgebaut und dadurch die Peptidleiter erzeugt<br />
wurde. Der letzten TFA-Behandlung folgte eine ausgiebige Waschprozedur mit<br />
Dichlormethan, Pyridin und nochmals Dichlormethan. Um den spurlosen Abbau zu<br />
verwirklichen, wurde schließlich das Fmoc-Capping durch Behandlung des Harzes<br />
mit 20% Piperidin in DMF aufgehoben. Zur Abspaltung der Peptidleiter vom Harz<br />
wurde dieses über Nacht mit einer Lösung aus BrCN in 70% TFA aq. behandelt. Das<br />
anschließend erhaltene MALDI-TOF-Massenspektrum der Peptidleiter ist in Abb.<br />
4.11 zu sehen. Aus dem Spektrum kann die vollständige Sequenzinformation<br />
ausgelesen werden. Vergleicht man jedoch die gemessenen m/z-Werte mit den<br />
theoretisch errechneten Werten der Peptidleiter, so fällt auf, dass diese um minus<br />
16 m/z verschoben erhalten wurden. Erst nach dem Abspalten des seitenketten-<br />
verbrückten Glutaminsäure-Lysin-PTH-Derivats stimmen die errechneten und die<br />
ermittelten Massen überein. Diese Beobachtung lässt auf eine Modifikation des im<br />
63
4 Analytik<br />
Peptid gebundenen PTH-Derivats rückschließen. Die Vermutung, dass es sich hier-<br />
bei um einen Schwefel-Sauerstoff-Austausch handeln könnte, konnte durch Hinweise<br />
aus der Literatur bekräftigt werden. So berichtet Edman von folgender<br />
Beobachtung: [96] Eine nicht vollständig umgesetzte Probe von PTC-Leucin wurde im<br />
Luftgegenstrom eingeengt. Das anschließend gemessene UV-Absorptionsspektrum<br />
unterschied sich deutlich von PTC-Leucin und PTH-Leucin. Die Iod-Azid-Reaktion<br />
zum Nachweis von Schwefel zeigte, dass die vorliegende Verbindung keinen<br />
Schwefel mehr enthielt. Ein Vergleich mit dem UV-Absorptionsspektrum von<br />
Phenylcarbamoyl-Leucin zeigte, dass es sich um diese Verbindung handelt.<br />
Innerhalb eines Abbaus bedeutet diese Umwandlung den Abbruch des Zyklus, denn<br />
nur Schwefel ist nucleophil genug für die Spaltung. Da vermutlich alle PTC-<br />
Aminosäuren diese Tendenz zur oxidativen Entschwefelung zu Phenylcarbamyl-<br />
Aminosäuren aufweisen, empfiehlt Edman den Einsatz einer Schutzgasatmosphäre<br />
(Argon). [96]<br />
4.2.3.2 Modellstudie in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion<br />
H 2N<br />
79<br />
O<br />
OH<br />
PITC in<br />
Pyridin/Wasser<br />
55°C<br />
N<br />
H<br />
S<br />
80<br />
N<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
100% TFA<br />
60 min / RT<br />
S<br />
N<br />
Ph<br />
81<br />
H<br />
N<br />
O<br />
TFA<br />
Wasser<br />
Pyridin/Wasser<br />
BrCN in<br />
70% TFA aq.<br />
N<br />
Ph<br />
O<br />
N<br />
Ph<br />
Abb. 4.12 Synthese von PTH-Val für eine anschließende Modellstudie in Lösung.<br />
S<br />
81<br />
82<br />
H<br />
N<br />
H<br />
N<br />
O<br />
O<br />
Bedingungen<br />
während des PED<br />
Bedingungen für<br />
die Abspaltung<br />
vom Harz<br />
Um die Stabilität von PTC-Aminosäuren in unserem System zu überprüfen, wurde<br />
eine Modellstudie in Lösung durchgeführt. Hierfür wurde zunächst ausgehend von<br />
D-Valin 79 durch Umsetzung mit Phenylisothiocyanat Phenylcarbamyl-Valin 80<br />
dargestellt. Der Versuch, das Rohprodukt säulenchromatographisch aufzureinigen<br />
misslang. Deshalb wurde die Reaktionslösung lediglich mit einer Mischung aus<br />
n-Hexan und DCM (9:3) gewaschen, die wässrige Lösung getrocknet und, ohne<br />
Isolierung des Phenylcarbamoyl-Valins, durch Zugabe von TFA zum Phenylthio-<br />
hydantoin-Valin 81 umgesetzt. Phenylthiohydantoin-Valin 81 wurde mittels<br />
64
4 Analytik<br />
präparativer RP-HPLC aufgereinigt und anschließend ausführlich charakterisiert<br />
(NMR, GC, IR, HPLC, MS).<br />
Abb. 4.13 62,5-MHz- 13 C-NMR-Spektren in CDCl3 der Verbindungen 81 (A) und 82 (B).<br />
Man erkannt deutlich das Verschwinden des Thioharnstoff-Signals bei<br />
184,3ppm und das neue Harnstoff-Signal bei 157,2ppm (diese sind gelb<br />
hervorgehoben).<br />
Daraufhin erfolgte die eigentliche Stabilitätsstudie. Hierzu wurden kleine Mengen des<br />
Phenylthiohydantoin-Valins den Bedingungen des partiellen Edman-Abbaus<br />
ausgesetzt und daraufhin mittels RP-HPLC-offline-ESI-MS analysiert. Dabei zeigte<br />
sich, dass 81 während allen Schritten des PEDs unverändert bleibt. Wird die<br />
Verbindung jedoch den Bedingungen ausgesetzt, die zur Abspaltung der Peptidleiter<br />
vom Harz benötigt werden, so erfolgte eine Veränderung im Molekül. Die neu<br />
entstandene Verbindung 82 wurde mittels RP-HPLC in einer Ausbeute von 70%<br />
isoliert. Um die neue Verbindung 82 mit PTH-Val 81 vergleichen zu können, erfolgte<br />
ebenfalls eine ausführliche Charakterisierung. Das ESI-Massenspektrum zeigte<br />
einen Verlust des Molekulargewichts um -16 m/z, wie er auch bei der Peptidleiter<br />
65
4 Analytik<br />
beobachtet werden konnte. Im 13 C-NMR Spektrum verschwand das Signal der<br />
Thiocarbonylgruppe des Thioharnstoffs bei einer chemischen Verschiebung von 184<br />
ppm. Ein neues Signal bei einer chemischen Verschiebung von 157 ppm kam hinzu.<br />
Das neue Signal kann dem Carbonyl-Kohlenstoffatom eines Harnstoffs zugewiesen<br />
werden, welches auf Grund des Schwefel-Sauerstoff-Austauschs zu höherem Feld<br />
verschoben ist. Im IR-Spektrum konnten signifikante Veränderungen der Banden im<br />
Bereich 1800-1000 cm -1 beobachtet werden. Auch das GC-Massenspektrum zeigt<br />
ein Fragmentmuster auf, das für einen Schwefel-Sauerstoff-Austausch spricht. In der<br />
Summe der analytischen Daten konnte 82 somit eindeutig belegt werden. Dies legt<br />
die in Abb. 4.14 gezeigte Nebenreaktion nahe. Der Austausch findet in unserem Fall<br />
nicht wie von Edman beschrieben auf der Stufe des Phenylthiocarbamoyl-Derivates<br />
statt. Der partielle Edman-Abbau verläuft, trotz Anwesenheit von Luftsauerstoff, ohne<br />
Einbruch. Erst die Behandlung mit BrCN-Abspaltlösung führt zum Austausch des<br />
Schwefels durch Sauerstoff. In unserem Fall erfolgte der Austausch beim Phenylthio-<br />
hydantoin-Derivat. Die Literatur kennt Umwandlungen von Phenylthiohydantoin-<br />
Derivaten zu Phenylhydantoin-Derivaten, jedoch sind hierzu drastischere Reaktions-<br />
bedingungen notwendig. Bailey et al. beschreiben eine Entschwefelungsreaktion mit<br />
Quecksilberoxid, weisen aber explizit darauf hin, dass Phenylthiohydantoin-Derivate<br />
erst durch alkalische Hydrolyse in Phenylthiocarbamyl-Derivate überführt werden<br />
müssen, ehe eine erfolgreiche Entschwefelungsreaktion stattfinden kann. [97]<br />
Außerdem wurde die Entschwefelung durch Umsetzung mit Bromwasser, [97] Wasser-<br />
stoffperoxid-Lösung [98] oder einer nucleophilen Substitution mit anschließender<br />
Hydrolyse [99-102] beschrieben. Alle Reaktionen wurden mehrere Stunden unter<br />
Rückfluss erhitzt.<br />
66<br />
Abb. 4.14 Beim Abspalten der Peptidleiter vom Harz wird das Phenylthiohydantoin-<br />
derivat in einer Nebenreaktion zu Phenyhydantoin umgewandelt.
4.2.3.3 Anwendung des Konzepts auf einzelne Kugeln<br />
4 Analytik<br />
Wie in Abschnitt 4.2.3.1 beschrieben, konnte gezeigt werden, dass sich das Konzept<br />
des partiellen Edman-Abbaus erfolgreich auf unser System übertragen lässt. Die<br />
Sequenzierung des Modellpeptids gelang und die dabei beobachtete Nebenreaktion<br />
konnte aufgeklärt werden. Bisher wurde jedoch stets eine größere Menge an<br />
Harzkugeln zur Sequenzierung herangezogen. Nun sollte überprüft werden, ob auch<br />
einzelne Harzkugeln für eine Sequenzbestimmung ausreichen. Der partielle Edman-<br />
Abbau erfolgte wie bereits oben beschrieben. Vor der bromcyanvermittelten<br />
Abspaltung der Peptidleiter von der festen Phase wurden die Harzkugeln unter einer<br />
Stereolupe separiert und einzeln in Eppendorfcaps platziert. Für die Abspaltung<br />
wurde eine unmittelbar zuvor hergestellte Bromcyanlösung in die Caps pipettiert. Die<br />
Kugeln liess man darin über Nacht quellen. Die jetzt in der Lösung vorhandene<br />
Peptidleiter wurde anschließend vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde in<br />
MALDI-Lösungsmittel aufgenommen, auf das Target geladen und MALDI-TOF-<br />
Massenspektren gemessen. Zusätzlich zu den Proben wurde immer ein Spot auf<br />
dem Target als Referenz mit MALDI-Solvent/Matrix (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure,<br />
CHCA) bestückt. Im ersten Versuch wurden für Matrix-Referenz und Probe<br />
(abgespaltene Peptidleiter) analoge Spektren erhalten.<br />
Abb. 4.15 Mechanismus der Reduktion von Sulfoxid mit NH4I in TFA unter Zusatz von<br />
Dimethylsulfid in Peptiden. [103]<br />
67
4 Analytik<br />
Möglicherweise könnte Methionin zu Methioninsulfoxid oxidiert worden sein. Die<br />
Oxidation kann ungewollt während der Kettenverlängerung der SPPS, der Lagerung<br />
oder des partiellen Edman-Abbaus erfolgen. Da Methioninsulfoxid nicht für die BrCN-<br />
Spaltung zugänglich ist, bliebe die Peptidleiter an der festen Phase gebunden. Durch<br />
Behandlung des Harzes mit einer Lösung aus Ammoniumiodid in TFA bei 0°C unter<br />
Zusatz von Dimethylsulfid kann Methioninsulfoxid zu Methionin reduziert werden<br />
(Abb. 4.15). [103-105] Eine solche Behandlung unmittelbar vor der Abspaltung ergab<br />
jedoch keine Verbesserung.<br />
Zur Überprüfung, ob das Peptid vom Harz gespalten werden kann, sich im MALDI-<br />
Lösungsmittel löst und anschließend mittels MALDI-TOF-MS nachgewiesen werden<br />
kann, wurde das intakte Peptid, also ohne vorherigen PED, von einzelnen<br />
Harzkugeln abgespalten. In allen Fällen konnte anschließend ein Massenspektrum<br />
des intakten Peptids erhalten werden. Durch den partiellen Edman-Abbau verringert<br />
sich die Menge des Peptids, welche anschließend zum Nachweis genutzt werden<br />
kann. Vermutlich stößt man dabei an die Nachweisgrenze des verwendeten<br />
Massenspektrometers. Auch bei den hier beschriebenen Messungen wurde als<br />
Referenz eine Messung ohne Peptidprobe (nur Lösungsmittel und Matrix)<br />
durchgeführt. Vergleicht man die Probenspektren mit dem Matrixspektrum, so fällt<br />
auf, dass in den Probenspektren ein sehr hoher Anteil an Matrix-Hintergrund, also<br />
Signale, die von der Matrix bzw. Matrixclustern stammen, enthalten ist.<br />
Keller et al. [106] berichten von solchen Matrix-Hintergrund-Problemen, wenn eine<br />
Analytlösung sehr verdünnt und/oder eine hohe Verunreinigung der Probe durch<br />
Salze vorliegt. Die Matrix- und Matrixcluster-Signale werden deutlich verstärkt,<br />
während die Analytsignale geschwächt werden. Da sich der Matrix-<br />
Hintergrundbereich von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) bis zu einem<br />
Massebereich von ~2000 m/z erstrecken kann, kann darunter die komplette<br />
Peptidleiter „verborgen“ liegen. Keller weist darauf hin, dass dieses Problem nicht<br />
verhindert werden kann. Eine Umkristallisierung der CHCA aus Ethanol vor dem<br />
Gebrauch als Matrix kann die Erscheinung der Hintergrundsignale etwas dämpfen.<br />
Xu führt mit 3,4-Diaminobenzophenon eine neue Matrix ein, die nach seiner<br />
Beschreibung weniger anfällig ist für dominante Matrix-Hintergrund-Signale. [107]<br />
Schlosser schlägt als Matrix eine Mischung aus gleichen Teilen CHCA und<br />
2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) vor. [108]<br />
68
4 Analytik<br />
Der Vergleich verschiedener Matrices und Lösungsmitteln ergab, dass in unserem<br />
Fall mit folgendem Protokoll zur Probenvorbereitung die besten Ergebnisse erzielt<br />
werden konnten: Der Rückstand im Cap wird in Lösungsmittel A (0,1% TFA in<br />
Wasser/Acetonitril (1:2)) aufgenommen. Anschließend wird die Probenlösung mit der<br />
Matrixlösung (eine gesättigte Lösung aus vor Gebrauch umkristallisierter CHCA/DHB<br />
(1:1) in Lösungsmittel A/Methanol (5:2)) auf dem MALDI-Target gemischt und der<br />
Spot bei Raumtemperatur auskristallisiert.<br />
Um sicher zu stellen, dass Peptide mit verschiedenen Sequenzen richtig unter-<br />
schieden werden können, wurde ein weiteres Peptid 83 (Boc-cyclo[Lys-Ala-Gly-Pro-<br />
Val-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-Met-TG) analog zu 77 dargestellt. Die festphasen-<br />
gebundenen Peptide 83 und 77 wurden zu gleichen Teilen gemischt und<br />
anschließend einem partiellen Edman-Abbau unterworfen. Die Spektren in Abb. 4.16<br />
zeigen, dass die Peptide erfolgreich sequenziert werden konnten. Somit haben wir<br />
eine Methode zur Hand, die es uns ermöglicht, festphasengebundene cyclische<br />
Peptide, welche als Hitsequenzen aus einer OBOC-Bibliothek hervorgehen, zu<br />
sequenzieren. Eine Anwendung der Methode zur Sequenzanalyse von Hitsequenzen<br />
wird im nächsten Kapitel ausführlich beschrieben.<br />
69
4 Analytik<br />
70<br />
Abb. 4.16 MALDI-TOF-Massenspektren. A) erhalten nach Abspaltung der in 5 Runden<br />
PED erzeugten Peptidleiter von 77. B) erhalten nach Abspaltung der in 5<br />
Runden PED erzeugten Peptidleiter von 83. C) Matrix-Referenz-Spektrum.
5 Anwendung der Methode<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Mit der im vorhergehenden Kapitel beschriebenen Erweiterung des partiellen Edman-<br />
Abbaus auf Cyclopeptide steht jetzt eine Methode zur Verfügung, welche eine direkte<br />
Sequenzierung von festphasengebundenen Cyclopeptiden ermöglicht. Nach der<br />
Entwicklung soll nun ihr Nutzen anhand einer konkreten Anwendung gezeigt werden.<br />
5.1 Streptavidin: Ein biologisches Modelltarget<br />
Bei der Suche nach einem geeigneten biologischen Modelltarget fiel die Wahl auf<br />
Streptavidin. Streptavidin ist ein 53 kDa großes Protein, das aus dem Bakterium<br />
Streptomyces avidinii isoliert werden kann. Es handelt sich um ein homotetrameres<br />
Protein, da es aus vier identischen Untereinheiten besteht. Jede dieser<br />
Untereinheiten kann mit sehr hoher Affinität (Ka ~ 10 14 –10 15 M -1 ) ein Biotin-Molekül<br />
binden. Die Streptavidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten bekannten nicht-<br />
kovalenten Bindungen in biologischen Systemen. Im Gegensatz zu Avidin, das<br />
ebenfalls Biotin binden kann, hat Streptavidin wegen seiner geringen Gesamtladung<br />
einen isoelektrischen Punkt im neutralen Bereich. Zudem weist Streptavidin keinerlei<br />
Glycosylierungen auf. Somit sind unspezifische Bindungen in Streptavidin-Systemen<br />
seltener als bei der Verwendung von Avidin. Aufgrund dieser Tatsachen (hohe<br />
Bindungsaffinität und wenige unspezifische Bindungen) findet Streptavidin häufig<br />
Einsatz in verschiedenen Methoden der Biochemie, [109, 110] Immunologie [111] und<br />
Molekularbiologie.<br />
Streptavidin bindet aber nicht nur selektiv an Biotin, sondern erkennt auch selektiv<br />
Peptidsequenzen mit HPQ-Motiv. [112] Schon in der ersten Anwendung der Split-Mix-<br />
Bibliothek wurde von Lam et al. Streptavidin als biologisches Target ausgewählt, [113]<br />
und ist bis heute ein sehr beliebtes Anwendungsmodell. Die HPQ-Peptid/<br />
Streptavidin-Erkennung bildet auch die Grundlage für die heute häufig in der<br />
Biochemie angewandte Strep-tag-Affinitätschromatographie. [114, 115] Bei der<br />
Expression wird dem gewünschten Protein hierzu eine zehn Aminosäuren lange<br />
Peptidsequenz angehängt (Strep tag I = Protein-AWRHPQFGG-OH; Strep tag II =<br />
71
5 Anwendung der Methode<br />
Ac-SNWSHPQFEK-Protein). Beim anschließenden Aufreinigen mittels Affinitäts-<br />
chromatographie bindet das Tag (mit Protein) in der Biotin-Bindetasche des an der<br />
stationären Phase immobilisierten Streptavidins. Peptide ohne Tag werden hingegen<br />
von der Säule gewaschen. Um das Protein abschließend von der Säule zu eluieren,<br />
wird in der Regel mit Desthiobiotin gewaschen (2,5 mM). Prinzipiell könnte das<br />
Protein auch mit Biotin eluiert werden, eine anschließende Regeneration der Säule<br />
wäre dann aber auf Grund der starken Bindung nicht mehr möglich. Durch<br />
Mutationsexperimente wurde eine Streptavidinvariante namens Strep-Tactin<br />
entwickelt, die eine noch bessere Affinität gegenüber Strep-tag zeigt. [116]<br />
Abb. 5.1 Stereogramm eines Streptavidin/Biotin- bzw. Streptavidin/Strep-tag I- Kom-<br />
plexes. In rot zu sehen ist Biotin, welches an Streptavidin (grün) bindet. Strep-<br />
tag I ist in gelb dargestellt und bindet an das in blau dargestellte Strept-<br />
avidin. [115]<br />
Ein Vergleich der Röntgenstruktur vom Streptavidin/Strep-tag I-Komplex mit der vom<br />
Streptavidin/Biotin-Komplex zeigte, dass Strep-tag I in der gleichen Bindungstasche<br />
wie Biotin bindet (Abb. 5.1). Das Peptid ist jedoch nicht in der Lage, so tief in die<br />
72
5 Anwendung der Methode<br />
Bindungstasche einzudringen. Oder aus Sicht des Biotins ausgedrückt, der<br />
Imidazolidinonring des Biotins passt perfekt in die Bindungtasche. Strep-tag ist aber<br />
in der Lage, Biotin nachzuahmen. Das Carboxylamid aus der Seitenkette von<br />
Glutaminsäure (Gln/Q) an Position 6 nimmt dabei den Platz des Biotin-<br />
Schwefelatoms ein. Der Imidazolring in der Seitenkette von Histidin (His/H) an<br />
Position 4 übernimmt die Position des biotinylischen Valerylcarboxylats. Außerdem<br />
konnte gezeigt werden, dass zwischen der peptidischen Carboxylatgruppe und der<br />
Guanidiniumgruppe des Arginins an Position 84 im Streptavidin eine Salzbrücke<br />
ausgebildet wird.<br />
In Tabelle 5 sind Literaturwerte der Bindungskonstanten verschiedener HPQ-Peptide<br />
zu Streptavidin aufgelistet. Den Daten liegen unterschiedliche Experimente zu<br />
Grunde.<br />
Weber [117] und auch die Gruppe um Skerra [115] führten Isotherme-Titrations-<br />
kalorimetrie (ITC) Experimente zur Bestimmung der Bindungskonstanten durch. Die<br />
von Weber untersuchten Peptide wurden von Devlin [112] aus phage-display-<br />
Bibliotheken selektiert. Die in der Gruppe von Skerra untersuchten strep-tagI Peptid-<br />
sequenz gingen ebenfalls durch Selektion aus einer phage-display-Bibliothek<br />
hervor. [114] Von deren Sequenz abgeleitet erfolgte eine Spot-Peptidbibliotheks-<br />
Synthese mit anschließendem kompetitivem Screening, daraus ging Strep-tag II<br />
[114, 115]<br />
hervor.<br />
Gieble [118] und Chang [119] führten zur Bestimmung der Bindungskonstanten SPR-<br />
Experimente durch. Auch die von Giebel untersuchten Peptidsequenzen wurden<br />
mittels phage-display-Verfahren ausfindig gemacht. Bei den SPR-Experimenten<br />
wurden die zu untersuchenden Peptide immobilisiert und Streptavidin als Analyt<br />
verwendet. Die SPR-Experimente gestalteten sich jedoch schwierig; von sechs der<br />
acht untersuchten Peptide konnte keine Bindungskonstante bestimmt werden. Als<br />
Grund hierfür nennen die Autoren eine zu geringe Bindungsaffinität der Peptide. Die<br />
von Chang untersuchte Peptidsequenz wurde aus einer iterativen Dekonvolutions-<br />
Bibliothek mit einem an ELISA angelehnten Screening ermittelt. [120] Für die<br />
Bestimmung der Bindungskonstante immobilisierte Chang Streptavidin auf dem<br />
SPR-Sensorchip und verwendete die zu untersuchenden Peptide als Analyt. Die von<br />
ihm erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen evident den Zusammenhang von Struktur<br />
73
5 Anwendung der Methode<br />
und Affinität. Bei gleicher Peptidsequenz bindet das lineare Peptid 1000fach<br />
schlechter als die durch Cyclisierung strukturell eingeschränkten Gegenspieler.<br />
Peptidsequenz<br />
Tabelle 5 Literaturwerte von Streptavidin-„HPQ-Peptid“-Bindungskonstanten. *:für<br />
Werte, die mittels SPR bestimmt wurden, wird zwischen steady-state-affinity<br />
(ssa) und kinetischer (kin) Auswertung unterschieden. ND: aufgrund zu<br />
geringer Affinität konnten keine Bindungskonstanten bestimmt werden.<br />
K D (µM)<br />
*ssa./kin.<br />
Methode Lit<br />
AECHPQGPPCIEGRK --/0,23 SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AESHPQGPPSIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AEC(Acm)HPQRPPC(Acm)IEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AECHPQFSNCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AECHPQFPCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AECHPQFSNCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AECHPQFNCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
AECHPQFCIEGRK --/0,66 SPR (Pept. Immob.) [118]<br />
FSHPQNT 125,0 ITC [117]<br />
HDHPQNL 282,0 ITC [117]<br />
Ac-AHPQFPAEK-CONH 2 357,0/ -- SPR (SA Immob.) [119]<br />
Cyclo[AHPQFPAE]K-NH 2 0,270/0,257 SPR (SA Immob.) [119]<br />
Cyclo[AHPQFPAE(K-NH 2)] 0,435/0,355 SPR (SA Immob.) [119]<br />
H 2 N-AWRHPQFGG-OH (pStrep tag) 36,79 ITC [115]<br />
F V -Strep-Tag (exprim.Protein+tag) 18,38 ITC [115]<br />
Ac-WSHPQFEK-OH (pStrepTagII) 72,0 ITC<br />
H2N-CWHPQAGC-OH 13,0 ITC<br />
Es bleibt aber zu erwähnen, dass in der Literatur auch mehrfach Hitsequenzen<br />
gefunden wurden, deren Bindung zu Streptavidin so schwach war, dass die<br />
dazugehörigen KD-Werte nicht bestimmt werden konnten. [90, 118] Meist wurden<br />
ersatzweise IC50-Werte bestimmt.<br />
74<br />
[115]<br />
[115]
5.2 Aufbau einer OBOC-Cyclopeptidbibliothek<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Da es sich hier um eine Anwendung der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten<br />
Methode handeln sollte, wurde die Synthesestrategie analog zu Abschnitt 4.2.3.<br />
verfolgt. Um die Zahl der als aktiv zu erwartenden Peptidsequenzen zu limitieren,<br />
wurde beim Design der Bibliothek darauf geachtet, dass ein Vorkommen des HPQ-<br />
Motivs nicht an allen Positionen möglich ist (Abb. 5.2).<br />
Abb. 5.2 Syntheseweg der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86.<br />
Das HPQ-Motiv ist in Position 2-4 (das heißt, es verbleiben zwei variable Positionen,<br />
die 7x7=49 verschiedene Peptidsequenzen ermöglichen) und Position 4-6 (5x5=25<br />
mögliche Peptidsequenzen) möglich, in Position 3-5 hingegen nicht. Betrachtet man<br />
die Verbrückung von Lysin und Glutaminsäure auf Grund der amidischen Struktur als<br />
„quasi“-Glutamin, so ist außerdem ein HP“Q“-Motiv in Position 5-7 denkbar (dies<br />
ergibt 5x5x8=200 mögliche Peptidsequenzen). Für weitere Designüberlegungen<br />
dienten die bereits vorhandenen Erkenntnisse über Strep-tag in der Literatur.<br />
75
5 Anwendung der Methode<br />
So wurde beispielsweise in der Röntgenstrukturanalyse von Strep-tag I eine<br />
Salzbrücke zwischen GlyGly-OH (C-terminus Strep-tag) und Arg 84 (Streptavidin)<br />
nachgewiesen. Der Einsatz von Glutaminsäure in zweiter Position Richtung<br />
C-Terminus nach HPQ sollte diese Salzbrücke nachahmen können. [115] In beiden<br />
Strep-tag-Sequenzen folgt C-terminal zum HPQ-Motiv ein Phenylalanin und N-<br />
terminal zwei Positionen vor HPQ ein Tryptophan. Dies sollte auch in der Bibliothek<br />
berücksichtigt werden. Außerdem wurde neben Phenylalanin auch noch<br />
Thienylalanin eingesetzt, welches als unnatürliche Aminosäure Phenylalanin<br />
ersetzen kann. [121] Es wurden sechs variable Positionen mit zweimal sieben, einmal<br />
acht und zweimal fünf möglichen Aminosäuren erzeugt. Daraus ergibt sich eine<br />
Mitgliederzahl von 9800 (=5x5x8x7x7) für diese Bibliothek.<br />
Zum Aufbau der OBOC-Cyclopeptidbibliothek wurden 2 g aminofunktionalisiertes<br />
TentaGel (130 µm/ ca. 1,5 Mio. Kugeln) mit Methionin versehen. Mit Standard-Fmoc-<br />
Chemie wurde manuell die Massenspacerpeptidsequenz (βAPPRM-TG) aufgebaut.<br />
Nach Anknüpfung der geschützten Glutaminsäure erfolgte die Synthese der<br />
variablen Bibliothekspeptide nach dem Protokoll der Split-Mix-Synthese. Die<br />
Anknüpfung von Boc-Lys(Alloc)-OH stellte den letzten Schritt im Aufbau der<br />
Peptidkette dar. Die Syntheseeffizienz wurde durch UV-Messung aller Fmoc-<br />
Entschützungsschritte verfolgt. Von der nun vorliegenden Vorläuferbibliothek aus<br />
linearen Peptiden wurden die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen entfernt. Daran<br />
anschließend erfolgte die Cyclisierung der Peptidbibliothek bis im Kaiser-Test und<br />
TNBS-Test keine freien Amine mehr nachzuweisen waren. Die Entschützung der<br />
säurelabilen Schutzgruppen mit TFA/TIS/Wasser erfolgte immer unmittelbar vor dem<br />
Einsatz im biologischen Test. Zur Lagerung wurde die mit Peptidylharz bestückte<br />
Einwegspritze in einem mit Argon gefluteten Schraubdeckelglas im Kühlschrank<br />
aufbewahrt. Da es zu unerwarteten Problemen bei der post-Screening Peptidsequen-<br />
zierung kam, wurde eine identische Bibliothek nochmals auf größeren Harzkugeln<br />
synthetisiert (TentaGel MB300 / 280-320 µm / 65500 Kugeln pro Gramm).<br />
76
5.3 Das Screening<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Für den Nachweis der synthetisierten Bibliothek auf biologische Aktivität (Rezeptor-<br />
Ligand-Erkennung) wurde ein Enzym-verknüpfter Farbreaktionstest [122] durchgeführt.<br />
Abb. 5.3: Durchführung eines on-bead-assays mit Rezeptor-Protein/Alkalische<br />
Phosphatase- Konjugat.<br />
Der Ligand ist bei diesem sogenannten on-bead-assay kovalent an die feste Phase<br />
gebunden. Die Umgebung muss zunächst den idealen Bindungsbedingungen des<br />
Rezeptors angepasst werden. Beispielsweise sollte der pH-Wert dem pI-Wert des<br />
Rezeptors entsprechen. Das heißt, die Gesamtladung des Rezeptors ist neutral,<br />
somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf Erkennung<br />
zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen Harzkugeln und<br />
Rezeptor zu vermeiden, wird die feste Phase beispielsweise mit BSA, Gelatine oder<br />
Milchpulver geblockt. Nun sind die Harzkugeln für die eigentliche Ligand-Rezeptor-<br />
Erkennung vorbereitet, die Inkubation mit dem Rezeptor kann durchgeführt werden.<br />
Nach ausführlichem Wegwaschen des ungebundenen Rezeptors erfolgt eine<br />
Änderung des pH-Wertes zur Aktivierung des am Rezeptor konjugierten Enzyms.<br />
Dieses Enzym agiert in der anschließenden Farbreaktion als Katalysator. Bei der<br />
Farbreaktion (Abb. 5.4) fungiert die Alkalische Phosphatase als Katalysator bei der<br />
Hydrolyse von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) 87 zu 5-Brom-4-<br />
chlorindoxyl 88. Das entstandene Indoxyl fällt nach anschließender Oxidation (durch<br />
Luftsauerstoff bzw. NBT) als tiefblauer Indigo-Farbstoff 89 aus. Nitroblau-<br />
Tetrazoliumchlorid (NBT) 90 wird durch Reduktion zunächst zum roten<br />
Formazanfarbstoff, der durch eine weitere Reduktion zum blauen<br />
Di-Formazanfarbstoff 91 wird und ebenfalls ausfällt. Die beiden ausgefallenen Farb-<br />
77
5 Anwendung der Methode<br />
stoffe bilden einen schwerlöslichen, violett-blauen bis schwarzen Überzug auf den<br />
Harzkugeln.<br />
Alkalische<br />
Phosphatase<br />
Abb. 5.4: Die durch Alkalische Phosphatase katalysierte Farbreaktion mit BCIP/NBT.<br />
5.3.1 Etablierung des Screenings<br />
Für die Optimierung des Testsystems wurden zunächst am Peptidsynthesizer zwei<br />
Kontrollpeptide synthetisiert. Zur eindeutigen Identifizierung der erfolgreichen<br />
Synthese wurde von einer kleinen Menge Harz eine Testabspaltung vorgenommen.<br />
Die abgespaltenen Peptide wurden anschließend mittels RP-HPLC und ESI-MS<br />
charakterisiert. Als Positivkontrolle wurde GHPQG-βAARM-TentaGel, als Negativ-<br />
kontrolle APARG-βAARM-TentaGel dargestellt. Für eine zusätzliche Positivkontrolle<br />
wurde aminofunktionalisiertes TentaGel durch basische Umsetzung mit Biotin-NHS<br />
biotinyliert. Außerdem wurde aminofunktionalisiertes TentaGel als zweite Negativ-<br />
kontrolle herangezogen. Jede dieser vier Kontrollen wurde parallel unter gleichen<br />
Screeningbedingungen behandelt (<br />
Tabelle 6).<br />
78
5 Anwendung der Methode<br />
Tabelle 6 Übersicht der Versuchsbedingungen zur Optimierung des enzymkatalysierten<br />
Farbreaktionstests. Die wichtigen Unterschiede in den Bedingungen sind fett<br />
hervorgehoben.<br />
Zweck Puffer Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5<br />
Waschen<br />
Wasser 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min<br />
PBS 1x10 min<br />
4x1 min<br />
2x5 min<br />
7x1 min<br />
2x5 min<br />
4x 1min<br />
2x5 min<br />
4x1 min<br />
2x5 min<br />
4x1 min<br />
Blocken 0,1% Gelatine Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht<br />
Waschen<br />
(pH 7,4)<br />
0,1% Tween in<br />
PBS<br />
*: 0,1% Tween,<br />
0,1% Gelatine<br />
in PBS<br />
4x1 min<br />
1x15 min<br />
Anlagern SA-AP in * 2,5 h<br />
Waschen 0,1% Tween in<br />
PBS<br />
6x1 min 1x15 min<br />
4x1 min<br />
1x15 min<br />
4x1 min<br />
1x15 min<br />
4x1 min<br />
5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min<br />
0,1 µg/ml<br />
Umpuffern TBS 2x3 min<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
3,5 h<br />
1 µg/ml<br />
neu gekauft<br />
10x1 min 9x1 min 15x1 min 15x1 min 15x1min<br />
8x1 min<br />
pH 8,0<br />
8x1 min<br />
1x5 min<br />
pH 8,0<br />
15x1 min<br />
pH 8,0<br />
15x1 min<br />
pH 9,5<br />
15x1 min<br />
pH 9,0<br />
Farbreaktion BCIP/NBT 1 h 5 min 30 min 30 min 30 min<br />
quenchen 0,1 M HCl 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min<br />
Im ersten Versuch erfolgte die Inkubation mit einer Streptavidin/Alkalische-<br />
Phosphatase-Konjugat (SA-AP-Konjugat)-Lösung der Konzentration 0,1 µg/ml.<br />
Selbst nach 1h Farbreaktionszeit war jedoch keine Anfärbung der Kugeln zu<br />
beobachten (Abb. 5.5 Bild h). Daraufhin wurde im zweiten Versuch die SA-AP-<br />
Konjugatkonzentration auf 1 µg/ml erhöht. Bereits nach 5 Minuten konnte eine<br />
deutliche Anfärbung der Harzkugeln in beiden Positivkontrollen beobachtet werden.<br />
79
5 Anwendung der Methode<br />
Abb. 5.5: Mikroskopausschnitte während der Optimierung des Screenings.<br />
Die erste Reihe zeigt optimale Bedingungen (Versuch 5): a) Positivkontroll-<br />
peptid, b) Biotin, c) Negativkontrollpeptid, d) TentaGel.<br />
Die untere Reihe zeigt: e) Positivkontrollpeptid mit altem SA-AP-Konjugat<br />
(Versuch 4), f) Biotin mit altem SA-AP-Konjugat (Versuch 4), g) Negativ-<br />
kontrollpeptid mit zu wenigen Waschschritten (Versuch 2), h) Positivkontroll-<br />
peptid mit zu geringer SA-AP-Konjugatkonzentration.<br />
Beim genaueren Betrachten der Kugeln unter dem Stereomikroskop fiel auf, dass die<br />
beiden Positivkontrollen mit einem hellvioletten Niederschlag überzogen waren;<br />
erwartet wurde jedoch ein tiefviolettschwarzer Überzug. Ein möglicher Grund dafür<br />
könnte eine zu kurze Reaktionszeit der Farbreaktion sein. Desweiteren fielen bei<br />
beiden Negativkontrollen lokale Ablagerungen auf den Kugeln auf, was auf<br />
unspezifische Bindungen hinweisen könnte (Abb. 5.5 Bild g). Diese sollten durch<br />
eine Erhöhung der Waschschritte nach der Inkubation mit SA-AP-Konjugat behoben<br />
werden können. Folglich wurde im dritten Versuch die Farbreaktionszeit auf<br />
30 Minuten erhöht und die Waschschritte nach der SA-AP-Konjugatinkubation je<br />
fünfzehnmal wiederholt. Die lokalen Ablagerungen bei beiden Negativkontrollen<br />
wurden mit der Erhöhung der Waschschritte behoben. Die Anfärbung der<br />
Positivkontrolle nahm zu, war aber immer noch nicht zufriedenstellend. Ein weiterer<br />
Grund für eine nicht optimal verlaufende Farbreaktion könnte der pH-Wert während<br />
der enzymkatalysierten Reaktion sein. Im Versuch 4 wurde deshalb der pH-Wert auf<br />
9,5 erhöht. Dies erbrachte jedoch keine Verbesserung. Im fünften Versuch wurde<br />
neu gekauftes SA-AP-Konjugat verwendet. Der pH-Wert des TBS-Puffers wurde auf<br />
pH 9.0 gesenkt, da ein pH-Wert von 9,5 über der Grenze des Pufferbereichs<br />
80
5 Anwendung der Methode<br />
(pH 7-9.2) liegt. Wie die Fotos in Abb. 5.5 (obere Reihe) zeigen, konnten jetzt<br />
optimale Ergebnisse erzielt werden. Sowohl das Harz, welches das positive<br />
Kontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 a) als auch das biotinylierte Harz (Abb. 5.5 b) sind<br />
gleichmäßig von einem tiefschwarzvioletten „Lack“ überzogen. Das Harz welches<br />
das Negativkontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 c), sowie das unbeladene TentaGel-Harz<br />
(Abb. 5.5 d) sind hingegen farblos.<br />
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86<br />
Abb. 5.6 Das Screening. A) Vorbereitung der OBOC-Cyclopeptidbibliothek. B) Strept-<br />
avidinbindung. C) Auslösung der Farbreaktion.<br />
Das Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 erfolgte nach den oben<br />
beschriebenen optimierten Bedingungen (Abschnitt 5.3.1). Hierzu wurden zunächst<br />
durch Zugabe von TFA/TIS/Wasser alle säurelabilen Schutzgruppen entfernt.<br />
Daraufhin wurde das Peptidylharz ausführlich mit Wasser und PBS-Puffer<br />
gewaschen. Das Harz wird dabei auf pH 7,4 eingestellt. In diesem Bereich liegt der<br />
pI-Wert des Streptavidins. Das heißt, hier ist das Protein in der Gesamtladung<br />
neutral und somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf<br />
Erkennung zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen<br />
Harzkugeln und Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Komplex (SA-AP-Komplex) zu<br />
vermeiden, wurden die Harzkugeln über Nacht durch Inkubation mit Gelatine<br />
geblockt. Nach gründlichem Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween + 0.1%<br />
Gelatine) erfolgte dann eine dreistündige Inkubation mit SA-AP Konjugat, die<br />
eigentliche Rezeptor-Ligand Screening-„Reaktion“. Anschließend wurden nicht<br />
gebundene SA-AP-Komplexe durch Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween)<br />
entfernt. Zur Aktivierung der Alkalischen Phosphatase erfolgt nun eine pH-<br />
81
5 Anwendung der Methode<br />
Wertänderung von 7,4 auf 9,0 durch den Wechsel auf TBS-Puffer. Schließlich<br />
wurden in einer 30 minütigen enzymkatalysierten Farbreaktion die aktiven<br />
Harzkugeln angefärbt. Zum Abstoppen der Reaktion wurde der pH-Wert durch<br />
Waschen mit HCl (0,1 N) abgesenkt. Abschließend wurde das Harz mit Wasser<br />
gewaschen. Zum Aussortieren der Hitbeads wurden alle Harzkugeln in eine<br />
Petrischale überführt. Unter dem Mikroskop wurden mit Hilfe einer Glaskapillare alle<br />
angefärbten Kugeln aufgenommen und gemeinsam in einer Einwegspritze mit PE-<br />
Fritte für den anschließenden partiellen Edman-Abbau gesammelt.<br />
Abb. 5.7: Bild der OBOC-Cyclopeptidbibliothek nach dem Screening mit SA-AP-<br />
Konjugat. Im Ausschnitt sind deutlich sieben Hitbeads erkennbar.<br />
Vor der Sequenzierung wurden die aussortierten Hitbeads mit Guanidiniumlösung<br />
(6 M, pH 1,0) behandelt. Dies dient zur Denaturierung und zum Abstreifen des SA-<br />
AP-Konjugats. Der Farblack wurde durch Waschen mit TFA entfernt. Der<br />
anschließende partielle Edman-Abbau erfolgte wie in Abschnitt 4.2.3. beschrieben.<br />
82
5.4 Die Hitbead-Peptidsequenzen<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Ca. 12.700 Harzkugeln (195 mg Peptidylharz 86) wurden dem oben beschriebenem<br />
Screening unterzogen, wobei 48 Kugeln eine Aktivität zeigten. 23 dieser Kugeln<br />
wurden aussortiert und mittels PED-MS eindeutig sequenziert. Unter der Annahme,<br />
dass alle Mitglieder gleichmäßig verteilt in der Bibliothek vorhanden sind und alle<br />
Peptidsequenzen mit HPQ-Motiv binden, wäre zu erwarten, dass 63 Harzkugeln mit<br />
HPQXX-, 32 Harzkugeln mit XXHPQ- und 259 Harzkugeln mit XXXHP“Q“-Sequenz<br />
gefunden werden. Berücksichtigt man nur HPQXX- und XXHPQ-Sequenzen, so<br />
sollten 33,8% der gefundenen Peptide ein HPQXX-Motiv und 66,2% ein XXHPQ-<br />
Motiv aufweisen. Nach den statistischen Verteilungstheorien von Burgess [14, 15] und<br />
Zhao [15] empfiehlt es sich, zur vollständigen Abdeckung der Bibliothek weit mehr<br />
Harzkugeln als die absolute Zahl der Bibliotheksmitglieder für das Screening heran-<br />
zuziehen, da eine gleichmäßige Verteilung aller Bibliotheksmitglieder nicht realistisch<br />
ist.<br />
In Tabelle 7 sind alle ermittelten Peptidsequenzen aufgelistet. Alle 23 gefundenen<br />
Peptide tragen ein HPQXX-Sequenzmotiv. Es wurde kein Peptid mit XXHPQ-Motiv<br />
gefunden. Obwohl die Anzahl der im Screening eingesetzten Kugeln nur knapp das<br />
1,3-Fache der Anzahl aller möglichen Bibliotheksmitglieder betrug, konnten drei der<br />
zwanzig Peptide doppelt gefunden werden. Durch die konformative Einschränkung<br />
der cyclischen Peptide scheint das HPQ-Motiv an Position 2-4 bevorzugt zu sein.<br />
Abb. 5.8 zeigt die prozentuale Häufigkeit (als Balken) der eingesetzten Aminosäuren<br />
(durch Farbe hervorgehoben) an den variablen Positionen. Eine deutliche Selektivität<br />
liegt bei Position 2 mit 100% Histidin, an Position 3 mit 100% Glutamin und bei<br />
Position 4 mit 100% Prolin vor. In Position 5 wurde Glycin (33%) am häufigsten<br />
vorgefunden. Alanin, Histidin, Phenylalanin und Thienylalanin wurden zu je 17%<br />
gefunden. Glutaminsäure und Prolin wurden an Position 5 gar nicht gefunden. An<br />
Position 6 konnte keine bevorzugte Aminosäure mehr gefunden werden.<br />
Literaturbekannte Sequenzen zeigten eine Selektivität zu Glycin bzw.<br />
Phenylalanin [120] C-terminal zum HPQ-Motiv. Glycin war auch in unserer Bibliothek<br />
an dieser Stelle am häufigsten anzutreffen, und auch Phenylalanin und das Phe-<br />
83
5 Anwendung der Methode<br />
Mimetikum Thienylalanin wurden gefunden. Eine wie in der Literatur beschriebene<br />
Bevorzugung von Glutaminsäure zwei Positionen C-terminal zum HPQ-Motiv [115]<br />
konnte in unserem Fall nicht beobachtet werden.<br />
Tabelle 7 Nach dem Screening der Bibliothek cyclo[KX2X3X4X5X6E]-βAPPRM-TG<br />
wurden folgende Peptide gefunden.<br />
Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Häufigkeit<br />
H P Q A A 1<br />
H P Q A G 1<br />
H P Q A P 1<br />
H P Q A Thi 1<br />
H P Q F A 2<br />
H P Q F E 1<br />
H P Q F G 1<br />
H P Q G A 1<br />
H P Q G E 1<br />
H P Q G F 1<br />
H P Q G G 1<br />
H P Q G P 1<br />
H P Q G Q 1<br />
H P Q G Thi 1<br />
H P Q H G 2<br />
H P Q H P 2<br />
H P Q Thi A 1<br />
H P Q Thi E 1<br />
H P Q Thi G 1<br />
H P Q Thi Q 1<br />
84
Xaa2<br />
Position<br />
Xaa3<br />
Xaa4<br />
Xaa5<br />
Xaa6<br />
Ala<br />
Gln<br />
Glu<br />
Gly<br />
His<br />
Phe<br />
Pro<br />
Aminosäure<br />
Ser<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Abb. 5.8: Screening der Bibliothek K-X2X3X4X5X6E-βAPPRM-TG. Das Diagramm zeigt<br />
die möglichen Aminosäuren an unterschiedlichen Positionen der<br />
Peptidsequenz (farbige Markierung). Die Höhe der Balken gibt den<br />
prozentualen Anteil an, mit der die Aminosäure an der entsprechenden<br />
Position in den Hitbead-Peptidsequenzen gefunden werden konnte.<br />
Thi<br />
Trp<br />
10<br />
0<br />
40<br />
30<br />
20<br />
70<br />
60<br />
50<br />
100<br />
90<br />
80<br />
%<br />
85
5 Anwendung der Methode<br />
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten<br />
Um die Affinität der gefundenen Peptide zu Streptavidin einordnen zu können,<br />
wurden Bindungsstudien durchgeführt. Die dafür ausgesuchten Peptidsequenzen<br />
sind in Abb. 5.9 aufgeführt.<br />
Abb. 5.9 Die für die Bindungsstudien ausgewählten Peptidsequenzen. Es handelt sich<br />
immer um über die seitenkettencyclisierte Peptide und ihre linearen Analoga.<br />
Über die mit Unterstrich hervorgehobenen Aminosäuren Lysin und<br />
Glutaminsäure erfolgte die Cyclisierung.<br />
Aus den im Streptavidin-Screening positiv getesteten Sequenzen (Hitbead-<br />
sequenzen) wurde eine Peptidsequenz ausgewählt. Die ausgewählte Peptidsequenz<br />
92 ist eine der drei doppelt gefundenen Hitsequenzen. Aufgrund ihrer Aminosäuren-<br />
zusammensetzung erhoffte ich mir von ihr eine besonders gute Löslichkeit im<br />
wässrigen Puffersystem der Bindungsstudie. Verbindung 94 war ebenfalls ein<br />
Mitglied der OBOC-Peptidbibliothek. Dieses Peptid enthält ebenfalls ein HPQ-Motiv<br />
und wurde somit als potentieller Binder eingestuft. Im Screening wurde dieses Peptid<br />
jedoch nicht gefunden. Es stellt sich also die Frage, ob dieses Peptid trotz<br />
vorhandenen HPQ-Motiv eine nur sehr geringe Bindung zu Streptavidin aufweist. Bei<br />
Verbindung 96 wurde das HPQ-Motiv der Hitsequenz invertiert. Das Peptid war kein<br />
Mitglied der Bibliothek. Die Aminosäurenzusammensetzung ist bei allen drei<br />
Peptidsequenzen gleich; sie unterscheiden sich lediglich in der Abfolge der<br />
Aminosäuren (unterschiedliche Sequenz). Somit haben alle drei Sequenzen ein<br />
nahezu gleiches äußeres elektrostatisches Potential. Dadurch können Unterschiede<br />
in der Bindungsaffinität auf molekular-spezifische Selektivität zurückgeführt werden.<br />
Um den Einfluss der konformativen Einschränkung durch die Cyclisierung zu<br />
untersuchen und daraufhin eine Aussage über eine Struktur-Aktivitätsbeziehung<br />
treffen zu können, wurde von allen drei ausgewählten Peptiden die entsprechenden<br />
linearen Analoga hergestellt und ebenfalls experimentell untersucht.<br />
86
5.5.1 Synthese der ausgesuchten Peptidsequenzen<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Abb. 5.10 Syntheseweg des cyclischen Peptids 92 und des linearen Gegenspielers 93.<br />
Die Synthese der Peptide 95/94 und 97/96 erfolgten analog dazu.<br />
Exemplarisch für die Synthese der sechs zu untersuchenden Peptide ist in Abb. 5.10<br />
der Syntheseweg der Peptide 93/92 aufgezeigt. Die Synthese erfolgte an RinkAmid-<br />
Research-TentaGel-Harz, welches durch seine niedrige Beladungsdichte (0,18<br />
mmol/g) besonders für die Synthese cyclischer Peptide geeignet ist. Die Elongation<br />
der Peptidkette erfolgte am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf wurde über UV-<br />
Messungen der Fmoc-Abspaltlösungen verfolgt. Nach der automatisierten Synthese<br />
der Peptidsequenz erfolgte die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppe durch<br />
Behandlung mit Pd(0) und Dimethylbarbitursäure. [123] Daraufhin wurde der Ansatz<br />
halbiert. Eine Hälfte des Harzes wurde mit TFA/TIS/Wasser behandelt, wodurch die<br />
linearen Peptide erhalten wurde. Die andere Hälfte wurde unter Zuhilfenahme von<br />
PyBOP/HOBt cyclisiert und anschließend ebenfalls durch Behandlung mit Säure vom<br />
Harz gespalten. Alle sechs Peptide wurden abschließend mittels präparativer RP-<br />
HPLC aufgereinigt. Da die Spaltung der Peptide mit 95% TFA-Lösung durchgeführt<br />
wurde und auch den verwendeten HPLC-Eluenten TFA zugesetzt wurde, kann davon<br />
ausgegangen werden, dass die Peptide als TFA-Salz vorliegen.<br />
87
5 Anwendung der Methode<br />
5.5.2 SPR-Experimente<br />
Die Oberflächen-Plasmonen-Resonanzspektroskopie [124, 125] (SPR-Spektroskopie) ist<br />
eine wichtige Methode zur Messung von Bindungskonstanten der Interaktion zweier<br />
Biomoleküle. [45]<br />
Kommerziell erhältliche Systeme werden von der Firma Biacore (Uppsala,<br />
Schweden) hergestellt. Kernstück der Anlage ist eine Fließkammer mit optischer<br />
Einheit und angrenzendem austauschbarem Sensor-Chip. Zur Messung der<br />
Bindungskonstante ist einer der Bindungspartner auf der Oberfläche des Sensor-<br />
chips immobilisiert (Ligand), während eine Probe des anderen Bindungspartners<br />
über ein Mikrofluidik-Kanalsystem geleitet wird. Ändert sich durch Bindung von<br />
Molekülen die Massen-Konzentration und damit der Brechungsindex an der<br />
Oberfläche, wird dies als SPR-Antwort gemessen und graphisch als Funktion der<br />
Zeit in einem Sensorgramm dargestellt. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass die<br />
Messung der Interaktion von Biomolekülen ohne Markierung, wie zum Beispiel<br />
Fluoreszenz-Label, in Real-Zeit erfolgen kann. Die Biacore-Technik erlaubt dabei<br />
nicht nur Messungen von Affinitäten im Gleichgewicht (KD- bzw. KA), sondern auch<br />
die Messung von Geschwindigkeitskonstanten für den Assoziations- bzw. Dis-<br />
soziationsschritt (koff bzw kon). Ein weiterer Vorteil der Methode ist ihre hohe<br />
Sensitivität, womit für eine Messung nur geringe Mengen an Probe benötigt<br />
werden. [126]<br />
88<br />
Abb. 5.11 a) Aufbau des SPR-Systems. b) Abfall der Intensität des reflektierten Lichts<br />
durch SPR-Anregung in Abhängigkeit des Einfallswinkels. [126]
5 Anwendung der Methode<br />
Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR) entsteht durch die Interaktion von Licht mit<br />
einer geeigneten Metall- oder Halbleiteroberfläche, durch die ein quantenoptischer<br />
Effekt ausgelöst wird. Unter bestimmten Bedingungen kann die Energie von<br />
Photonen auf Elektronen-Pakete der Metalloberfläche, Plasmonen genannt,<br />
übertragen werden. Dieser Energie-Transfer erfolgt bei Einstrahlung mono-<br />
chromatischen Lichts bei einem spezifischen Einfallswinkel. Jede Änderung der<br />
Zusammensetzung der Oberfläche und somit des Brechungsindex ändert den<br />
Einfallswinkel bei dem eine maximale Absorption auftritt, dem sogenannten SPR-<br />
Winkel. Dieser Zusammenhang zwischen Änderung des Brechungsindex der<br />
Oberfläche und dem SPR-Winkel ist linear proportional. Die Maßeinheit für das SPR-<br />
Signal ist die Resonanz-Einheit (resonance unit, RU), wobei 1000 RU einer Ver-<br />
änderung des Resonanzwinkels um 0,1° entsprechen. [126]<br />
Abb. 5.12 Der Sensorchip a) Aufbau eines CM5 Sensorchips. b) Der Ligand ist an der<br />
Sensoroberfläche immobilisiert. Der in der mobilen Phase enthaltene Analyt<br />
tritt mit dem immobilisierten Liganden in Interaktion.<br />
Die SPR-Messungen wurden an einem BiacoreT100-Gerät durchgeführt. Beim zu<br />
untersuchenden Bindungssystem stellt sich die Frage, welcher der beiden Bindungs-<br />
partner immobilisiert und welcher als Analyt über die Oberfläche geleitet werden soll.<br />
Betrachtet man dies aus rein physikalischer Sicht des experimentellen Aufbaus, so<br />
wird idealerweise das kleinere Molekül, also das Peptid, immobilisiert. Durch<br />
Interaktion mit dem deutlich größeren Analyt (Protein) kommt es zu einer deutlichen<br />
Veränderung des Brechungsindex und folglich zu einer stärkeren SPR-Antwort. Für<br />
die Bestimmung der Bindungskonstanten wird der Analyt in verschiedenen<br />
89
5 Anwendung der Methode<br />
Konzentrationen als mobile Phase verwendet, wodurch relativ große Mengen an<br />
Substanz benötigt werden. Im Vergleich dazu wird für die Immobilisierung des<br />
Liganden nur sehr wenig Substanz benötigt. Aus Kostengründen ist es somit oftmals<br />
besser, das teuere Protein zu immobilisieren und das Peptid als Analyt zu<br />
verwenden. Zudem hat das Immobilisieren des Proteins den Vorteil, dass mit einem<br />
Chip mehrere Peptide auf ihre Interaktion hin getestet werden können. Wie bei allen<br />
Immobilisierungen ist auch bei der Beladung der Sensorchipoberfläche mit dem<br />
Liganden darauf zu achten, dass der Ligand durch die Immobilisierung nicht an<br />
Aktivität verliert. Ein solcher Verlust könnte beispielsweise erfolgen, wenn eine für die<br />
Interaktion wichtige Stelle des Moleküls (Bindungsdomäne) zur Immobilisierung<br />
verwendet würde oder die dreidimensionale Struktur des Liganden beeinträchtigt<br />
würde. Ich habe mich für die Immobilisierung des Proteins (Streptavidin) auf einem<br />
CM5-Sensorchip entschieden. Der Aufbau eines solchen CM5-Sensorchips ist in<br />
Abb. 5.12 a) dargestellt. Bei allen Sensorchips der CM-Serie ist eine Carboxylmethyl-<br />
dextranmatrix kovalent an die Goldoberfläche gebunden. Die Dextranmatrix ist<br />
flexibel und erlaubt dem daran fixierten Liganden relativ freie Bewegungen. Der<br />
CM5-Sensorchip ist der am häufigsten eingesetzte Chip der CM-Serie. Er zeichnet<br />
sich dadurch aus, dass sowohl kleine als auch sehr große Moleküle daran<br />
immobilisiert werden können. Anstelle von CM5-Sensorchips wäre auch die<br />
Verwendung von Streptavidin- Sensorchips denkbar. Zwei Gründe sprechen jedoch<br />
gegen deren Einsatz: Zum Ersten sind diese erheblich teurer als CM5-Sensorchips,<br />
und zum Zweiten hat man keinen Einfluß auf deren Beladung. Belädt man die CM5-<br />
Sensorchipoberfläche jedoch selbst mit Streptavidin, kann die Beladung gesteuert<br />
werden.<br />
N<br />
HN N<br />
O N O Ligand<br />
HO O EDC O O NHS O O<br />
O<br />
90<br />
Abb. 5.13 Immobilisierungsstrategie auf CM 5 Sensor-Chip.<br />
H<br />
NH 2<br />
Ligand<br />
NH
5 Anwendung der Methode<br />
Die Immobilisierung des Streptavidins auf dem Chip erfolgte nach dem von Biacore<br />
empfohlenen Standardprotokoll [126] durch Aktivierung der Carboxylgruppe auf der<br />
Dextranoberfläche mit N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und<br />
N-Hydroxysuccinimid (NHS). Durch die Aktivierung bildet sich ein Aktivester, der<br />
dann mit primären Aminofunktionen des Streptavidins (ε-Aminofunktion der Lysin-<br />
seitenkette) reagieren kann (Abb. 5.13). Nach der Belegung der Oberfläche mit<br />
Streptavidin wurden noch aktive Carboxylfunktionen durch Injektion von Ethanolamin<br />
gecappt. Eine der vier Messzellen des CM5-Chips wurde als Referenzzelle<br />
verwendet. Ihre Behandlung erfolgte analog zur Messzelle, jedoch ohne Streptavidin-<br />
injektion.<br />
Die Bindungsstudien erfolgten mit den oben beschriebenen Peptiden (93/92, 97/96,<br />
95/94). Zunächst wurden die Messungen mit Peptidlösungen in einem<br />
Konzentrationsbereich von 0,33-677 µM im Falle der linearen bzw. 0,36-731 µM im<br />
Falle der cyclischen Peptide durchgeführt. Die Lösungen wurden als 1:1 Verdün-<br />
nungsreihe hergestellt. Zur Regenerierung der Chipoberfläche musste lediglich mit<br />
Laufpuffer gespült werden. Die Auswertung erfolgte als Differenzmessung, hierfür<br />
wurde das Signal der Referenzzelle vom Signal der eigentlichen Bindungsmesszelle<br />
subtrahiert. Somit kann sichergestellt werden, dass ausschließlich die tatsächlich<br />
auftretende Interaktion zwischen Streptavidin (Ligand) und Peptid (Analyt) untersucht<br />
wird. Die erhalten Sensorgramme wurden durch Anwendung der Steady-State-<br />
Affinity-Methode mit der Herstellersoftware ausgewertet.<br />
91
5 Anwendung der Methode<br />
Abb. 5.14 Sensorgramm der Bindung des cyclischen Peptids 92 und die Steady-State-<br />
Affinity-Auswertung zur Ermittlung der Bindungskonstanten. Die Auswertung<br />
ergab KD=323 ± 24 µM.<br />
Abb. 5.14 zeigt ein Sensorgramm, das aus der Messung der Interaktion des<br />
cyclischen Peptids 92 erhalten wurde. Aus dem Sensorgramm wird ersichtlich, dass<br />
die Assoziation und Dissoziation des Protein-Peptid-Komplexes sehr schnell<br />
vonstatten gehen. Eine Ermittlung der Bindungskonstanten über kinetische Werte ist<br />
somit nicht möglich. Die Auswertung erfolgte deshalb ausschließlich über die<br />
Anwendung der Steady-State-Affinity-Methode, welche Messwerte nach Einstellung<br />
des Gleichgewichts für die Berechnung von KD-Werten heranzieht. Eine Darstellung<br />
zur Ermittlung der Bindungskonstante ist ebenfalls in Abb. 5.14 zu sehen. Für das<br />
aus dem Screening positiv hervorgegangene cyclische Peptid 92 wurde eine<br />
Bindungskonstante von 323 ± 24 µM bestimmt. Für alle anderen Peptide ergaben<br />
sich Bindungskonstanten, die außerhalb des gemessenen Konzentrationsbereiches<br />
lagen. Um auch von ihnen brauchbare Werte zu erhalten, wurde die Messung mit<br />
einer Peptidkonzentration von 0,01-10 mM wiederholt. Die ermittelten Bindungs-<br />
konstanten können Tabelle 8 entnommen werden.<br />
92
Verbindungsnr.<br />
Linear/Cyclisch<br />
5 Anwendung der Methode<br />
Tabelle 8 Die aus dem SPR-Experiment erhaltenen Bindungskonstanten. Experimente,<br />
die keine brauchbaren Werte ergaben, wurden mit ND (no data) gekenn-<br />
zeichnet.<br />
Sequenz KD (mM)<br />
des linearen Peptids<br />
KD (mM)<br />
des cyclischen Peptids<br />
93/92 H-KHPQHGEβAPPR-NH2 2,76 ± 0,46 0,323 ± 0,024<br />
95/94 H-KHGHPQEβAPPR-NH2 1,80 ± 0,24 8,6 ± 2,7<br />
97/96 H-KQPHHGEβAPPR-NH2 ND ND<br />
Im Falle der Peptide 93/92 mit Hitsequenz zeigte das cyclische Peptid eine<br />
Bindungsaffinität zu Streptavidin von KD = 323 ± 24 µM, während das lineare Peptid<br />
um einen Faktor von 8,5 schlechter band. Dies belegt, dass durch die Cyclisierung<br />
ein Peptid in einer für die Bindung günstigen Konformation fixiert werden kann. Der<br />
umgekehrte Fall zeigt sich bei den Peptiden 94/95 mit HPQ-Motiv in den Positionen<br />
4-6. Hier wurde für die cyclische Form ein KD von 8,6 ± 2,7 mM bestimmt, der<br />
offensichtlich zu hoch war, um die Verbindung beim Bibliotheksscreening<br />
anzufärben. Das (nicht in der Bibliothek enthaltene) lineare Peptid zeigte eine fast<br />
fünffach bessere Bindung. In diesem Fall wird durch die Cyclisierung eine für die<br />
Bindung ungünstige Konformation fixiert. Diese Beobachtung unterstreicht die<br />
Bedeutung der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Analyse von Cyclopeptid-<br />
bibliotheken, bei der die harzgebundenen Cyclopeptide nicht mit linearen Peptid-<br />
fragmenten verunreinigt sind, die zu falschpositiven Ergebnissen führen können.<br />
Mit den durchgeführten SPR-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die mit der<br />
neu entwickelten Methode identifizierten Peptide tatsächlich Hitsequenzen sind.<br />
Durch diesen tag-freien Ansatz kann die Kombination von PED und massenspektro-<br />
metrischer Analyse einzelner Harzkugeln jetzt auch auf OBOC-Cyclopeptid-<br />
bibliotheken zur Untersuchung biologisch relevanter Fragestellungen angewandt<br />
werden.<br />
93
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
6.1 Darstellung von Phosphopeptiden<br />
Prinzipiell gibt es zwei unterschiedliche Ansätze zur Darstellung phosphorylierter<br />
Peptide, die globale Phosphorylierung der Peptide und den Einbau von bereits<br />
[32, 127]<br />
phosphorylierten Aminosäuren während der Peptidelongation.<br />
Abb. 6.1 Globale Phosphorylierung: A) mit Phosphorchloridat B) mit Phosphoramidit.<br />
Bei der globalen Phosphorylierung wird die Phosphatgruppe nach der<br />
Peptidsynthese (post-synthetisch) durch Behandlung mit Phosphorylierungsrea-<br />
genzien, wie zum Beispiel Phosphorchloridat 99 oder Phosphoramidit 103, eingeführt<br />
(Abb. 6.1). Diese Methode bedarf keinerlei Veränderungen bei der Synthese des<br />
Peptids. Für eine gezielte Phosphorylierung ist jedoch eine speziell abgestimmte<br />
Schutzgruppenstrategie notwendig. Bedient man sich des Phosphorchloridats 99 als<br />
Phosphorylierungsreagenz, so greifen unter basischen Bedingungen alle frei vor-<br />
liegenden Hydroxylgruppen des Peptids am Phosphoratom von 99 an und man<br />
gelangt zum Phosphorsäuretriester 100 (Abb. 6.1 A). Bei der Verwendung von<br />
95
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Phosphoramidit 103 bildet sich unter leicht sauren Bedingungen (Tetrazol) zunächst<br />
ein Phosphittriester-Intermediat 104. Das Phosphoratom liegt hierbei als P III vor und<br />
muss im nächsten Schritt zum Phosphorsäuretriester 105 mit P V oxidiert werden.<br />
Gebräuchliche Oxidierungsmittel hierfür sind meta-Chlorperbenzoesäure (mCPBA),<br />
tert-Butylhydroxyperoxid und wässrige Jodlösung. Während der Oxidation kann es<br />
leicht zu Nebenreaktionen, wie der Oxidation in den Seitenketten von Cystein,<br />
Methionin und Tryptophan, kommen. Phosphoramidite sind reaktiver als<br />
Phosphorchloridate und werden bei Weitem häufiger verwendet. [127]<br />
Abb. 6.2 Fmoc-Tyr[PO(OBzl)OH]OH 107, der gebräuchlichste Baustein für<br />
Phosphotyrosin beinhaltende Peptide in der Standard-Fmoc-SPPS.<br />
Bedient man sich bereits phosphorylierter Aminosäurederivate, welche mit Schutz-<br />
gruppen versehen sind als Bausteine in der Peptidsynthese, so umgeht man die<br />
Problematik der Oxidation und der Phosphorylierung aller freien Hydroxygruppen.<br />
Die Phosphat-Gruppe wird durch den Gebrauch von Schutzgruppen maskiert, um die<br />
Bildung von Pyrophosphat und Dephosphorylierungen zu verhindern. [128] Bei der<br />
Darstellung von Phosphotyrosin beinhaltenden Peptiden ist der Einsatz von Fmoc-<br />
Tyr[PO(OBzl)OH)]-OH am gebräuchlichsten (Abb. 6.2). Die Benzylgruppe lässt sich<br />
leicht einführen und kann durch Behandlung mit TFA, parallel mit den anderen<br />
säurelabilen Schutzgruppen, schnell entfernt werden. Gewöhnlich finden nur<br />
Monobenzylester Verwendung in der Fmoc/t-Bu SPPS. Dibenzylester bringen keinen<br />
Vorteil, da sie bei der Behandlung mit Piperidin (Fmoc-Entschützen) zu<br />
Monobenzylester umgewandelt werden. [129] Das Einbringen einer<br />
Phosphoaminosäure ist eine schwerwiegende Veränderung in der Sequenz des<br />
Peptids. Peptidsequenzen, die ohne Phosphorylierung leicht zu synthetisieren waren,<br />
96
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
können mit Phoshorylierung durchaus nur schwer zugänglich sein. In diesem Fall<br />
wäre die post-synthetische Phosphorylierung gegebenenfalls die bessere Wahl.<br />
Phosphotyrosin beinhaltende Peptide zeigen ein charakteristisches UV-Spektrum,<br />
die aromatische Hydroxyl-Gruppe des Tyrosins ist hypsochrom verschoben (von 275<br />
zu 266 nm). [32]<br />
97
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
6.2 Auswahl des Fluoreszenzlabels<br />
Die Auswahl des Fluoreszenzlabels wird vor allem von der späteren Anwendung<br />
bestimmt. Wie bereits erwähnt, sollen die hier beschriebenen Peptide in einem SH2-<br />
Domänen-Mikroarray angewendet werden. Das Fluoreszenzlabel muss also in erster<br />
Linie an den Chipreader angepasst sein. Der in der Gruppe von Prof. Hauck<br />
verwendete Chipreader ist für die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und<br />
Cy5 ausgestattet. Möchte man kostengünstigere Farbstoffe als Label verwenden, so<br />
muss man darauf achten, dass diese ähnliche spektroskopische Eigenschaften<br />
aufweisen. Sulforhodamin-B-sulfonylchlorid ist ein geeigneter Farbstoff und wurde in<br />
unserer Gruppe bereits als Fluoreszenzlabel verwendet (Tabelle 9). [130]<br />
Tabelle 9 Vergleich der spektralen Eigenschaften von Sulforhodamin-B-sulfonylchlorid<br />
Farbstoff Farbe des<br />
(SRBS chlorid) mit Cy3.<br />
Fluoreszenzlichtes<br />
λ max, abs.<br />
[nm]<br />
λ max, em.<br />
[nm]<br />
ε max<br />
[10 5 M -1 cm -1 ]<br />
SRBS-OH Orange 564 583 7,2 0,33<br />
Cy3 Orange 550 570 15,0 >0,15<br />
98<br />
φF
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
6.3 Synthese der beiden Peptide Y241 und pY241<br />
Da die Peptide als Peptidylsäure erhalten werden sollten, erfolgte die SPPS am dafür<br />
gängigen Polystyrol-basierten Wang-Harz 108 (Abb. 6.3). Das kommerziell<br />
erhältliche Harz 108 wurde nach der MSNT/MeIm-Methode [32] mit der C-terminalen<br />
Aminosäure (hier Fmoc-Ala-OH) beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von<br />
0,2 mmol/g.<br />
HO<br />
Fmoc-SPPS<br />
am ABI433A<br />
O<br />
Fmoc<br />
N<br />
H<br />
O<br />
Wang<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Xaa,<br />
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,<br />
20eq. DIPEA<br />
Fmoc-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(O t Bu)-Thr( t Bu)-Asn(Trt)-Ile-Tyr( t Bu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Met-Asp(O t Bu)-His(Trt)-Lys(Boc)-Ala<br />
N<br />
O<br />
N<br />
SO 3<br />
Wang-Linker<br />
SRBS<br />
O<br />
S<br />
O<br />
108<br />
1) 5eq. MSNT,<br />
3,75eq. MeIm,<br />
5eq. Fmoc-Ala-OH<br />
2) 13eq. BzOH,<br />
2,6eq. Pyridine<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 4eq. SRBS-Chlorid<br />
6eq. DIPEA<br />
3) Reagenz K<br />
109<br />
Wang<br />
Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-Met-Asp-His-Lys-Ala-OH SRBS-Y241<br />
Abb. 6.3 Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y241.<br />
110<br />
99
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Abb. 6.4 UV-Monitoring der Fmoc-Abspaltung während der automatisierten SPPS von<br />
110.<br />
Der Syntheseweg des Peptids SRBS-Y241 ist in Abb. 6.3 aufgezeigt. Der Aufbau der<br />
Peptidkette erfolgte nach Standard-Fmoc-SPPS-Bedingungen am Peptidsynthesizer<br />
im 20 µmol Ansatz. Der Verlauf der Synthese wurde mittels UV-Monitoring verfolgt<br />
(Abb. 6.4). Eine Testabspaltung direkt nach der automatisierten Synthese mit<br />
anschließender RP-HPLC-offline-ESI-MS-Analyse bestätigte den Erfolg der<br />
Synthese. Es folgte eine manuelle Behandlung des Harzes mit 20% Piperidin in DMF<br />
zur Entfernung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe. Deren Vollständigkeit wurde<br />
ebenfalls durch UV-Messung überprüft. Nach ausführlichem Waschen und Trocknen<br />
des Peptidylharzes erfolgte die Anknüpfung der Fluoreszenzmarkierung. Hierzu<br />
wurde das Harz über Nacht mit einer Lösung aus 4 eq. Sulforhodamin-B-<br />
sulfonylchlorid (SRBS-Chlorid) und 6eq. DIPEA in DMF behandelt. Daraufhin wurde<br />
das fluoreszenzmarkierte Peptid mit Reagenz K vom Harz gespalten. Unter diesen<br />
Bedingungen werden simultan alle säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen entfernt.<br />
Das Peptid SRBS-Y241 wurde ausgefällt, mittels präparativer RP-HLPC aufgereinigt<br />
und konnte mit einer Ausbeute von 34% (bezogen auf 20 µmol) erhalten werden.<br />
100
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Abb. 6.5 Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids SRBS-pY241.<br />
Der Syntheseweg des Phosphopeptids SRBS-pY241 ist in Abb. 6.5 aufgeführt. Die<br />
Elongation der ersten sieben Aminosäuren erfolgte analog zum Aufbau von Y241 am<br />
Peptidsynthesizer. Die Anknüpfung des Phosphotyrosinbausteins, sowie die des<br />
darauffolgenden Isoleucins wurden manuell durchgeführt. Als Kupplungsreagenz<br />
wurde PyBOP/HOBt verwendet. Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte<br />
wiederum am Peptidsynthesizer. Auch das anschließende Labeln mit SRBS, sowie<br />
die Abspaltung und Aufreinigung erfolgten analog zum Aufbau von Y241. Das<br />
fluoreszenzmarkierte Phosphopeptid SRBS-pY241 konnte mit einer Gesamt-<br />
ausbeute von 13% (bezogen auf 20 µmol) erhalten werden.<br />
101
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
6.4 Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230<br />
Für die Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230 wurde das Wang-Harz mit der<br />
MSNT/MeIm-Methode [32] mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen. Die Beladungsdichte<br />
betrug 0,7 mmol/g.<br />
Ausgehend von Fmoc-Asp(OtBu)-Wang-Harz erfolgte die automatisierte Synthese im<br />
20 µmol Ansatz am Peptidsynthesizer (Abb. 6.6). Auch hier wurde der<br />
Syntheseverlauf über die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mittels UV-Messung<br />
verfolgt. Das UV-Monitoring der Synthese ist in Abb. 6.7 gezeigt. Die Synthese verlief<br />
bei weitem nicht optimal. Es konnten zwei deutliche Einbrüche der Synthese<br />
detektiert werden. Die Testabspaltung im Anschluss an die SPPS mit<br />
darauffolgender RP-HPLC-offline-ESI-MS-Analyse bestätigte den Syntheseeinbruch.<br />
Es wurde eine acetylierte Fragmentreihe der Peptidsequenz gefunden, die Fmoc-<br />
geschützte vollständige Peptidsequenz 115 konnte nur in geringen Mengen erhalten<br />
werden (Abb. 6.10).<br />
102<br />
Abb. 6.6 Automatisierte Synthese des Peptids 115 am Peptidsynthesizer.
Abb. 6.7 UV-Monitoring der automatisierten SPPS von 115.<br />
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Ein häufiger Grund für den Sytheseeinbruch bei der SPPS ist die Ausbildung von<br />
Sekundarstrukturelementen (vor allem β-Faltblatt-Strukturen) während des<br />
Peptidaufbaus. [131, 132] Prolin beziehungsweise N-alkylierte Aminosäuren weisen eine<br />
natürliche Neigung als Sekundärstrukturbrecher auf. Nach deren Vorbild wurden<br />
Aminosäurederivate entwickelt, mit deren Hilfe auch schwer zugängliche<br />
Peptidsequenzen synthetisierbar gemacht werden können. Vertreter hierfür sind, wie<br />
in Abb. 6.8 zusehen, Pseudoprolin, [133, 134] Hmb-, [135, 136] Dmb-, [137] Tmob [138] -<br />
Aminosäuren und O-Isoacyldipeptide [139, 140] . Sie werden als Strukturbrecher in die<br />
Peptidsequenz eingebaut. Nach vollständigem Aufbau der Peptidkette werden sie<br />
gemeinsam mit den säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen in die entsprechenden<br />
Aminosäuren überführt. Der Vollständigkeit halber bleibt zu erwähnen, dass<br />
O-Isoacylpeptide hierbei eine Sonderrolle einnehmen, da sie erst durch eine<br />
abschließende Änderung des pH-Werts vom Depsipeptid zum Peptid umgelagert<br />
werden.<br />
103
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Pseudoprolin<br />
N<br />
H<br />
R 1<br />
O<br />
N<br />
O<br />
R 3<br />
O<br />
NH<br />
R 2<br />
O<br />
R 2 : H = Ser<br />
CH 3 = Thr<br />
116 117<br />
O-Isoacylpeptid<br />
N<br />
H<br />
R 1<br />
O<br />
BocHN<br />
O R 2<br />
118<br />
O<br />
H<br />
N<br />
R 3<br />
O<br />
R 2 : H = Ser<br />
CH 3 = Thr<br />
N-Alkyl-Aminosäure<br />
N<br />
H<br />
R 1<br />
R ' O OMe<br />
N<br />
O<br />
O<br />
R 3<br />
R 2<br />
NH<br />
R''<br />
O<br />
R' R''<br />
Dmb: CH 3 H<br />
Hmb: H H<br />
Tmob: CH 3 OCH 3<br />
Abb. 6.8 Peptide mit eingebauten Sekundärstruktur-brechenden Amniosäurederivaten.<br />
Mutters Pseudoprolin-Dipeptide sind zweifelsfrei die effektivsten und am einfachsten<br />
einzuführenden Vertreter. [64, 141] Sie setzen jedoch einen Serin- bzw. Threoninrest in<br />
der Peptidsequenz voraus, welche als Prolin-ähnliche TFA-labile Oxazolidine<br />
geschützt eingesetzt werden. Üblicherweise werden Pseudoproline zusammen mit<br />
ihrer N-terminal benachbarten Aminosäure als Dipeptid eingeführt. Somit muss der<br />
sterisch gehinderte Oxazolidin-Stickstoff nicht acyliert werden. Solche Pseudoprolin-<br />
Dipeptide sind als gebrauchsfertige Bausteine für die Fmoc-SPPS kommerziell<br />
erhältlich. Um einen optimalen Nutzen zu erzielen, sollten folgende Punkte beachtet<br />
werden: Der optimale Abstand zum N- bzw. C-Terminus, sowie zu einem Prolinrest,<br />
beträgt 5-6 Aminosäuren. Der Mindestabstand zwischen zwei Pseudoprolin-<br />
Dipeptiden bzw. zu Prolin sollte zwei Aminosäuren sein. Pseudoprolin-Dipeptide<br />
sollten möglichst vor einem hydrophoben Sequenzbereich eingeführt werden. [134]<br />
Da das in der automatisierten Standard-Synthese fehlgeschlagene Peptid 115 ein<br />
Serin-Rest enthält, habe auch ich mich für den Einsatz eines Pseudoprolin-Dipeptid-<br />
Baussteins entschieden. Kritische Syntheseschritte wurden zur besseren Kontrolle<br />
manuell durchgeführt.<br />
104
Fmoc-SPPS<br />
am ABI433A<br />
Fmoc<br />
N<br />
H<br />
O<br />
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Wang<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Xaa,<br />
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,<br />
20eq. DIPEA<br />
3) Ac 2O/HOBt und DIPEA<br />
Fmoc-Ile-Tyr( t Bu)-Glu(O t Bu)-Glu(O t Bu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(O t Bu)<br />
Fmoc NH<br />
O<br />
N<br />
O<br />
O<br />
t BuO<br />
O<br />
manuelle<br />
Fmoc-SPPS<br />
Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Thr( Wang<br />
tBu)-Ala-Ala-Ser( Me,MePro)-Ile-Tyr( tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 121<br />
114<br />
Wang<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Fmoc-Ala-Ser( Me,Me Pro)-OH<br />
5eq. PyBOP/HOBt-Lsg,<br />
10eq. DIPEA<br />
3) 10% Ac 2OinDMF<br />
Ile-Tyr( Wang<br />
tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 120<br />
Fmoc-SPPS<br />
am ABI433A<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Xaa,<br />
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,<br />
20eq. DIPEA<br />
3) Ac 2O/HOBt und DIPEA<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 4eq. SRBS-Chlorid<br />
6eq. DIPEA<br />
3) Reagenz K<br />
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH SRBS-Y230<br />
Abb. 6.9 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y230 unter Verwendung<br />
eines Pseudoprolin-Dipeptids. Zur besseren Steuerung der Synthese wurde<br />
das Peptid teilweise manuell synthetisiert.<br />
Der Syntheseweg ist in Abb. 6.9 aufgeführt. Die ersten neun Aminosäuren der<br />
Peptidkette wurden, wie bereits beschrieben, am Synthesizer verknüpft. Die<br />
darauffolgende Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe von Peptid 119<br />
erfolgte manuell. Die Vollständigkeit der Entschützungsreaktion wurde mittels UV-<br />
Spektroskopie überprüft. Anschließend wurde, ebenfalls manuell, das Pseudoprolin-<br />
Dipeptid durch PyBOP/HOBt-Aktivierung gekuppelt. Auch dieser Reaktionsschritt<br />
wurde auf seine Vollständigkeit hin überprüft. Hierzu wurden der Kaiser [142] - und<br />
TNBS [143] -Test durchgeführt. Nach zusätzlicher Acetylierung wurde die Synthese in<br />
automatisierter Form fortgesetzt. Leider zeigt sich im UV-Monitoring erneut ein<br />
Syntheseeinbruch zwischen Thr und Arg (ähnlich wie in Abb. 6.7 Einbruch II).<br />
Unmittelbar nach der Synthese am Synthesizer wurde eine Testabspaltung von 121<br />
119<br />
105
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
mit anschließender RP-HPLC-offline-MS-Analyse durchgeführt (Abb. 6.10 unten).<br />
Dabei wurde deutlich, dass auch in diesem Ansatz ein Teil als Abbruchsequenz<br />
erhalten wurde. Der Anteil des gewünschten Peptids ist jedoch deutlich höher als<br />
beim vollständig automatisierten Vorgehen. Der weitere manuelle Syntheseverlauf<br />
erfolgte analog zu SRBS-Y241 und SRBS-pY241. Nach präparativer RP-HPLC<br />
konnte das Peptid SRBS-Y230 in 6% Ausbeute erhalten werden. Da die erhaltene<br />
Menge des Peptids für den Einsatz in den Mikroarray-Experimenten ausreichte,<br />
wurde auf eine weitere Optimierung der Synthese verzichtet.<br />
106<br />
Abb. 6.10 RP-HPLC-Chromatogramme im Vergleich (Detektion bei 214 nm). Das obere<br />
Chromatogramm zeigt die Testabspaltung von 115, welches vollständig<br />
automatisiert dargestellt wurde. Das untere Chromatogramm zeigt die<br />
Testabspaltung von 121, das unter Verwendung von Pseudoprolin und nicht<br />
vollständig automatisiert synthetisiert wurde.
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
In Abb. 6.11 ist der Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids<br />
SRBS-pY230 dargestellt. Aufgrund der Erfahrungen bei der Synthese von Peptid<br />
115 und SRBS-Y230 wurden nur die ersten fünf Aminosäuren der Peptidkette am<br />
Synthesizer verknüpft. Die weitere Synthese wurde manuell durchgeführt. Dabei<br />
wurden alle Fmoc-Abspaltschritte mittels UV-Spektroskopie und alle<br />
Kupplungschritte mittels Kaiser [142] - und TNBS [143] -Test auf ihre Vollständigkeit hin<br />
überprüft. Da sich in den vorhergehenden Synthesen die letzten beiden<br />
Kettenverlängerungsschritte (Arg und Pro) als problematisch erwiesen, wurde bei<br />
deren Kupplung das reaktivere PyAOP als Aktivierungsreagenz verwendet. [144] Die<br />
Einführung des Fluoreszenzlabels, die Abspaltung vom Harz, sowie die weitere<br />
Aufarbeitung erfolgte analog zu den bereits beschriebenen Peptiden SRBS-Y230,<br />
SRBS-pY241 und SRBS-Y241. Das fluoreszenzmarkierte Peptid SRBS-pY230<br />
wurde nach präparativer RP-HPLC mit einer Ausbeute von 14% erhalten.<br />
Fmoc-SPPS<br />
am ABI433A<br />
Fmoc<br />
N<br />
H<br />
O<br />
Wang<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Xaa,<br />
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,<br />
20eq. DIPEA<br />
3) Ac 2O/HOBt und DIPEA<br />
Fmoc-Glu(O t Bu)-Glu(O t Bu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(O t Bu)<br />
manuelle<br />
Fmoc-SPPS<br />
t BuO<br />
O<br />
114<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Xaa<br />
5eq. PyBOP/HOBt-Lsg,<br />
10eq. DIPEA<br />
3) 10% Ac 2OinDMF<br />
Fmoc-Thr( Wang<br />
tBu)-Ala-Ala-Ser( Me,MePro)-Ile-Tyr[PO(OBzl)]-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 123<br />
manuelle<br />
Fmoc-SPPS<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 5eq. Fmoc-Arg(Pbf)-OH<br />
5eq. PyAOP/HOAt-Lsg,<br />
10eq. DIPEA<br />
3) 10% Ac 2OinDMF<br />
Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Thr( Wang<br />
tBu)-Ala-Ala-Ser( Me,MePro)-Ile-Tyr[PO(OBzl)]-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 124<br />
1) 20% Piperidin<br />
2) 4eq. SRBS-Chlorid<br />
6eq. DIPEA<br />
3) Reagenz K<br />
Wang<br />
122<br />
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH) 2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH<br />
SRBS-pY230<br />
Abb. 6.11 Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids SRBS-pY230.<br />
107
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide<br />
Alle vier gewünschten Peptide konnten somit erfolgreich dargestellt und in<br />
ausreichender Menge an die Arbeitsgruppe von Prof. Hauck übergeben werden. Sie<br />
wurden als Liganden in SH2-Domänen-Mikroarrays eingesetzt und es gelang,<br />
verschiedene SH2-Domänen als spezifische Interaktionspartner zu identifizieren.<br />
108
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
7.1 Analytik von Cyclopeptiden<br />
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Cyclische Peptide zeigen eine vielfältige biologische Aktivität und haben ein enormes<br />
Potential als Modell bei der Erforschung des Zusammenhangs von Aktivität und<br />
chemischer Struktur. Mit der Split-Mix-Methode steht ein wertvolles Verfahren zur<br />
effizienten Synthese von großen cyclischen Peptidbibliotheken zur Verfügung. Durch<br />
ihre besondere strukturelle Beschaffenheit sind cyclische Peptide jedoch schwer zu<br />
analysieren.<br />
Der in dieser Arbeit vorgestellte Ansatz besteht darin, cylische Peptide zur<br />
Sequenzbestimmung gezielt in lineare Peptide zu überführen, um sie dann<br />
massenspektrometrisch zu identifizieren. Dies erfordert ein enges Zusammenspiel<br />
von chemischer Synthese und massenspektrometrischer Analyse.<br />
In der vorliegenden Arbeit wurden fünf verschiedene Konzepte zur gezielten<br />
Ringöffnung, mit Hilfe sogenannter Sollbruchstellen, auf Ihre Anwendbarkeit hin<br />
untersucht.<br />
Abb. 7.1 Photolabile Sollbruchstelle<br />
Mit dem Einbau der photoaktiven Verbindung 7 in den Peptidzyklus sollte es möglich<br />
sein, den Ring durch Bestrahlung mit UV-Licht zu öffnen (Abb. 7.1). Zur Überprüfung<br />
des Konzeptes wurde eine kleine Bibliothek aus fünf Peptiden synthetisiert. Es zeigte<br />
109
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
sich, dass die cyclischen Peptide durch Bestrahlung eine Reaktion eingehen. Es<br />
stellte sich jedoch heraus, dass das primär gebildete Produkt nicht stabil war. Da die<br />
Isolierung beziehungsweise die Identifizierung eines finalen Produktes nicht möglich<br />
war, ist dieses Konzept für eine Anwendung als Sollbruchstelle nicht geeignet.<br />
Abb. 7.2 Methionin als Sollbruchstelle<br />
Durch den Einsatz von Methionin im peptidischen Ring sollte eine Bromcyan-<br />
vermittelte Ringöffnung durchführbar sein (Abb. 7.2). Die gezielte Ringöffnung konnte<br />
mit Peptid 31/33 erfolgreich gezeigt werden.<br />
Abb. 7.3 Trypthophan als Sollbruchstelle<br />
Eine weitere denkbare Ringöffnung ist die oxidative Halogenierung von Tryptophan<br />
mit anschließender Hydrolyse (Abb. 7.3). Die Überprüfung des Konzeptes anhand<br />
des rückgratcyclisierten Peptids 63 zeigte, dass die Spaltung des Peptids auf diese<br />
Weise möglich ist. Da die Spaltung jedoch nicht vollständig verlief, ist diese<br />
chemoselektive Spaltung für unsere Anwendung ungeeignet.<br />
110
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Desweiteren wurde ein nicht-chemischer Ansatz verfolgt. Hierzu wurde das<br />
rückgratcyclische Peptid 71 einem tryptischen Verdau unterworfen. Der Peptidzyklus<br />
blieb von dieser Behandlung völlig unbeeinflusst, womit diese Methode ungeeignet<br />
ist.<br />
Abb. 7.4 Phenylisothiocyanat vermittelte Ringöffnung<br />
Schließlich wurde die bereits in unserer Gruppe verwendete Phenylisothiocyanat<br />
vermittelte Ringöffnung mit ins Konzept aufgenommen (Abb. 7.4). Hierzu wurden<br />
Peptide verwendet, bei denen die Cyclisierung über die Seitenketten erfolgte, so<br />
dass der N-Terminus frei zugänglich bleibt. Behandelt man solche Peptide mit den im<br />
Edman-Abbau verwendeten Reagenzien, so erhält man ein lineares Peptid, welches<br />
für die anschließende Sequenzierung zur Verfügung steht. Das N-terminal<br />
gespaltene Phenylthiohydantoin-Derivat verbleibt über Seitenkettenverbrückung im<br />
Peptid gebunden.<br />
Die rein massenspektrometrischen ESI-MS(n)-Experimente an einem ESI-IT-<br />
Massenspektrometer waren zunächst recht vielversprechend. Jedoch zeigte sich im<br />
Verlauf der Arbeit, dass die Substanzmenge, welche auf einer einzelnen Harzkugel<br />
gebunden vorliegt, nicht ausreicht, um zuverlässige und aussagekräftige Spektren zu<br />
erhalten. Desweiteren stellte sich heraus, dass der Erfolg der Primärstrukturanalyse<br />
stark sequenzabhängig ist.<br />
Mit dem Einsatz des Partiellen Edman-Abbaus (PED) und dessen Kombination mit<br />
chemischen Sollbruchstellen konnte eine Methode gefunden werden, die es erlaubt<br />
cyclische Peptide ohne den Verlust des OBOC-Prinzips zu sequenzieren. Das<br />
111
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Konzept wurde erfolgreich auf seitenkettencyclisierte Peptide angewendet. Eine<br />
Erweiterung des Ansatzes auf rückgratcyclisierte Peptide wäre mit Methionin als<br />
Sollbruchstelle gegeben. Bei der Untersuchung als Sollbruchstelle erwies sich<br />
Methionin als sehr geeignet. Da alle Schritte festphasengebunden ablaufen, müsste<br />
für die Anwendung ein geeigneter Linker entwickelt werden, der bei den<br />
erforderlichen Bedingungen stabil ist und dennoch im Anschluss quantitativ<br />
abgespalten werden kann.<br />
Das Zusammenspiel von PED und selektiver Sollbruchstelle ermöglicht eine<br />
gemeinsame Behandlung aller Hitbeads, eignet sich also im High-Throughput-<br />
Einsatz und ist somit dem klassischen Edman-Abbau überlegen. Zudem ist für die<br />
Durchführung keine spezielle Laborausstattung notwendig.<br />
Bei der Ausarbeitung des Konzeptes wurde eine Nebenreaktion beobachtet, welche<br />
erfolgreich aufgeklärt werden konnte.<br />
Abb. 7.5 Die mit Split-Mix-Synthese hergestellte Cyclopeptidbibliothek 86.<br />
Die Anwendbarkeit der Methode konnte anhand der synthetisierten OBOC-Bibliothek<br />
86 gezeigt werden (Abb. 7.5). Diese wurde nach dem Split-Mix-Protokoll dargestellt<br />
und mit einem on-bead-assay auf ihre Streptavidin-Bindungsaktivität hin überprüft.<br />
Durch Anwendung des PED-Konzeptes konnten 20 Hitsequenzen identifiziert<br />
werden. Neben der bereits bekannten Selektivität zum HPQ-Motiv zeigte sich auch<br />
eine Präferenz dieses Motivs in den Position 2-4 (Abb. 7.6).<br />
112
Xaa2<br />
Position<br />
Xaa3<br />
Xaa4<br />
Xaa5<br />
Xaa6<br />
Ala<br />
Gln<br />
Glu<br />
Gly<br />
His<br />
Phe<br />
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Pro<br />
Aminosäure<br />
Abb. 7.6 Screening der Bibliothek K-X2X3X4X5X6E-βAPPRM-TG. Das Diagramm zeigt<br />
die möglichen Aminosäuren an unterschiedlichen Positionen der<br />
Peptidsequenz (farbige Markierung). Die Höhe der Balken gibt den<br />
prozentualen Anteil an, mit der die Aminosäure an der entsprechenden<br />
Position in den Hitbead-Peptidsequenzen gefunden werden konnte.<br />
Zur Bestätigung der Selektivität wurden SPR-Experimente durchgeführt. Hierzu<br />
wurden eine ausgesuchte Hitsequenz, eine Sequenz mit dem HPQ-Motiv in den<br />
Positionen 4-6, die sich nicht unter den Hits befand, sowie als Negativkontrolle eine<br />
modifizierte Hitsequenz mit QPH-Motiv in je linearer und cyclischer Form präparativ<br />
dargestellt. Im Falle der Hitsequenz zeigte das cyclische Peptid eine<br />
Bindungsaffinität zu Streptavidin von KD = 323 ± 24 µM, während das lineare Peptid<br />
um einen Faktor von 8,5 schlechter band. Dies belegt, dass durch die Cyclisierung<br />
ein Peptid in einer für die Bindung günstigen Konformation fixiert werden kann. Der<br />
umgekehrte Fall zeigt sich bei den Peptiden 94/95 mit HPQ-Motiv in den Positionen<br />
4-6. Hier wurde für die cyclische Form ein KD von 8,6 ± 2,7 mM bestimmt, der<br />
offensichtlich zu hoch war, um die Verbindung beim Bibliotheksscreening<br />
anzufärben. Das (nicht in der Bibliothek enthaltene) lineare Peptid zeigte eine fast<br />
fünffach bessere Bindung. In diesem Fall wird durch die Cyclisierung eine für die<br />
Ser<br />
Thi<br />
Trp<br />
10<br />
0<br />
40<br />
30<br />
20<br />
70<br />
60<br />
50<br />
100<br />
90<br />
80<br />
%<br />
113
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Bindung abträgliche Konformation fixiert. Diese Beobachtung unterstreicht die<br />
Bedeutung der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Analyse von Cyclopeptid-<br />
Bbibliotheken, bei der die harzgebundenen Cyclopeptide nicht mit linearen Peptid-<br />
fragmenten verunreinigt sind.<br />
In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode zur effizienten Sequenzierung<br />
cyclischer Peptide aus OBOC-Bibliotheken vorgestellt werden. Das Konzept kommt<br />
ohne tags aus und benötigt kein Edman-Sequenzer oder High-end-Massenspektro-<br />
meter. Damit steht nun eine High-throughput-Methode zur Verfügung, die es<br />
ermöglicht, eine Vielzahl an Hitsequenzen zu identifizieren.<br />
7.2 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide<br />
Die selektive Erkennung spezifischer Phosphopeptide durch SH-2-Domänen spielt<br />
eine wichtige Rolle innerhalb der zellulären Verständigung. Mit Hilfe von SH-2-<br />
Domänen-Mikroarrays lassen sich wichtige Interaktionspartner identifizieren. Im<br />
Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollten vier fluoreszenzmarkierte Peptide<br />
synthetisiert werden, die anschließend in der Arbeitsgruppe von Prof. C. Hauck als<br />
Liganden im SH-2-Domänen-Mikroarray eingesetzt werden sollten.<br />
Abb. 7.7 Fluoreszenzmarkiertes Peptid SRBS-Y241.<br />
Der Aufbau der Peptidkette des Peptids SRBS-Y241 konnte vollständig automatisiert<br />
am Peptidsynthesizer durchgeführt werden. Die Einführung des SRBS-Fluoreszenz-<br />
labels erfolgte ebenfalls an der festen Phase, wurde jedoch manuell durchgeführt.<br />
Nach Abspaltung und Aufreinigung wurde SRBS-Y241 mit einer Gesamtausbeute<br />
von 34% erhalten.<br />
114
Abb. 7.8 Fluoreszenzmarkiertes Phosphopeptid SRBS-pY241.<br />
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Auch Peptid SRBS-Y241 konnte weitestgehend am Peptidsynthesizer dargestellt<br />
werden. Für eine kontrollierbarere Reaktionsführung wurden Phophotyrosin,<br />
Isoleucin und das SRBS-Label manuell eingeführt. SRBS-Y241 wurde mit einer<br />
Gesamtausbeute von 13% erhalten.<br />
N<br />
SRBS-<br />
Fluoreszenzlabel<br />
O<br />
N<br />
H<br />
H 2N<br />
NH<br />
H<br />
N<br />
O<br />
HO<br />
NH<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
Abb. 7.9 Fluoreszenzmarkiertes Peptid SRBS-Y230.<br />
OH<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
H<br />
N<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
N<br />
H<br />
O<br />
O<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
NH 2<br />
HN<br />
O<br />
N<br />
H<br />
N<br />
HO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
SRBS-Y230<br />
Die Synthese von SRBS-Y230 erwies sich als schwierig. Unter vollständiger<br />
Automatisierung am Peptidsynthesizer konnte die Peptidkette nicht aufgebaut<br />
werden. Durch teilweise manuelle Synthese und den Einsatz eines Pseudoprolin-<br />
Dipeptid-Bausteins an Stelle von Serin (Position 6) und Alanin (Position 5) gelang es<br />
jedoch, das Peptid mit einer Ausbaute von 6% darzustellen.<br />
Abb. 7.10 Fluoreszenzmarkiertes Phosphopeptid SRBS-pY230.<br />
115
7 Zusammenfassung und Ausblick<br />
Auch Peptid SRBS-pY230 wurde nur teilweise automatisiert dargestellt. Ab der<br />
Anknüpfung von Phosphotyrosin wurde das Peptid manuell synthetisiert. Da der<br />
Einbau des Pseudoprolin-Dipeptid-Bausteins bei der Synthese von SRBS-Y230 nur<br />
eine stückweise Verbesserung der Synthese erbrachte, wurde die Peptidkette von<br />
SRBS-pY230 zudem bis zum Ende manuell synthetisiert. Dabei wurde für die<br />
Kupplung der letzten beiden Aminosäuren PyAOP/HOAt zur Aktivierung verwendet.<br />
Die Gesamtausbeute betrug 14% und konnte somit im Vergleich zum nicht<br />
phosphorylierten Peptid SRBS-Y230 gesteigert werden.<br />
Alle vier Peptide konnten erfolgreich synthetisiert werden und in ausreichender<br />
Menge für den Einsatz in SH2-Domänen-Mikroarrays an die Arbeitsgruppe von Prof.<br />
C. Hauck übergeben werden, wo sie bereits erfolgreich als spezifische<br />
Interaktionspartner verschiedener SH2-Domänen identifiziert werden konnten.<br />
116
8 Experimenteller Teil<br />
8.1 Allgemeine Angaben zur Analytik<br />
8.1.1 HPLC<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Analytische und präparative RP-HPLC erfolgte an einem modularen HPLC-System<br />
LC-20A prominence ausgestattet mit zwei seriellen Tandemkolbenpumpen LC-20AT,<br />
automatischem Probengeber SIL-20A, Säulenofen CTO-20AC, Photodiodenarray-<br />
detektor SPD-M20A und Datenbus CBM-20A (Shimadzu).<br />
Folgende Säulen kamen zum Einsatz (alle von Knauer):<br />
Nucleosil 100-5 C18, 250x4 mm (analytische Trennung)<br />
Eurosphere 100-5 C18, 250x4 mm (analytische Trennung)<br />
Eurosphere 100-10 C18, 250x16 mm (präparative Trennung)<br />
Die verwendeten Eluenten setzten sich aus den folgenden Lösungen zusammen:<br />
A: 0,1% TFA in Wasser B: 0,1% TFA in Acetonitril<br />
A°:0,1% Ameisensäure in B°: 0,1% Ameisensäure in Acetonitril<br />
Wasser<br />
8.1.2 Massenspektrometrie<br />
Die MALDI-TOF-Massenspektren wurden an einem Bruker Biflex III Spektrometer<br />
mit einem gepulsten Stickstofflaser (337 nm) im positiven reflektron Modus<br />
aufgenommen.<br />
Als Matrix wurde, wenn nicht anders beschrieben, eine gesättigte Lösung aus<br />
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in Acetonitril / 0,1% TFA (aq.) (2:1) verwendet.<br />
Zur Probenpräparation wurden je 0,8 µl der Matrix- und Probenlösung auf das target<br />
aufgetragen, gemischt und bei Raumtemperatur kristallisiert. Die Kalibrierung mittels<br />
linearer Regression wurde mit einer Mischung aus folgenden Peptiden vorge-<br />
nommen: Neurotensin 1672,92 m/z, Angiotensin I 1296,69 m/z, Angiotensin II<br />
117
8 Experimenteller Teil<br />
1046,54 m/z, Bradikinin Fragment [1-7] 757,40 m/z und Bradikinin Fragment [1-5]<br />
573,31 m/z.<br />
ESI-IT-Massenspektren wurden an einem Esquire 3000 plus der Firma Bruker<br />
Daltonics im positiven oder negativen Modus gemessen. Die Proben (ca. 10-<br />
100 µg/mL in Acetonitril / 0,1% wässrige Ameisensäure (2:1)) wurden dabei mit einer<br />
Flussrate von 3 µL/min injiziert.<br />
Die hochaufgelösten Massenspektren wurden an einem Bruker ESI-QTOF-<br />
Massenspektrometer aufgenommen.<br />
GC-MS Analysen wurden an einem Gaschromatographen vom Typ HP 6890 Series<br />
GC System der Firma HP mit Helium als Trägergas durchgeführt. Für die Massen-<br />
detektion wurde ein Mass Selective Detector HP 5973 verwendet.<br />
8.1.3 Kernresonanzspektroskopie<br />
Die gemessenen eindimensionalen Kernresonanzspektren wurden an den Geräten<br />
AC 250 (Bruker), Avance III 400 (Bruker) beziehungsweise Lambda 400 (Jeol)<br />
aufgenommen. Die chemische Verschiebung δ (ppm) wurde auf das jeweilige<br />
Lösungsmittelsignal geeicht. Soweit nicht anders vermerkt, wurden die Spektren in<br />
CDCl3 bei einer Temperatur von 300 K aufgenommen.<br />
Für die Angabe der Multiplizität wurden folgende Abkürzungen verwendet: s =<br />
Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, br = breit, dd = dublet-<br />
tiertes Dublett, tt = triplettiertes Triplett. Die Integrale der Signale wurden auf ein<br />
Signal des Spektrums normiert.<br />
Die zweidimensionalen NMR-Spektren (COSY, HSQC, TOCSY und ROESY) zur<br />
Untersuchung von Peptiden wurden an einem Bruker Avance DRX 600 Spektrometer<br />
bei einer Temperatur von 300 K aufgenommen.<br />
Zur Präparation der Probe wurde etwa 1 mg Peptid in 200 µl D2O/H2O (5:95) gelöst.<br />
Desweiteren wurden 4 µl NaN3-Lösung (400 mM in D2O) zur Konservierung der<br />
118
8 Experimenteller Teil<br />
Probe und 20 µl TSP (10 mM) als Kalibrierstandard zugeben. Anschließend wurde<br />
der pH-Wert durch Zugabe von HCl (1,0 und 0,1 M) auf pH 3 eingestellt.<br />
Die Auswertung der Peptidspektren erfolgte mit dem Programm Cara [37] . Es ist<br />
kostenlos downloadbar unter URL: http://www.nmr.ch.<br />
8.1.4 Infrarotspektroskopie<br />
Zur Aufnahme von IR-Spektren wurde ein Perkin Elmer 1600 Series FT-IR-Gerät<br />
verwendet. Es wurden KBr-Presslinge angefertigt. Pro Pressling wurden 72 mg des<br />
fein gemahlenen KBr-Substanz-Gemisches verwendet. Als zweites Gerät stand ein<br />
Perkin Elmer 100 Series FT-IR-Gerät zur Verfügung. Bei diesem wurden die<br />
Substanzen als Pulver in Totalreflexion mittels einer ATR (= Abgeschwachte Total-<br />
reflexion) Einheit gemessen.<br />
Die relativen Bandenintensitäten wurden wie folgt bezeichnet: br = breit (broad ), s =<br />
stark (strong), m = mittel (medium), w = schwach (weak).<br />
8.1.5 UV-Vis-Absorptionsspektroskopie<br />
UV-Vis-Absorptionsmessungen zur Bestimmung der Beladungsdichte und Unter-<br />
suchung der photolabilen Sollbruchstelle wurden mit einem Cary 50 - Einstrahl-<br />
spektrometer (Varian) in Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Suprasil aufgenommen.<br />
Zur Beobachtung des Syntheseverlaufs in der manuellen SPPS wurde die Fmoc-<br />
Abspaltlösung mit einem Perkin-Elmer Lambda 5 – Zweistrahlspektrophotometer<br />
verwendet.<br />
Als Bestrahlungsapparatur zur photochemischen Abspaltung der Peptide vom Harz<br />
diente eine Lumatec-Lampe (Typ: Superlite-SUV-DC-P) mit einer Wellenlänge von<br />
366 nm und einer Leistungsaufnahme von max. 360 VA.<br />
119
8 Experimenteller Teil<br />
8.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften für die SPPS<br />
AAV 1 Darstellung von Fmoc-Met-TG<br />
In eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wiegt man das Harz (TG-S-NH2) ein<br />
und lässt es für 10 min in NMP (5 ml für 1 g) quellen. Fmoc-Met-OH (3 eq.), Boc-Met-<br />
OH (3 eq.), HBTU (5.9 eq.), HOBt (6 eq.) und DIPEA (12 eq.) werden in NMP (5 ml<br />
für 1 g Harz) gelöst und aufgezogen. Man schüttelt 18 h, saugt ab und wäscht zehn-<br />
mal mit DMF, sowie zweimal mit DCM. Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit<br />
Kaisertest (AAV 4a) und TNBS-Test (AAV 4b) überprüft. Nach dem Capping (AAV 5)<br />
wird das Harz im Vakuum getrocknet und die Beladungsdichte nach AAV 6 bestimmt.<br />
AAV 2 Beladung von Hydroxyharz mit MSNT-Methode<br />
In eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wiegt man das Harz (TG-S-NH2) ein<br />
und lässt es für 10 min in DCM quellen (5 ml für 1 g). In ein Becherglas wiegt man<br />
die mit Fmoc-geschützte Aminosäure (5 eq.), löst diese in DCM (1 ml/ 0.1 mmol) und<br />
gibt Methylimidazol (3,75 eq.) zu. Falls sich die Aminosäure nicht vollständig löst, gibt<br />
man vorsichtig einige Tropfen THF dazu. Die klare Lösung wird nun zu MSNT (5 eq.)<br />
gegeben und einige Minuten gerührt. Wenn alles gelöst ist, zieht man die<br />
Kupplungslösung zum Harz auf und schüttelt 1-18 h. Anschließend wäscht man<br />
zehnmal mit DCM, fünfmal mit DMF und trocknet das Harz am Vakuum. Die<br />
Beladungsdichte wird nach AAV 6 bestimmt und gegebenenfalls wird die Kupplung<br />
wiederholt. Schließlich behandelt man das Harz eine Stunde mit einer<br />
Cappinglösung aus 0,4 ml Benzoylchlorid, 55 µl Pyridin und 4 ml DMF, wäscht mit<br />
DMF (5x) und DCM (10x) und trocknet erneut. Abschließend wird die<br />
Beladungsdichte nach AAV 6 erneut bestimmt.<br />
AAV 3 Anknüpfung einer Aminosäure<br />
Die Peptidkupplung erfolgt mit HOBt/HBTU in NMP. Hierzu werden 4 eq. (bezogen<br />
auf die Harzbelegung) der jeweiligen Aminosäure zusammen mit 6 eq. HOBt und<br />
4 eq. HBTU in möglichst wenig NMP gelöst und 8 eq. DIPEA zugegeben. Nach einer<br />
kurzen Durchmischung wird die Lösung zu dem gequollenen Harz gegeben und die<br />
120
8 Experimenteller Teil<br />
Kupplung durchgeführt. Die Vollständigkeit der Reaktion wird durch Test auf freie<br />
Amine (AAV 4) überprüft. Abschließend wird das Harz zehnmal mit DMF und dreimal<br />
mit DCM gewaschen.<br />
Das Vorgehen zur Aktivierung mit PyBOP/HOBt erfolgt analog.<br />
AAV 4 Vollständigkeit der Kupplungsschritte – Test auf primäre Amine<br />
Nach unvollständiger Kupplung verbleibende primäre Amine werden mittels<br />
Kaisertest und/oder TNBS-Test detektiert.<br />
Kaisertest [142]<br />
Hierzu entnimmt man eine Spatelspitze Harz und überführt diese in ein Eppendorf-<br />
Cap. Man gibt je drei bis fünf Tropfen der Lösungen1 bis 3 zum Harz und erwärmt für<br />
fünf Minuten auf 100°C im Wasserbad. Färben sich die Kugeln bzw. die Lösung blau,<br />
sind noch primäre Amine vorhanden.<br />
Lösung 1: 5 g Ninhydrin in 100 ml Ethanol<br />
Lösung 2: 2 ml 0.1 mM KCNaq. in 98 ml Pyridin<br />
Lösung 3: 80 g Phenol in 20 ml Ethanol<br />
TNBS Test [143]<br />
Einige wenige Harzkugeln werden auf einer Petrischale platziert. Nun werden die<br />
Kugeln mit je einem Tropfen 10% DIPEA in DMF und 1% TNBS in DMF bedeckt.<br />
Nach fünf Minuten wird die Lösung mit einem Wischtuch vorsichtig entfernt und die<br />
Kugeln unter der Stereolupe betrachtet. Bei Anwesenheit von primären Aminen<br />
färben sich die Kugeln gelb bis orange.<br />
AAV 5 Capping der freien Aminofunktionen<br />
In einer Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte lässt man das Harz in DMF (5 ml für<br />
1 g Harz) quellen. Man saugt ab und behandelt das Harz mit 10% Acetanhydrid in<br />
DMF (1x10 min und 2x5 min). Anschließend wird zehnmal mit DMF und zweimal mit<br />
DCM gewaschen.<br />
121
8 Experimenteller Teil<br />
AAV 6 Bestimmung der Beladungsdichte<br />
Zur Bestimmung der Beladungsdichte wird eine kleine Menge Harz (3-5 mg) mit 20%<br />
Piperidin in DMF (10 ml) für 15 Minuten behandelt. Von der Lösung werden<br />
verschiedene Verdünnungen hergestellt und die UV-Absorption bei 301 nm in<br />
Küvetten mit einem Durchmesser von 1 cm gemessen. Über die Gleichung der<br />
Eichgeraden<br />
E = 0,0077·c<br />
mit E = Extinktion, c = Konzentration in µmol/l, wird die Konzentration der<br />
Abspaltlösung und darüber die Beladung berechnet.<br />
AAV 7 Festphasen-Peptidsynthese am Peptidsynthesizer ABI 433A<br />
Für den 20 µmol Ansatz werden folgende Lösungen verwendet. Die Zahlen geben<br />
die jeweiligen Flaschennummer am Synthesizer an; nicht erwähnte Flaschen-<br />
nummern bleiben leer:<br />
1) abs. Piperidin<br />
4) Cappinglösung:<br />
115 mg HOBt wird in ca. 40 ml NMP gelöst. 2,4 ml Acetanhydrid und<br />
1,1 ml DIPEA werden zugegeben. Anschließend wird die Lösung<br />
mit NMP auf 50 ml aufgefüllt.<br />
6) MeOH HPLC grade<br />
7) 1,6 M DIPEA in NMP:<br />
13,7 ml DIPEA werden mit 36,6 ml NMP gemischt.<br />
8) 0,38 M HOBt/HBTU in NMP:<br />
In einem Messzylinder werden 7,58 g (20 mmol) HBTU und 3,06 g (20 mmol) HOBt<br />
eingewogen und auf 50 ml mit NMP aufgefüllt. Anschließend wird solange gerührt,<br />
bis sich alles aufgelöst hat (ungefähr 10 Minuten).<br />
9) DCM, peptide grade<br />
10 und 11) NMP, peptide grade<br />
Die gleichen Lösungen werden auch für den 10 µmol Ansatz verwendet, lediglich in<br />
Flasche 7 befindet sich eine 0,8 M Lösung von DIPEA in NMP.<br />
122
8 Experimenteller Teil<br />
Vor der Synthese werden die entsprechenden Flow-Tests durchgeführt. Zur<br />
Vorbereitung der Synthese wird ein chemistry-file ausgewählt (meist „20µmol<br />
spezial.kem“) und auf den Synthesizer geladen. Dann werden das sequence- und<br />
das run-file erstellt und vom Rechner an den Synthesizer übertragen. Außerdem<br />
werden die Aminosäuren in NMP gelöst (125 mmol in 0,5 ml; falls sich die<br />
Aminosäure nicht vollständig durch vortexen löst, wird sie kurz mit Ultraschall<br />
behandelt), in die Kartuschen pipettiert und in den Synthesizer geladen. Das mit Harz<br />
befüllte 3 ml Reaktionsgefäß wird eingespannt und die Synthese wird gestartet.<br />
Für den 0,1 mmol Ansatz werden folgende Lösungen verwendet. Die Zahlen geben<br />
die Flaschennummer am Synthesizer an; nicht erwähnte Flaschennummern bleiben<br />
leer:<br />
1) abs. Piperidin<br />
4) Cappinglösung:<br />
0,8 g HOBt wird in ca. 100 ml NMP gelöst. 19 ml Acetanhydrid und 9 ml<br />
DIPEA werden zu gegeben und anschließend wird die Lösung mit NMP<br />
auf 400 ml aufgefüllt.<br />
5) 0,45 M HOBt/HBTU in DMF:<br />
In einem Messzylinder werden 37,9 g (100 mmol) HBTU und 15,3 g<br />
(100 mmol) HOBt eingewogen und auf 200 ml mit DMF aufgefüllt.<br />
Anschließend wird solange gerührt, bis sich alles aufgelöst hat (ungefähr<br />
10 Minuten).<br />
6) MeOH HPLC grade<br />
7) 2 M DIPEA in NMP:<br />
69,6 ml DIPEA werden mit 130,4 ml NMP gemischt.<br />
9) DCM, peptide grade<br />
10 und 11) NMP, peptide grade<br />
Vor der Synthese werden die entsprechenden Flow-Tests durchgeführt. Zur<br />
Vorbereitung der Synthese wird ein chemistry-file ausgewählt und auf den<br />
Synthesizer geladen. Dann werden das sequence- und das run-file erstellt und vom<br />
Rechner an den Synthesizer übertragen. Außerdem werden die Aminosäuren in die<br />
Kartuschen eingewogen (10 eq. für FastMoc 1,0 mmol) und in den Synthesizer<br />
123
8 Experimenteller Teil<br />
geladen. Das mit Harz befüllte 8 ml Reaktionsgefäß wird eingespannt und die<br />
Synthese wird gestartet.<br />
UV-Monitoring des Syntheseverlaufs<br />
Zur Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird das Harz je 8 min mit einer 20%<br />
Piperidin in NMP-Abspaltlösung behandelt. Von der Abspaltlösung erfolgt eine<br />
Absorptionsmessung bei 301 nm. Ist die Abweichung der Absorption größer 4% der<br />
vorherigen Messung, so erfolgt ein erneuter Fmoc-Abspaltschritt. Es erfolgen jedoch<br />
maximal sechs Fmoc-Abspaltschritte. Für jeden Aminosäurekupplungschritt werden<br />
6,25 eq. Aminosäure mit 4,75 eq. HBTU/HOBt und 10 eq. DIPEA aktiviert und 40 min<br />
gekuppelt. Zum Capping wird das Harz 1 min mit Cappinglösung behandelt. Waren<br />
zur vorherigen Fmoc-Abspaltung mehr als drei Piperidinbehandlungsschritte<br />
notwendig, so wird die Reaktionszeit beim Capping um 5 min verlängert.<br />
Nach der Synthese wird das Harz in eine mit einer Fritte versehene Einwegspritze<br />
umgefüllt.<br />
Leitfähigkeitsmessung zum Überprüfen des Syntheseverlaufs<br />
Die Synthese erfolgt analog zum oben beschriebenen Verlauf (UV-Monitoring).<br />
Jedoch wird von der Fmoc-Abspaltlösung anstelle einer Absorptionsmessung die<br />
Leitfähigkeitsmessung durchgeführt. Bei der PreviousPeak-Methode wird die Fmoc-<br />
Abspaltung solange wiederholt, bis sich die Leitfähigkeitswerte zweier aufeinander<br />
folgender Messungen um weniger als 5% unterscheiden. Bei Verwendung der<br />
FirstPeak-Methode wird immer der Messwert der ersten Abspaltung als<br />
Vergleichswert herangezogen.<br />
AAV 8 Cyclisierung<br />
Zum in NMP vorgequollenen Harz wird eine Mischung aus 4 eq. PyBOP, 6 eq. HOBt<br />
und 8 eq. DIPEA in NMP aufgezogen und über Nacht geschüttelt. Anschließend wird<br />
zehnmal mit DMF und fünfmal mit DCM gewaschen. Die Vollständigkeit der<br />
Cyclisierung wird mit Kaiser- und TNBS-Test überprüft. Die Cyclisierungsreaktion<br />
wird bis zur Vollständigkeit wiederholt, wobei die Aktivierungsreagenzien täglich<br />
erneuert wurden. Nach erfolgreicher Cyclisierung wird das Harz im Vakuum<br />
getrocknet. Die Cyclisierung mit PyAOP/HOAt erfolgt analog.<br />
124
AAV 9 Einführung des Fluoreszenzlabels<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Zur Vorbereitung der Reaktion wird das Harz zunächst ausführlich gewaschen und<br />
anschließend am Vakkuum getrocknet. Unmittelbar vor Gebrauch wird eine Lösung<br />
aus 4 eq. Sulforhodamin-B-sulfonylchlorid (SRBS-Chlorid), 6eq. DIPEA in DMF<br />
hergestellt, zum mit Stickstoff geflutetem Harz aufgezogen und über Nacht<br />
ge¬schüttelt. Anschließend wird das Harz zuerst mit DMF(10x1 min) und dann mit<br />
DCM (10x1 min) gewaschen. Daraufhin wird es durch Waschen mit Methanol (2x4<br />
min) geschrumpft und abschließend am Vakuum getrocknet.<br />
AAV 10 Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe<br />
Das Harz wird in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte eingewogen, mit DMF<br />
gequollen und abgesaugt. Daraufhin folgt eine Behandlung der Harzkugeln mit 20%<br />
Piperidin in DMF (1x3 min und 3x5 min). Die abgetrennte Abspaltlösung wird<br />
aufbewahrt. Das Harz wird noch fünfmal mit DMF gewaschen und die Waschlösung<br />
mit der Abspaltlösung vereinigt. Schließlich wird noch fünfmal mit DMF und fünfmal<br />
mit DCM gewaschen.<br />
Bei bekanntem Volumen der Abspaltlösung kann mittels UV-Spektroskopie die<br />
abgespaltene Fmoc-Gruppe quantifiziert werden.<br />
AAV 11 Abspaltung der Allyl- bzw. Alloc-Gruppe<br />
Das Harz wird in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte eingewogen, dreimal<br />
mit DCM gewaschen und anschließend an der Line getrocknet (dazu gibt man die<br />
Spritze mit Harz in einen Schlenkkolben). Das getrocknete Harz wird direkt vor der<br />
Abspaltung mit Stickstoff geflutet.<br />
Variante A – unter Einsatz eines Boran-Dimethylamino Komplexes:<br />
Aus 0,4 eq. Pd(PPh3)4 und 7,5 eq. Boran-Dimethylamino Komplex (bezogen auf die<br />
Anzahl der Allyl- bzw. Alloc-Gruppen im Peptid) und DCM wird eine Suspension<br />
hergestellt, diese zum Harz aufgezogen und geschüttelt. Nach 20 min wird die<br />
Lösung erneuert und weitere 20 min geschüttelt. Nach Absaugen der Lösung wird<br />
zehnmal mit DMF und zehnmal mit DCM gewaschen.<br />
Variante B – durch Zugabe von N,N’-Dimethylbarbitursäure (DMB): [123]<br />
Zum mit Stickstoff gefluteten Harz gibt man eine 0,2 M Lösung aus DMB in<br />
trockenem DCM (8,3 eq bezogen auf die zu entschützende Allyl- bzw. Alloc-Gruppe.)<br />
125
8 Experimenteller Teil<br />
sowie eine 0,02 M Lösung aus Pd(PPh3)4 in trockenem DCM (1 eq. pro Allyl- bzw.<br />
Alloc-Gruppe). Nach 30 min wird die Lösung erneuert und weitere 30 min geschüttelt.<br />
Anschließend wird das Harz fünfmal mit DCM, fünfmal mit DMF, zweimal mit<br />
Dioxan/Wasser (9:1), einmal mit Methanol, fünfmal mit DMF und fünfmal mit DCM<br />
gewaschen.<br />
AAV 12 Spaltung der säurelabilen Schutzgruppen an fester Phase<br />
Zum Entfernen der säurelabilen Schutzgruppen (Boc, Pbf, Trt, t Bu) wird das<br />
Peptidylharz in eine Einwegspritze mit PE-Fritte eingewogen. Das Harz wird 3 h bei<br />
RT mit einer Lösung aus TFA/TIS/Wasser (95:2.5:2.5) behandelt. Anschließend wird<br />
zweimal je 5 Minuten mit TFA, fünfmal je 2 Minuten mit DMF und fünfmal je 1 Minute<br />
mit DCM gewaschen. Danach wird das Harz am Vakuum getrocknet.<br />
AAV 13 Met(O)-Reduktion<br />
Während der Synthese, dem Screening, der Aufbewahrung und dem partiellen<br />
Edman-Abbau besteht die Möglichkeit, dass der Thioether im Methionin unter Einfluß<br />
von Luftsauerstoff und TFA zum Sulfoxid oxidiert wird. Um diese Oxidation<br />
umzukehren (reduzieren), wird eine Lösung aus 9,6 mg Ammoniumiodid in 0,5 ml<br />
TFA (0,132 M, gesättigt violette Lösung) und 20 µl Dimethylsulfid (0,545 M, dann ist<br />
die Lösung gelb) hergestellt. Mit dieser Lösung werden die Harzkugeln in einer<br />
Einwegspritze mit PE-Fritte für 20 min bei 0°C behandelt. Anschließend wird<br />
ausgiebig mit Wasser gewaschen (25x1 min). Nun kann nach AAV 14 die Bromcyan-<br />
Spaltung erfolgen.<br />
AAV 14 Bromcyan-Spaltung<br />
Hierzu werden unmittelbar vor Gebrauch 40 mg BrCN in 1 ml 70% TFA in Wasser<br />
gelöst.<br />
Peptidabspaltung von einzelnen Kugeln für anschließende MALDI-TOF-<br />
Analyse<br />
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in<br />
jedem Cap immer nur eine Kugel sein darf (unter der Stereolupe überprüfen). Nach<br />
einem kurzen spindown in der Zentrifuge fügt man je 10 µl Bromcyan-Lösung hinzu<br />
126
8 Experimenteller Teil<br />
und lässt über Nacht einwirken. Nach Trocknen am Vakuum wird das vom Harz<br />
abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:2))<br />
aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl Matrixlösung (gesättigte α-Cyano-<br />
4-hydroxyzimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)) werden auf dem MALDI-Target<br />
gemischt und können nach Kristallisation analysiert werden.<br />
Abspaltung von mehreren Harzkugeln<br />
In einer Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wird die gewünschte Menge Harz<br />
eingewogen, die wie oben beschrieben hergestellte Bromcyan-Lösung wird<br />
aufgezogen und wirkt über Nacht ein. Das in der Lösung enthaltene abgespaltene<br />
Peptid wird aus der Spritze gedrückt. Das Harz wird noch zweimal mit 70% TFA in<br />
Wasser nachgespült. Im Stickstoff-Gegenstrom wird die TFA abgedampft. Der<br />
Rückstand wird in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das so erhaltene Peptid<br />
kann anschließend mittels RP-HPLC aufgereinigt und charakterisiert werden.<br />
AAV 15 BNPS-Skatol / Trp–Xaa Spaltung<br />
Unmittelbar vor Gebrauch werden 1,3 mg BNPS in 1 ml Essigsäure (88% aq.) gelöst.<br />
Trp-Xaa Spaltung: Sollbruchstelle im cyclischen Peptid<br />
Zur selektiven Spaltung der Trp-Xaa Bindung (also C-terminal von Trp) wird das<br />
Peptidylharz (ohne Seitenkettenschutzgruppen) mit zuvor frisch zubereiteter BNPS-<br />
Lösung (2,8 eq. in Bezug auf die zu spaltende Trp-Xaa Bindung) behandelt. Danach<br />
wird das Harz dreimal mit 88% Essigsäure, einmal mit Methanol und zehnmal mit<br />
DCM gewaschen. Anschließend wird das Harz am Vakuum getrocknet.<br />
Trp-TG Spaltung: Linker<br />
Das Vorgehen der Reaktion erfolgt analog zur Trp-Xaa Spaltung. Nur wird hier die<br />
BNPS-Lösung, die das abgespaltene Peptid enthält, aufbewahrt. Das Harz wird<br />
viermal mit 88% Essigsäure und zweimal mit Methanol gewaschen. Die<br />
Waschlösung wird mit der BNPS-Peptidlösung vereint. Anschließend wird das<br />
Volumen durch Zugabe von Wasser verdoppelt und lyophilisiert. Das so erhaltene<br />
Lyophilisat wird erneut in Wasser aufgenommen und nochmals lyophilisiert. Das<br />
Peptid kann nun mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert werden.<br />
127
8 Experimenteller Teil<br />
AAV 16 Basisches Spalten von HMBA-bzw. Glykolamidester-Harz<br />
Zur basischen Abspaltung des Peptids vom HMBA- bzw. Glykolamidester-Harz wird<br />
die gewünschte Menge Peptidylharz in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte<br />
eingewogen. Das Harz wird 5 min mit DMF vorgequollen. Man stellt eine Lösung aus<br />
Propylamin, DMF und Triethylamin (5:5:1) her und behandelt das Harz bei RT mit<br />
dieser Lösung (50 ml/g). Nach 18 h wird die Lösung abgetrennt. Das Harz wird mit<br />
DMF (7x1 min), Methanol (2x1 min), Wasser (2x1 min) und Methanol (2x1 min)<br />
gewaschen. Die aufgefangene Waschlösung wird mit der basischen Abspaltlösung<br />
vereinigt und am Stickstoff-Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Trockne<br />
eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen (eventuell zuerst einige<br />
Tropfen Acetonitril zum Lösen), mit flüssigem Stickstoff ausgefroren und lyophilisiert.<br />
Das Peptid kann anschließend mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie<br />
charakterisiert werden.<br />
AAV 17 Peptidabspaltung vom SieberAmid-Harz<br />
Unmittelbar vor Gebrauch wird eine Lösung aus TFA/TIS/Wasser (1:1:98) hergestellt.<br />
Peptidabspaltung von einzelnen Kugeln für anschließende MALDI-TOF-<br />
Analyse<br />
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in<br />
jedem Cap immer nur eine Kugel sein darf (unter der Stereolupe überprüfen). Nach<br />
einem kurzen spindown in der Zentrifuge werden je 100 µl TFA/TIS/DCM (1:1:98)<br />
hinzugefügt. Nach einer Stunde wird die Lösung am Stickstoffgegenstrom eingeengt.<br />
Zum Rückstand werden 5 µl 0.1% TFA in Wasser/ Acetonitril (1:1) addiert, um das<br />
vom Harz abgespaltene Peptid aufzunehmen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl<br />
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in 0,1% TFA in Wasser/<br />
Acetonitril (1:1) werden auf dem MALDI-target gemischt und können nach<br />
Kristallisation analysiert werden.<br />
Abspaltung von mehreren Harzkugeln<br />
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze<br />
mit PE-Fritte eingewogen und mit DCM quellen lassen. Das Harz wird bei RT mit<br />
einer Lösung aus TFA/TIS/DCM (1:1:98) behandelt (2x15 min, 1x 30 min).<br />
Anschließend wird zehnmal je 1 Minute mit DCM, zweimal je 4 Minuten mit Methanol<br />
128
8 Experimenteller Teil<br />
und zweimal je 2 Minuten mit Wasser gewaschen. Die vereinigte Abspalt- und<br />
Waschlösung wird am Stickstoff-Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Trockne<br />
eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen (eventuell zuerst einige<br />
Tropfen Acetonitril zum Lösen), mit flüssigem Stickstoff ausgefroren und lyophilisiert.<br />
AAV 18 Peptidabspaltung vom Arylhydrazid-Harz<br />
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze<br />
mit PE-Fritte eingewogen und mit DCM quellen lassen. Es werden je 2 eq (bezogen<br />
auf das Harz) einer äquimolaren Lösung aus NBS und Pyridin in DCM (0,017 M) zum<br />
Harz gegeben und 10 Minuten damit behandelt. Anschließend wird das Harz mit<br />
DCM gewaschen (10x1 min). Daraufhin werden 5 eq. des Nucleophils (am besten 4-<br />
Bromanilin) in DCM gelöst, so dass sich eine 0,03 M Lösung ergab. Das Harz wird<br />
über Nacht damit behandelt. Anschließend wird je viermal für 1 Minute mit DCM,<br />
Acetonitril und Methanol gewaschen. Die vereinigte Abspalt- und Waschlösung<br />
werden am Vakuum eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.<br />
AAV 19 Peptidabspaltung vom RinkAmid-Harz<br />
Die Abspaltung des Peptids verläuft simultan mit der Abspaltung der säurelabilen<br />
Schutzgruppen.<br />
Testabspaltung für anschließende MALDI-TOF Analyse<br />
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (1 ml) überführt und mit 100% TFA behandelt.<br />
Nach ca. 20 Minuten wird die Lösung unter Stickstoffgegenstrom eingeengt.<br />
Anschließend erfolgt ein kurzer spindown in der Zentrifuge. Zum Rückstand werden<br />
5 µl 0,1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:1) addiert, um das vom Harz abgespaltene<br />
Peptid aufzunehmen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl Matrixlösung (gesättigte α-<br />
Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:1)) werden auf dem<br />
MALDI-target gemischt und können nach Kristallisation analysiert werden.<br />
Abspaltung von mehreren Harzkugeln<br />
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze<br />
mit PE-Fritte eingewogen. Das Harz wird für drei Stunden mit einer Lösung aus<br />
TFA/TIS/Wasser (95:2.5:2.5) (0.5 ml für 100 mg Harz) geschüttelt. Die Lösung wird<br />
dann in das 10-15 fache Volumen eiskalten tert-Butylmethylether getropft, wobei das<br />
Peptid ausfällt. Man behandelt das Harz noch ein weiteres Mal mit der Abspaltlösung<br />
129
8 Experimenteller Teil<br />
für eine Stunde. Dann wäscht man mit TFA nach und stellt das Gefäß über Nacht in<br />
den Eisschrank. Man zentrifugiert bei 1000 g bei 4°C für 45 min, dekandiert die<br />
überstehende Lösung ab, resuspendiert das Pellet in tert -Butylmethylether und<br />
zentrifugiert erneut. Diese Prozedur wird noch einmal wiederholt. Dann wird das<br />
Pellet in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Anschließend wird das Produkt<br />
mittels RP-HPLC präparativ aufgereinigt.<br />
AAV 20 Peptidabspaltung mit Reagenz K<br />
Zum Abspalten des Peptids vom Harz und der simultanen Entfernung der<br />
säurelabilen Schutzgruppen mit Reagenz K, wird das Peptidylharz in eine<br />
Einwegspritze eingewogen. Unmittelbar vor Gebrauch wird die Abspaltlösung<br />
(Reagenz K) hergestellt. Diese besteht aus TFA/Thioanisol/Wasser/Phenol/EDT<br />
(82,5:5:5:5:2,5). Das Harz wird zweimal je 3 h mit Reagenz K behandelt. Das Peptid<br />
wird, wie bereits in AAV 19 beschrieben, ausgefällt und aufgereinigt.<br />
130
8.3 Synthetisierte Peptide<br />
8.3.1 Synthese der photolabilen cyclischen Peptide 8-12<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Die Synthese der Peptide erfolgte an SieberAmid-TentaGel. Die linearen<br />
Vorläufersequenzen (ohne die photolabile Aminosäure) wurden am Peptid-<br />
synthesizer nach AAV 7 dargestellt. Als chemistry file wurde 10µmol(3ml)2.1.0.kem<br />
ausgewählt. Die Elongation der Peptidkette erfolgte unter Verwendung der Module<br />
HhDAFiiiCidD (PrPk Fmoc Depro/Single/cap). Die verwendeten Aminosäuren waren<br />
die folgenden: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH,<br />
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH.<br />
Das Syntheseharz wurde vom reaction vessel des Synthesizers in eine<br />
Einwegspritze mit PE-Fritte überführt. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde<br />
nach AAV 10 gespalten und anschließend erfolgte die Anknüpfung der photolabilen<br />
Aminosäure (Fmoc-Pll-OH) 4 nach AAV 3.<br />
Zur Entschützung der mit Allyl geschützten Carbonsäure wurde das Harz wie in AAV<br />
11a beschrieben behandelt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde nach AAV 10 entfernt.<br />
Schließlich wurde wie in AAV 8 aufgeführt cyclisiert.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und sauer nach AAV 17<br />
gespalten.<br />
Peptid 8<br />
Fmoc-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2 (13→14)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
24,8 min 1089,1 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )<br />
20,8 min 966,7 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )<br />
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2 (15→16)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
22,4 min 1246,8 m/z [M+H] +<br />
1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )<br />
131
8 Experimenteller Teil<br />
Cyclo[Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu]-Lys-NH2 (19→8)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
22,4 min 1246,8 m/z [M+H] +<br />
Peptid 9<br />
Fmoc-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2<br />
1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
24,6 min 1089,1 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )<br />
20,4 min 966,7 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )<br />
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
22,4 min 1247,7 m/z [M+H] + 1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )<br />
Cyclo[Pll-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (9)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
13,7-14,2 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )<br />
Peptid 10<br />
Fmoc-Pll-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
25,5 min 1247,2 m/z [M+H] + 1246,57m/z (C63H80N11O16 + )<br />
Cyclo[Pll-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (10)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
18,2-18,3 min 1066,4 m/z [M+H] + 1066,52 m/z (C50H72N11O15 + )<br />
14,1-14,7 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )<br />
132
Peptid 11<br />
Fmoc-Ala-Gly-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
8 Experimenteller Teil<br />
24,1 min 1088,8 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )<br />
20,0 min 966,9 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )<br />
Fmoc-Pll-Ala-Gly-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
19,9 min 1247,0 m/z [(M+H] + 1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )<br />
Cyclo[Pll-Ala-Gly-Pro-Gly-Phe-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (11)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
18,2-18,4 min 1088,4 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C50H71N11NaO15 + )<br />
14,2-14,8 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )<br />
Peptid 12<br />
Fmoc-Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
24,0 min 1088,6 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )<br />
19,9 min 966,8 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )<br />
Fmoc-Pll-Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Glu(OAll)-Lys-NH2<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
20,1 min 1246,5 m/z [M+H] + 1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )<br />
Cyclo[Pll-Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (12)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
18,1-18,3 min 1088,4 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C50H71N11NaO15 + )<br />
14,1-14,7 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )<br />
133
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.2 Synthese des cyclischen Peptids 31 zur Untersuchung von<br />
Methionin als Sollbruchstelle<br />
Die Synthese der Peptide erfolgte an SieberAmid-TentaGel (0,12 mmol/g). Die<br />
linearen Vorläufersequenzen wurden am Peptidsynthesizer nach AAV 7 dargestellt.<br />
Als chemistry file wurde 10µmol(3ml)2.1.0.kem ausgewählt. Die Elongation der<br />
Peptidkette erfolgte unter Verwendung der Module HhDAFiiidD (PrPk Fmoc<br />
Depro/Single). Die verwendeten Aminosäuren waren die folgenden: Fmoc-Ala-OH,<br />
Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH,<br />
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Pro-OH.<br />
Das Syntheseharz wurde vom reaction vessel des Synthesizers in eine<br />
Einwegspritze mit PE-Fritte überführt. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde<br />
nach AAV 10 gespalten. Zur Entschützung der mit Allyl geschützten Carbonsäure<br />
wurde das Harz wie in AAV 11a beschrieben behandelt. Anschließend wurde wie in<br />
AAV 8 aufgeführt cyclisiert.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und sauer nach AAV 17<br />
gespalten.<br />
Peptid 28<br />
Fmoc-Met-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (27→28)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
19,2 min 1644,5 m/z [M+H] + 1642,743 m/z (C81H108N15O18S2 + )<br />
17,9 min 1660,4 m/z [M(ox.)+H] + 1658,738 m/z (C81H108N15O19S2 + )<br />
Peptid 30<br />
H-Met-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (29→30)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
13,9 min 1380,9 m/z [M+H] + 1380,6439 m/z (C63H94N15O16S2 + )<br />
13,4 min 1397,4 m/z [M(ox.)+H] + 1396,6388 m/z (C63H94N15O17S2 + )<br />
134
Peptid 32<br />
Cyclo[Met-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (31→32)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
8 Experimenteller Teil<br />
14,7 min 1363,6 m/z [M+H] + 1362,6333 m/z (C63H92N15O15S2 + )<br />
13,7 min 1379,7 m/z [M(ox.)+H] + 1378,6282 m/z (C63H92N15O16S2 + )<br />
8.3.2.1 Spaltung der Sollbruchstelle des cyclischen Peptids 31<br />
Das festphasengebundene cyclische Peptid 79a wurde nach AAV 14 mit BrCN-<br />
Lösung behandelt.<br />
Die Charakterisierung erfolgte mittels RP-HPLC offline MALDI-TOF-MS.<br />
Peptid 33<br />
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (31→33)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
14,1 min 1332,5 m/z [M+H] + 1332,6405 m/z (C62H90N15O16S + )<br />
13,7 min 1378,5 m/z [M(ox.)+H] + 1378,6282 m/z (C63H92N15O16S2 + )<br />
Für weitere Tandem-MS Experimente wurde das Rohprodukt, also ohne HPLC-<br />
Aufreinigung, verwendet.<br />
135
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.3 Synthese des cyclischen Peptids 41 zur Untersuchung von<br />
Methionin als Sollbruchstelle<br />
Die Synthese der Peptide erfolgte am 4-Fmoc-Hydrazinobenzoyl Am NovaGel TM<br />
(01-64-0377) Harz. Zur Reduktion der Beladungsdichte wurde das Harz nach AAV 1<br />
mit der ersten Aminosäure (Fmoc-βAla-OH/ Boc-βAla-OH) beladen. Es wurden<br />
jedoch je 5 eq. Xaa verwendet. Die linearen Vorläufersequenzen wurden am Peptid-<br />
synthesizer nach AAV 7 dargestellt. Als chemistry file wurde 20µmol(3ml)2.1.0.kem<br />
ausgewählt. Die Elongation der Peptidkette erfolgte unter Verwendung der Module<br />
HhDAFiiidD (PrPk Fmoc Depro/Single). Die verwendeten Aminosäuren waren die<br />
folgenden: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH,<br />
Fmoc-Glu-OAll, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Pro-OH.<br />
Nach der automatisierten Synthese wurde das Syntheseharz vom reaction vessel<br />
des Synthesizers in eine Einwegspritze mit PE-Fritte überführt. Zur Entschützung der<br />
mit Allyl geschützten Carbonsäure wurde das Harz wie in AAV 11a beschrieben<br />
behandelt. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde nach AAV 10 gespalten. An-<br />
schließend wurde wie in AAV 8 aufgeführt cyclisiert.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 18 vom<br />
Harz gespalten.<br />
Zur Spaltung der Met-Sollbruchstelle wurde das Harz nach AAV 14 behandelt.<br />
Peptid (39→40)<br />
Fmoc-Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-OH)-OAll<br />
MALDI-TOF-MS: 1479,0 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C71H96N15O18S + (1478,6773 m/z)<br />
amid))-OAll <br />
Fmoc-Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-N-(4-Bromphenyl-<br />
MALDI-TOF-MS: 1632,1 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C77H100BrN16O17S + (1631,6351 m/z)<br />
Peptid (41→42)<br />
Cyclo[Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-OH)]<br />
MALDI-TOF-MS: 1198,9 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C53H80N15O15S + (1198,5674 m/z)<br />
136
amid))]<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Cyclo[Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-N-(4-Bromphenyl-<br />
MALDI-TOF-MS: 1351,9 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C59H84BrN16O18S + (1351,5252 m/z)<br />
Peptid (43→44)<br />
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg-OH)-Hsl<br />
MALDI-TOF-MS: 1152,9 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C52H78N15O15 + (1152,5796 m/z)<br />
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg-N-(4-Bromphenylamid))-Hsl<br />
MALDI-TOF-MS: 1305,9 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C58H82BrN16O14 + (1305,5374 m/z)<br />
137
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.4 Synthese des Peptids 51/52 zur Stabilitätsuntersuchung des<br />
Glykolamid-Linkers und des HMBA-Linkers<br />
Zur Herstellung von 0,1 mmol Fmoc-Ala-Acetamid (oder besser Glykolamidester)-<br />
Harz wurden 312,5 mg (0,1 mmol/ 0,32 mmol/g) TG-S-NH2-Harz in eine<br />
Einwegspritze mit PE-Fritte eingewogen. Zunächst wurde das Harz viermal 2<br />
Minuten mit DCM, zweimal 5 Minuten mit 5% DIPEA in DCM und viermal 2 Minuten<br />
mit DCM vorbehandelt. Bromessigsäure (83,4 g, 0,6 mmol) wurde in 1 ml DCM<br />
gelöst und auf 0°C gekühlt. DCC (61,9 mg, 0,3 mmol) wurde in 0,4 ml DCM gelöst,<br />
zur eiskalten Bromessigsäurelösung gegeben und 15 Minuten bei 0°C gerührt. Der<br />
ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert, die Lösung zum vorbehandelten<br />
Harz aufgezogen und 15 Minuten bei RT geschüttelt. Anschließend wurde die<br />
Lösung in ein Becherglas gedrückt, mit 17,4 µl DIPEA (0,1 mmol) versetzt und erneut<br />
zum Harz aufgezogen. Nach 75 Minuten wurde das Harz wie folgt gewaschen: DCM<br />
(4x2 min), DMF (4x2 min), DCM (5x2 min), DMF (1x2 min, 2x10 min). Fmoc-Ala-OH<br />
(93,4 mg/ 0,3 mmol) und CsI (7,8 mg/ 0,03 mmol) wurden in ein Becherglas<br />
eingewogen und in 2 ml DMF und DIPEA (52,2 µl/ 0,3 mmol) gelöst. Nachdem sich<br />
alles vollständig gelöst hatte (ca. 5 Minuten), wurde die aktivierte Aminosäure-<br />
Lösung zum Bromacetamid-Harz aufgezogen und bei RT über Nacht geschüttelt.<br />
Nach dem Waschen (10x1 Minute mit DMF, 5x1 Minute mit DCM) wurde das Harz<br />
am Vakuum getrocknet und nach AAV 6 die Beladungsdichte bestimmt. Es ergab<br />
sich eine Beladungsdichte von 0,322 mmol/g.<br />
Das HMBA Harz wurde mit der MSNT-Methode nach AAV 2 beladen (Beladungs-<br />
dichte 0,18 mmol/g).<br />
Die Synthese der Peptide erfolgte nacheinander, aber analog zueinander, am<br />
Peptidsynthesizer nach AAV 7 im 20 µmol Ansatz unter Verwendung des UV-<br />
Monitorings. Nach der automatisierten Elongation erfolgte die Abspaltung der<br />
N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10, bevor nach AAV 5 der N-Terminus<br />
acetyliert wurde. Die Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppen der Seitenketten<br />
erfolgte nach AAV 12. Die Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte schließlich<br />
nach AAV 16.<br />
138
Peptid (53)<br />
Ac-Phe-Trp-Arg-Ala-NHPropyl<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (55-100% B° in 30 min, 1 ml/min) tR = 15,2 min<br />
ESI-MS: 662,0 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C34H48N9O5 + (662,3773 m/z)<br />
139
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.5 Synthese des festphasengebundenen Peptids 63 zur<br />
Untersuchung der Trp-Xaa Sollbruchstelle<br />
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Met-OH<br />
beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,13 mmol/g. Die Festphasen-<br />
synthese des linearen Peptids 23 erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. 20µM<br />
spezial.kem wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die<br />
Modulfolge eDG (Initial Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zwölf verlief mit der<br />
Modulfolge BbDAFiiihd (Single Couple, Cond Cap/5eq.) und als abschließender<br />
Zyklus folgten die Module Dc (Final Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden<br />
verwendet: Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,<br />
Fmoc-Glu-OAll, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe(4Br)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-<br />
Trp(Boc)-OH. Nach der automatisierten SPPS erfolgte die Abspaltung der Fmoc-<br />
Schutzgruppe (AAV 10), die Abspaltung der Allyl-Schutzgruppe (AAV 11b) und<br />
schließlich die Cyclisierung mit PyAOP nach AAV 8.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV<br />
14 gespalten.<br />
Fmoc-Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu[βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg(Pbf)-Hsl]-OAll (61→ 62)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (20-100% B in 20 min, 1 ml/min) tR = 18,9 min<br />
ESI-MS: 1930,6 m/z [M+H] + , 1678,7 m/z [(M-Pbf)+H] +<br />
Berechnet: C92H113BrN19O21S + (1930,72 m/z)<br />
H-Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu[βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg(Pbf)-Hsl]-OH<br />
ESI-MS: 1668,8 m/z [M+H] + , 1416,0 m/z [(M-Pbf)+H] +<br />
Berechnet: C74H99BrN19O19S + (1668,62 m/z)<br />
Cyclo[Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu(βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg-Hsl)] (63→ 64)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (45-100% B in 20 min, 1 ml/min) tR = 11,1 min<br />
ESI-MS: 1397,9 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C61H83BrN19O16 + (1398,53 m/z)<br />
140
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.6 Synthese des festphasengebundenen Peptids 66 zur<br />
Untersuchung von Trp als Linker<br />
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Trp(Boc)-<br />
OH beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,18 mmol/g. Die Festphasen-<br />
synthese des Peptids erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. 20µM spezial.kem<br />
wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die Modulfolge<br />
eDG (Initial Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zwölf verlief mit der Modulfolge<br />
BbDAFiiihd (Single Couple, Cond Cap/5eq.) und als abschließender Zyklus folgten<br />
die Module Dc (Final Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet:<br />
Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu-<br />
OAll, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe(4Br)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Trp(Boc)-OH.<br />
Fmoc-Met−Gly-His-Pro-Gln-Glu −[βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg(Pbf)-Trp-TG]-OAll (66)<br />
Leider konnte das Peptid nicht vom Harz abgespalten werden.<br />
141
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.7 Synthese des festphasengebundenen Peptids 77 als<br />
Modellpeptid zur Etablierung des Partiellen Edman-Abbaus<br />
(PED)<br />
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Met-OH<br />
beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,112 mmol/g. Die Festphasen-<br />
synthese des Peptids erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. Mon20µM<br />
(3mlRV).kem wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde<br />
Modul D (NMP Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zwölf verlief mit der Modulfolge<br />
HhDAFiidD (PrPk Fmoc Depro/Singel) und als abschließender Zyklus folgte Modul c<br />
(Final DCM Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Ala-<br />
OH, Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-<br />
Phe-OH, Fmoc-Pro-OH und Boc-Lys(Alloc)-OH. Nach der automatisierten SPPS<br />
erfolgte die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppen (AAV 11a) und schließlich<br />
die Cyclisierung mit PyBOP nach AAV 8.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV<br />
14 gespalten.<br />
H-Lys(Alloc)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Hsl (75→76)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil-Säule): (10-85% B° in 20 min, 0,1 ml/min)<br />
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet<br />
17,8 min 1571,3 m/z [M+H] + 1571,7563 m/z (C74H104N16O20S + )<br />
15,9 min 1531,2 m/z [(M-All)+H] + 1531,7250 m/z (C71H103N16O20S2 + )<br />
H-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Hsl<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil-Säule): (10-85% B° in 20 min) tR = 15,6 min<br />
ESI-MS: 1462,6 m/z<br />
Berechnet: C68H101N16O18S + (1461,7195 m/z)<br />
H-cyclo[Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Hsl (77→78)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil-Säule): (10-85% B° in 20 min) tR = 15,0 min<br />
MALDI-TOF-MS: 1444,7 m/z<br />
Berechnet: C68H99N16O17S + (1443,7089 m/z)<br />
142
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.8 Synthese des Peptids 71 zur Untersuchung einer<br />
enzymatischen Ringöffnung<br />
Wie in AAV 1 beschrieben, wurde TentaGel mit Fmoc-Met-OH beladen<br />
(Beladungsdichte: 0,12 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Synthese<br />
des linearen Vorläuferpeptids unter Verwendung des 20µM 3ml.kem chemistry files.<br />
Im ersten Zyklus wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der<br />
darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiihd (Single Couple, Cond Cap./5eq.). Mit<br />
einem abschließenden final DCM wash (Modul: c) wurde die automatisierte SPPS<br />
beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-βAla-OH,<br />
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu-OAll, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH,<br />
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser( t Bu)-OH und Fmoc-Tyr( t Bu)-OH. Nach der<br />
automatisierten SPPS erfolgte die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe (AAV 10), die<br />
Abspaltung der Allyl-Schutzgruppe (AAV 11a) und schließlich die Cyclisierung mit<br />
PyBOP nach AAV 8.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV<br />
14 gespalten.<br />
Fmoc-Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(βAla-Pro-Pro-βAla-Hsl)-OAll (67→68)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B° in 20 min, 1ml/min) tR = 15,47 min<br />
MALDI-MS: 1554,3 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C78H101N14O20 + (1553,7311 m/z)<br />
H-Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(βAla-Pro-Pro-βAla-Hsl)-OH (69→70)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B° in 20 min, 1 ml/min) tR = 10,6 min<br />
MALDI-MS: 1291,7 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C60H87N14O18 + (1291,6317 m/z)<br />
cyclo-[Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(βAla-Pro-Pro-βAla-Hsl)] (71→72)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B° in 20 min, 1 ml/min) tR = 12,1 min<br />
MALDI-MS: 1274,5 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C60H85N14O17 + (1273,6212 m/z)<br />
143
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.8.1 Tryptischer Verdau an der festen Phase<br />
Eine Einwegspritze mit PE-Fritte wurde mit etwa 5 mg Harz as152 (cyclisch ohne<br />
PGs) bestückt. Zum Einstellen des pH-Wertes wurde das Harz einmal 20 min und<br />
fünfmal 2 min mit Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 8, 50 mM) gewaschen.<br />
1,46 mg Trypsin wurden in 500 µl Puffer gelöst (0,124 mM), zum Harz aufgezogen<br />
und über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag wurde siebenmal je eine Minute mit<br />
Puffer und sechsmal je eine Minute mit Methanol gewaschen. Zum Abspalten des<br />
Peptids vom Harz wurde nach AAV 14 vorgegangen.<br />
8.3.8.2 Tryptischer Verdau in Lösung<br />
1 mg des vollständig entschützten cyclischen Peptids wurde in 150 µl Ammonium-<br />
hydrogencarbonat-Puffer (pH 8, 50 mM) gelöst, so dass eine 5,2 mM Lösung<br />
entstand. 0,3 mg Trypsin wurden in 200 µl Puffer gelöst, so dass eine 0,064 mM<br />
Lösung entstand. Nun wurden 10 µl der Trypsinlösung zur Peptidlösung pipettiert.<br />
Anschließend wurden 10 µl dieser Lösung in die Trypsinlösung pipettiert. Somit<br />
wurden zwei Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Trypsin und Peptid<br />
erhalten. Nach sieben Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von Methanol<br />
(ca. 3 Tropfen) gestoppt und die Lösung anschließend lyophilisiert.<br />
144
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.8.3 Synthese der Kontrollpeptide zur Optimierung des on-beadassays<br />
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Met-OH<br />
beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,13 mmol/g. Die Festphasen-<br />
synthese des Peptids erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. 20µMspezial.kem<br />
wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die Modulfolge<br />
eGD (initial Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zehn verlief mit der Modulfolge<br />
BbDAFiiihD (Single Couple, Cond Cap/5 eq.) und als abschließender Zyklus folgte<br />
Dc (Final Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Ala-OH,<br />
Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-<br />
His(Trt)-OH und Fmoc-Pro-OH. Nach der automatisierten SPPS erfolgte die<br />
Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10, sowie die<br />
Entfernung der säurelabilen Schutzgruppen nach AAV 12.<br />
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV<br />
14 gespalten.<br />
Positivkontrolle<br />
H-Gly-His-Pro-Gln-Gly-βAla-Pro-Pro-Arg-Hsl<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (10-85% B in 20 min, 0,9 ml/min), tR = 9,0 min<br />
MALDI-TOF-MS: 999,6 m/z [M+H] +<br />
C43H67N16O12 (999,5119) m/z<br />
Negativkontrolle<br />
H-Ala-Pro-Ala-Arg-Gly-βAla-Pro-Pro-Arg-Hsl<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (10-85% B in 20 min, 0.9 ml/min), tR = 9,2 min<br />
MALDI-TOF-MS: 975,4 m/z[M+H] +<br />
C42H71N16O12 (975,5483) m/z<br />
145
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.8.4 Synthese der Bibliothek 86<br />
Die Festphasensynthese der Bibliothek 86 erfolgte an aminofunktionalisiertem<br />
TentaGel-Harz (MB 300 bzw S-NH2). Zur ersten Aminosäurenkupplung wurden 5 eq.<br />
Fmoc-Met-OH, 3 eq. Boc-Met-OH, 7,8 eq. HBTU, 8 eq. HOBt und 16 eq. DIPEA<br />
verwendet und entsprechend AAV 1 verfahren. Es ergab sich eine Beladungsdichte<br />
von 0,16 mmol/g. Für die anschließende Synthese der Massenspacer-Sequenz<br />
wurden die folgenden Aminosäurebausteine verwendet: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-<br />
Pro-OH, Fmoc-βAla-OH und Fmoc-Glu(OAll)-OH. Zur Anknüpfung der Aminosäuren<br />
wurde AAV 3 verwendet. Das anschließende capping erfolgte nach AAV 5. Die<br />
Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe verlief wie in AAV 10 beschrieben.<br />
Die Vollständigkeit der Fmoc-Abspaltung wurde mittels UV-Spektroskopie überprüft<br />
und gegebenenfalls wiederholt. Für die anschließenden kombinatorischen<br />
Kupplungsschritte wurde das Harz vor der Aminosäurenkupplung entsprechend der<br />
Anzahl an Kupplungen in PE-Spritzen aliquotiert. Die separaten Kupplungen<br />
erfolgten ebenfalls wie in AAV 3 beschrieben. Nach erfolgreicher Umsetzung wurden<br />
die aliquoten Harzmengen vereinigt und nach AAV 5 gecappt. Es folgte die Fmoc-<br />
Entschützung nach AAV 10; auch hierbei wurde die Abspaltlösung mittels UV-<br />
Spektroskopie untersucht. Nach erfolgreicher Freisetzung des N-Terminus wurde<br />
das Harz erneut aufgeteilt. In der kombinatorischen Synthese kamen folgende<br />
Aminosäuren zum Einsatz: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(O t Bu)-OH,<br />
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser( t Bu)-OH,<br />
Fmoc-Thi-OH und Fmoc-Trp(Boc)-OH. Nach der letzten Kupplung mit Boc-<br />
Lys(Alloc)-OH wurde das Harz gut mit DMF und DCM gewaschen und im Vakuum<br />
getrocknet. Die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 11.<br />
Daraufhin wurde wie in AAV 8 beschrieben unter Verwendung von PyBOP cyclisiert.<br />
Zur Lagerung wurde die mit Peptidylharz bestückte Einwegspritze in einem mit Argon<br />
gefluteten Schraubdeckelglas im Kühlschrank aufbewahrt. Die Entfernung der<br />
säurelabilen Schutzgruppen erfolgte unmittelbar vor dem Einsatz im biologischen<br />
Test nach AAV 12.<br />
146
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.9 Synthese der Peptide (92-97) zur Bestimmung der KD-Werte<br />
Die Festphasensynthese der Peptide erfolgte an RinkAmid-Research-Harz (R-RAM-<br />
TG, Rapp Polymer) am Peptidsynthesizer nach AAV 7. UV FastMoc0.10,S200.kem<br />
wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die Modulfolge<br />
ecDBgADEFd (Zyklus1: Amid) verwendet. Zyklus zwei bis elf verlief mit der<br />
Modulfolge BbADEFfhd (SingCoup,CondCap.) und als abschließender Zyklus folgten<br />
die Module ecD (Complete wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden<br />
verwendet: Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,<br />
Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Lys(Alloc)-OH bzw.<br />
Boc-Lys(Alloc)-OH.<br />
Die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 11 Variante B.<br />
Nach ausführlichem Waschen des Harzes, einer Testabspaltung und MALDI-TOF-<br />
MS Analyse wurde das Harz in zwei gleich große Aliquote aufgeteilt. Eine Hälfte<br />
wurde als lineares Peptid direkt nach AAV 19 vom Harz gespalten.<br />
Die zweite Hälfte wurde wie AAV 8 beschrieben cyclisiert, und anschließend nach<br />
AAV 19 vom Harz gespalten.<br />
Hitsequenz: 93/92<br />
H-Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (93)<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1252,1 m/z<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (11-15% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 7,0 min<br />
Ausbeute nach HPLC: 17% (10,7 mg)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 12,4 min<br />
ESI-QTOF: 1252,6653 m/z (±0,4 ppm)<br />
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)<br />
H-cyclo[Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (92)<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1234,3 m/z<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,6 min<br />
Ausbeute nach HPLC: 22% (13,5 mg)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,1 min<br />
ESI-QTOF: 1234,6576 m/z (±1,9 ppm)<br />
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)<br />
147
8 Experimenteller Teil<br />
HPQ-Motiv, aber nicht Hit: Peptide 95/94<br />
H-Lys(Alloc)-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1376,5 m/z<br />
Berechnet: C61H94N21O16 + (1376,7182 m/z)<br />
H-Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (95)<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1252,4 m/z<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,5 min<br />
Ausbeute nach HPLC: 26% (16,3 mg)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,2 min<br />
ESI-QTOF:1252,6679 m/z (± 1,7 ppm)<br />
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)<br />
H-cyclo[Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (94)<br />
Roh MALDI-TOF-MS:1234,6 m/z<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,9 min<br />
Ausbeute nach HPLC: 32% (19,6 mg)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,2 min<br />
ESI-QTOF:1234,6557 m/z (± 0,4 ppm)<br />
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)<br />
Negativ-Kontrolle: Peptide 97/98<br />
H-Lys(Alloc)-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1376,4 m/z<br />
Berechnet: C61H94N21O16 + (1372,7182 m/z)<br />
H-Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (97)<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1252,4 m/z<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,8 min<br />
Ausbeute nach HPLC: 6% (3,9 mg)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 12,3 min<br />
ESI-QTOF: 1252,6663 m/z (± 0,4 ppm)<br />
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)<br />
148
H-cyclo[Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (96)<br />
Roh MALDI-TOF-MS: 1234,3 m/z<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,6 min<br />
Ausbeute nach HPLC: 33% (20,2 mg)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,5 min<br />
ESI-QTOF: 1234,6558 m/z (± 0,5 ppm)<br />
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)<br />
149
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.10 Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide<br />
8.3.10.1 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y241<br />
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen<br />
(Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Synthese des<br />
Peptids am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem chemistry files. Im<br />
ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der<br />
darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem<br />
abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die automatisierte SPPS beendet.<br />
Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-<br />
Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-<br />
OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH und<br />
Fmoc-Tyr(tBu)-OH.<br />
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu<br />
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.<br />
Fmoc-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (110→)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (15-100% B in 30 min, 0,9 ml/min) tR = 12,9 min<br />
ESI-MS: 2068,5 m/z [M+H] 1+ , 1035,0 m/z [M+2H] 2+ , 690,5 m/z [M+3H] 3+ , 518,0 m/z [M+4H] 4+<br />
Berechnet: C93H136N25O25S2 + (avarage 2068,35 m/z)<br />
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-<br />
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel<br />
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach<br />
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.<br />
SRBS-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH SRBS-Y241<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (27-53% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 11,4 min<br />
ESI-MS: 2387,7 m/z<br />
Ausbeute: 34% (16 mg)<br />
Berechnet: C105H154N27O29S4 + (exacte 2385,0283 m/z, avarage 2386,7692 m/z)<br />
150
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.10.2 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids<br />
SRBS-pY241<br />
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen<br />
(Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der<br />
ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM<br />
spezial.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen<br />
(Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid<br />
(Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc)<br />
wurde die automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden<br />
verwendet: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-<br />
His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Met-OH.<br />
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu<br />
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.<br />
Fmoc -Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (111→)<br />
MALDI-TOF-MS: 1082,4 m/z<br />
Berechnet: C48H68N13O12S2 + (exacte 1082,4546 m/z)<br />
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-<br />
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Tyr[PO(OBzl)OH]-OH (5 eq.)<br />
unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA. angeknüpft. Es<br />
wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen. Auch die Anknüpfung der nächsten<br />
Aminosäure (Fmoc-Ile-OH) erfolgte wie eben beschrieben manuell.<br />
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.<br />
Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschreiben vorgegangen.<br />
Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-<br />
Asp(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc) und Fmoc-<br />
Thr(tBu)-OH.<br />
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-<br />
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel<br />
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach<br />
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.<br />
151
8 Experimenteller Teil<br />
SRBS-pY241<br />
SRBS-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 30-45% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 11,1 min<br />
ESI-MS: 2464,5 m/z [M+H] 1+ , 1233,3 m/z [M+2H] 2+ und 822,5 m/z [M+3H] 3+<br />
Ausbeute: 13% (6,3 mg)<br />
Berechnet: C105H155N27O32PS4 + (exacte 2464,9946m/z, avarage 2466,7491 m/z)<br />
152
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.10.3 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y230<br />
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen<br />
(Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der<br />
ersten neun Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem<br />
chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die<br />
Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple,<br />
Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die<br />
vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden<br />
verwendet: Fmoc-Glu(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,<br />
Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Tyr( t Bu).<br />
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu<br />
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.<br />
Fmoc-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (119→)<br />
MALDI-TOF-MS: (roh)<br />
[M+H] + gemessen Intensität Beschreibung [M+H] + berechnet<br />
1381,5 m/z 100% Fmoc-Ile…-OH 1381,6674 m/z (C68H93N12O19 + )<br />
1088,3 m/z 13% Ac-Tyr...-OH 1088,5259 m/z (C49H74N11O17 + )<br />
925,2 m/z 21% Ac-Glu 2 …-OH 925,4625 m/z (C40H65N10O15 + )<br />
796,2 m/z 9% Ac-Glu 1 ..-OH 796,4199 m/z (C35H58N9O12 + )<br />
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-<br />
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Ala-Ser(Ψ MeMe Pro)-OH (5 eq.)<br />
unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA angeknüpft. Es<br />
wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen.<br />
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.<br />
Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschrieben vorgegangen.<br />
Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-<br />
OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Thr( t Bu)-OH.<br />
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu<br />
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.<br />
153
8 Experimenteller Teil<br />
Fmoc-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (121→)<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B in 20 min, 0,9 ml/min) tR = 17,2 min<br />
MALDI-TOF-MS: 1966,2 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C92H134N21O27 + (exacte 1964,9753 m/z, avarage 1966,1723 m/z)<br />
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-<br />
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel<br />
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach<br />
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.<br />
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH SRBS-Y230<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 30-75% B in 30 min, 9,8 ml/min) tR = 14,9 min<br />
MALDI-TOF-MS: 2284,4 m/z [M+H] 1+<br />
Ausbeute: 6% (2,5 mg)<br />
Berechnet: C104H152N23O31S2 + (exacte 2283,0461 m/z, avarage 2284,5846 m/z)<br />
154
8 Experimenteller Teil<br />
8.3.10.4 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids<br />
SRBS-pY230<br />
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen<br />
(Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der<br />
ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM 15 min<br />
länger UV.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen<br />
(Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid<br />
(Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc)<br />
wurde die vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine<br />
wurden verwendet: Fmoc-Glu(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH und<br />
Fmoc-Lys(Boc)-OH.<br />
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu<br />
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.<br />
Fmoc-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (122→)<br />
MALDI-TOF-MS: 1105,3 [M+H] +<br />
Berechnet: C53H73N10O16 + (exacte 1105,5201 m/z, avarage 1106,2036 m/z)<br />
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte manuell. Die Abspaltung der<br />
N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 10, wobei deren Erfolg stets<br />
mittels UV-Quantifizierung überprüft wurde. Die Anknüpfung der Aminosäure-<br />
bausteine wurde wie in AAV 3 beschrieben durchgeführt. Zur Aktivierung wurde<br />
PyBOP/ HOBt verwendet. Die letzten beiden Aminosäuren (Arg und Pro) wurden mit<br />
PyAOP/ HOAt aktiviert. Nach dem Aufbau der Peptidkette wurde nach AAV 9 das<br />
Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit<br />
Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.<br />
SRBS-pY230<br />
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH<br />
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 35-60% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 10,9 min<br />
ESI-MS: 2364,4 m/z [M+H] 1+<br />
Ausbeute: 14% (6,4 mg)<br />
Berechnet: C104H152N23O34PS2 + (exacte 2363,0124 m/z, avarage 2364,5645 m/z)<br />
155
8 Experimenteller Teil<br />
8.4 Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im<br />
PED<br />
8.4.1 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Val)<br />
81<br />
Zu einer Lösung aus 100 mg D-Valin (1 eq., 0,85 mmol) in 14 ml Pyridin/Wasser (4:3)<br />
wurde 1 ml (10 eq., 8,54 mmol) Phenylisothiocyanat addiert und auf 55°C erhitzt.<br />
Nach 18 h wurde dreimal mit n-Hexan/DCM (9:1) gewaschen, um überschüssige<br />
Reagenzien und Nebenprodukte zu entfernen. Die wässrige Phase wurde am<br />
Vakuum getrocknet.<br />
Aus dem Rohprodukt (80) wurden folgende analytische Daten erhalten.<br />
1 H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ = 9,05 (br, 1H), 8,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H; NH(Val)), 7,30-6,91<br />
(m, 5H, ar.), 3,39-3,28 (m, 1H; CH(β)), 2,82-2,73 (m, 1H; CH(α)), 1,15-1,09 (m, 6H; CH3(γ/γ’))<br />
ppm.<br />
13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 180,13 (CS), 175,92 (CO), 138,72, 128,63, 124,80, 124,42<br />
(ar.), 64,27 (CH(α)), 31,36 (CH(β)), 18,90, 17,88 (CH3(γ/γ’) ppm.<br />
Der Rückstand wurde in TFA aufgenommen und 1 h bei Raumtemperatur gerührt.<br />
Anschließend wurde die Säure im Stickstoffgegenstrom verdampft und der<br />
Rückstand am Vakuum getrocknet. PTH-Val (81)wurde als farbloser Feststoff in<br />
quantitativer Ausbeute erhalten.<br />
analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (45-100% B in 20 min TFA) tR = 9,0 min,<br />
ESI-QTOF (pos. Modus): 235,0894 m/z (±2,5 ppm), berechnet: C12H15N2OS + (235,0900 m/z).<br />
ESI-QTOF (neg. Modus): 233.0766 m/z (±5.1 ppm), berechnet: C12H13N2OS - (233,0754 m/z).<br />
1 H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ = 7,90 (s, 1H, NH), 7,27-7,54 (m, 5H, ar.), 4,18 [dd, J = 3,82,<br />
1.25 Hz, 1H, CH(α)], 2,32-2,44 [m, 1H, CH(β)],1,05 und 1,14 [d+d, 3+3H, J = 6,90 Hz,<br />
CH3(γ/γ’)] ppm.<br />
13 C-NMR (62,5 MHz, CDCl3): δ =184,3 (CS), 172,8 (CO), 128,2, 129,1, 129,2 und 132,6 (ar.),<br />
64,9 [CH(α’)], 31,1[CH(β)], 18,7 and 16,2 [CH3(γ/γ’)] ppm.<br />
156
8 Experimenteller Teil<br />
GC-MS m/z (%) = 234 (100) [M + ], 206 (16.8), 192 (40.2) [M + -CS], 135 (59,8), 77 (29,9)<br />
[C6H5 + ].<br />
IR (KBr pellet, cm -1 ): ν ∼ =3205,5 (br), 2959,8 (w), 2875,1 (w), 1759,8 (s), 1499,5 (s), 1409,7<br />
(m), 1351,4 (w), 1329,7 (w), 1272,6 (m), 1195,2 (m), 1147,4 (w), 1073,4 (w), 1028,3 (w),<br />
973,6 (w).<br />
8.4.2 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-hydantoin 82<br />
66 mg PTH-Val wurden in 5,7 ml einer BrCN-Lösung (40 mg/ml, in 70% TFA aq.)<br />
aufgenommen und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung<br />
wurde getrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.<br />
Das Rohprodukt wurde mittels präparativer RP-HPLC (45-60 % B in 20 min, tR = 7,6-<br />
7,8 min) aufgereinigt. Nach chromatographischer Reinigung wurden 43 mg<br />
(0,197 mmol, 70%) erhalten.<br />
Analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (45-100% B in 20 min) tR = 6,2 min,<br />
ESI-QTOF (pos. Modus): 219,1128 m/z (± 5,0 ppm), berechnet: C12H15N2O2 + (219,1128 m/z)<br />
1 H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ = 7,34-7,50 (m, 5H, ar.), 6,74 (s, 1H, NH), 4,07 [dd, J = 1,18,<br />
3,65 Hz, 1H, CH(α)], 2,26-2,38 [m, 1H, CH(β)], 1,00 und 1,08 [d+d, 3+3H, J = 6.98 Hz,<br />
CH3(γ/γ’)] ppm.<br />
13 C-NMR (62,5 MHz, CDCl3): δ = 172,3 (CO), 157,2 (CO-urea), 126,1, 1282, 129,0 und<br />
131,4 (ar.), 62,1 [CH(α’)], 30,6[CH(β)],18,6, 16,0 [CH3(γ/γ’)] ppm.<br />
GC-MS m/z (%) = 218 (55,6) [M + ], 176 (100) [PhNCO i Pr + ], 119 (90,7) [PhNCO + ], 91 (17,6)<br />
[PhN + ], 77 (10,2) [Ph + ], 56 (4,6) [ i Pr + ].<br />
IR (ATR, cm -1 ): ν ∼ = 3261,6 (br), 2961,8 (w), 2872,7 (w), 1784,2 (w), 1706,6 (vs), 1598,3 (w),<br />
1500,8 (m), 1466,1 (w), 1456,0 (w), 1419,7 (s), 1390,9 (w), 1303,9 (w), 1348,8 (m), 1303,9<br />
(w), 1264,1 (w), 1235,9 (w), 1172,2 (m), 1134,1 (w), 1092,8 (w), 1069,5 (w), 1034,8 (w),<br />
987,8 (w), 925,3 (w).<br />
157
8 Experimenteller Teil<br />
8.5 On-bead-Screening<br />
Verwendete Reagenzien<br />
AP-Streptavidin-Konjugat Sigma S 2890<br />
BCIP/NBT-Färbetabletten Sigma B 5655<br />
Biotin-N-Hydroxysuccinimidoester ICN 150048<br />
Tween 20 Fluka 93773<br />
Gelatine K-classic (Kaufland)/ Haushaltsgelatine<br />
Geräte<br />
Stereolupe Olympus SZ 4045 TR<br />
Kamera Olympus Camedia C-7070 wide zoom<br />
8.5.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das<br />
Screening:<br />
TBS-Puffer (Tris-gepufferte Salzlösung)<br />
Zur Herstellung des TBS-Puffers wurden 3,94 g Tris·HCl (100 mM), 1,46 g NaCl<br />
(100 mM) und 254,1 mg MgCl2·6 H2O (5 mM) in 150 ml Wasser gelöst, durch Zugabe<br />
von 1 N NaOH (20 ml) auf pH 9,0 eingestellt und anschließend im einem<br />
Messzylinder auf 250 ml mit Wasser aufgefüllt.<br />
PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung)<br />
Zur Herstellung des PBS-Puffers wurden 2,865 g Na2HPO4·12 H2O (8 mM), 234,6<br />
mg NaH2PO4·2 H2O (1,5 mM) und 8,164 g NaCl (139,7 mM) in ca. 900 ml Wasser<br />
gelöst. Durch Zugabe von NaOH wurde der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und<br />
anschließend im 1 l Messkolben mit Wasser bis zur Markierung aufgefüllt.<br />
158
Gelatine Blocking-Puffer<br />
8 Experimenteller Teil<br />
10 mg Gelatine wurden in einem Messzylinder eingewogen und in 8 ml Wasser auf<br />
einem Wasserbad 10 min gerührt. Anschließend wurde mit Wasser auf 10 ml<br />
aufgefüllt. Die Lösung wurde für jedes Screening frisch hergestellt.<br />
Färbelösung<br />
Zum Anfärben der Harzkugeln wurde eine BCIP/NBT-Färbetablette in 10 ml Wasser<br />
aufgelöst und die entstandene Lösung direkt eingesetzt.<br />
Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat<br />
Das gekaufte Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lyophilisat (1mg) wurde<br />
in 1 ml Wasser gelöst, in 20 aliquoten Teilen auf Caps verteilt und lyophilisiert. Die<br />
gewünschte Verdünnung (1:10000 bzw. 1:1000 bezogen auf 1 mg/ml) wurde<br />
unmittelbar vor den Versuchen durch Verdünnung mit 0,1% Tween, 0,1% Gelatine in<br />
PBS-Puffer hergestellt und nicht verwendete Lösungen wurden verworfen.<br />
Guanidinium-Lösung<br />
57,32 g Guanidinium*HCl (6 M) wurden in 80 ml Wasser gelöst und mit 1N HCl auf<br />
pH 1,0 eingestellt. Anschließend wurde mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.<br />
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2<br />
200 mg TentaGel (130 µm, 0.32 mmol/g, 64 µmol) wurden in einer 5 ml-Spritze mit<br />
PE-Fritte eingewogen und mit 3 ml DMF 10 min quellen lassen. 4 eq. Biotin-N-<br />
Hydroxysuccinimidoester (Biotin-NHS) (87,4 mg, 256 µmol) und 8 eq. DIPEA (87,6<br />
µl, 512 µmol) wurden in 2 ml DMF gelöst, zum Harz aufgezogen und 4 h gekuppelt.<br />
Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit Kaiser- und TNBS-Test (siehe AAV 4)<br />
überprüft. Nach dem Waschen mit DMF (5x1 min) erfolgte ein Capping mit<br />
Essigsäureanhydrid (10% in DMF). Nach erneutem Waschen mit DMF (10x1 min)<br />
und DCM (5x1 min) wurde das Harz im Ölpumpenvakuum getrocknet.<br />
159
8 Experimenteller Teil<br />
8.5.3 Enzymgekoppelter Farbreaktionstest<br />
Kontrollversuche<br />
Jeweils 10 mg (ca. 7800 Kugeln) TentaGel S-NH2 (neg. Kontrolle), sowie an<br />
TentaGel gebundene Peptide [as231 pos und as232 neg] und Biotin (pos. Kontrolle)<br />
wurden in jeweils einer 5 ml-Spritze mit PE-Fritte eingewogen. Falls nicht anders<br />
beschrieben, wurde das Harz 2x5 min und 4x1 min mit PBS und anschließend 5x1<br />
min mit Wasser gewaschen. Zum Blocken von unspezifischen Bindungen wurden die<br />
Harzkugeln über Nacht mit 0,1% Gelatine (w/v) in Wasser behandelt. Das Harz<br />
wurde anschließend 1x15 min und 4x1 min mit 0,1% Tween in PBS und 4x1min mit<br />
0,1% Tween, 0,1% Gelatine in PBS gewaschen. Nun folgte eine 3.5 h Inkubation mit<br />
der Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lösung. Das nicht gebundene<br />
überschüssige SA-AP Konjugat wurde mit 0,1% Tween in PBS (15x1 min) weg-<br />
gewaschen. Anschließend wurde das Harz mit TBS umgepuffert (15x1 min).<br />
Daraufhin wurden die Harzkugeln mit Färbelösung versetzt. Nach 30 min wurde die<br />
enzymatische Reaktion durch Zugabe von 0,1 N HCl gestoppt. Schließlich wurden<br />
die Harzkugeln 5x1 min mit Wasser gewaschen, in Petrischalen überführt und unter<br />
dem Mikroskop betrachtet.<br />
Screening der Bibliothek 86<br />
In einer 5 ml-Spritze mit PE-Fritte wurden 195 mg (ca. 12.700 Harzkugeln) der<br />
festphasengebundenen Bibliothek eingewogen. Nach Entfernen der säurelabilen<br />
Schutzgruppen wurde das Harz ausführlich mit Wasser und PBS gewaschen und<br />
schließlich wie im voran stehenden Abschnitt (Kontrollversuche) beschrieben<br />
behandelt. Die Identifizierung der Hitsequenzen wird im nachfolgenden Abschnitt<br />
beschrieben.<br />
160
8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Die positiv getesteten violetten Harzkugeln (Hitbeads) wurden mit einer Glaskapillare<br />
separiert und in einer 2 ml–Spritze mit PE-Fritte vereinigt (der PED erfolgte für alle<br />
Hitbeads gemeinsam). Zum Abstreifen des Streptavidin-Alkalische Phosphatase-<br />
Konjugats wurden die Kugeln 1x5 min und 4x1 min mit 6 M Guanidin-HCl Lösung<br />
(pH 1,0) behandelt. Anschließend wurde je 5x1 min mit Wasser und Acetonitril<br />
gewaschen und am Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Zum Waschen und pH-Wert-<br />
Einstellen wurden die Kugeln der Reihe nach mit DCM (3x1 min), Acetonitril (3x1<br />
min), Wasser (3x1 min), Pyridin (3x1 min) und 0,1% Triethylamin in Pyridin/Wasser<br />
(2:1) behandelt. 480 µl FmocOSu-Lösung (5,4 mg in 480 µl Pyridin / 0,03 M) und<br />
54 µl Phenylisothiocyanat (0,45 mmol) wurden unmittelbar vor Gebrauch gemischt,<br />
zum vorbehandelten Harz aufgezogen und 8 min reagieren lassen. Daraufhin wurde<br />
je 3x1 min mit Pyridin, Acetonitril und DCM gewaschen. Nach saurer Spaltung mit<br />
TFA (1x1 min und 2x6 min) erfolgte ein erneuter Durchgang des PED. Die PED-<br />
Zyklen wurden (n+1) mal wiederholt, wobei n die Anzahl der zu sequenzierenden<br />
Aminosäuren darstellt. Beim letzten PED-Durchlauf wurde nach der sauren Spaltung<br />
mit TFA je 3x1 min mit DCM, Pyridin und DCM gewaschen. Mit 20% Piperidin in DMF<br />
(1x1 min, 3x5 min) wurde das Fmoc-Capping aufgehoben und 10x1 min mit DMF<br />
und 5x1 min mit DCM gewaschen. Für die MALDI-TOF Analyse wurden die Kugeln<br />
nun in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in jeden Cap immer<br />
nur eine Kugel sein durfte (unter der Stereolupe überprüfen). Nach einem kurzen<br />
spindown in der Zentrifuge wurden je 10 µl Bromcyan-Lösung (40 mg BrCN in 1 ml<br />
70% TFA aq.) hinzugefügt und über Nacht einwirken lassen. Nach Trocknen am<br />
Vakuum wurde das vom Harz abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in<br />
Wasser/Acetonitril (1:2)) aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl<br />
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)<br />
wurden auf dem MALDI target gemischt.<br />
161
8 Experimenteller Teil<br />
8.6 SPR-Experimente zur Bestimmung der KD-Werte<br />
8.6.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die SPR-<br />
Experimente<br />
Acetat-Puffer (pH 4,5)<br />
Zunächst wurden zwei 0,2 M Stammlösungen hergestellt. Für die saure Stamm-<br />
lösung wurden 1,14 ml Eisessig in 100 ml Wasser gemischt. Für die basische<br />
Stammlösung wurden 1,64 mg Natriumacetat in 100 ml Wasser gelöst. Zur<br />
Herstellung des Puffers wurden 50 ml der basischen Stammlösung vorgelegt und<br />
durch Zugabe der sauren Stammlösung auf pH 4,6 eingestellt. Anschließend wurden<br />
50 ml dieser Pufferlösung entnommen und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.<br />
HBS-N Puffer (pH 7,2)<br />
Zur Herstellung von 2 l HBS-N Puffer wurden 4,766 g (10 mM) Hepes und 17,532 g<br />
NaCl (150 mM) in ca. 1,6 l Wasser gelöst, durch Zugabe von 1 N NaOH (ca. 10 ml)<br />
auf pH 7,2 eingestellt und anschließend auf 2 l mit Wasser aufgefüllt.<br />
Aktivierungslösung<br />
Unmittelbar vor Gebrauch wurden folgende drei Lösungen als Aktivierungs-„Kit“<br />
hergestellt.<br />
1) 76,6 mg EDC wurden in 1 ml Wasser gelöst (0,4 M)<br />
2) 11,5 mg NHS wurden in 1 ml Wasser gelöst (0,1 M)<br />
3) 60 µl Ethanolamin wurden mit 940 µl Wasser gemischt und durch vorsichtige<br />
Zugabe von konz. HCl auf pH 8,5 eingestellt.<br />
Streptavidin (50 µg/ml)<br />
0,1 mg Streptavidin wurden in 2 ml NaOAc-Puffer gelöst.<br />
Verdünnungsreihe der Peptide<br />
Die zu untersuchenden Peptide (92-97) wurden in Eppendorf-Caps eingewogen und<br />
in HBS-N Puffer gelöst. Anschließend wurden in Mikrotitterplatten 1:1<br />
Verdünnungsreihen hergestellt.<br />
162
8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente<br />
8 Experimenteller Teil<br />
Die SPR-Messungen erfolgten an einem Biacore T100 Gerät (Biacore, Uppsala,<br />
Schweden) unter Verwendung eines CM5-Sensorchips (ebenfalls von Biacore). Alle<br />
Messungen erfolgten bei 25°C. Die Streptavidin-Immobilisierung erfolgte mittels<br />
EDC/NHS-Aktivierung unter Verwendung der oben beschriebenen Lösungen analog<br />
der im Handbuch [126] beschriebenen Vorgehensweise. Die Flussrate betrug<br />
10 µl/min. Zur Immobilisierung des Liganden wurde eine Injektionszeit von 900<br />
Sekunden gewählt. Zusätzlich zur Messzelle wurde eine Referenzzelle hergestellt.<br />
Diese wurde analog der Bindungsmesszelle beladen, jedoch ohne Injektion des<br />
Liganden. Nach erfolgreicher Streptavidin-Immobilisierung wurden mit einer<br />
Flussrate von 40 µl/min und einer Injektionszeit von 90 Sekunden die<br />
Verdünnungsreihen (0,3-700 µM bzw. 0,01-10 mM) der einzelnen Peptide<br />
vermessen. Nach jeder Peptidinjektion erfolgte eine Regeneration der Oberfläche<br />
durch Behandlung mit HBS-N Puffer für 300 Sekunden bei einer Flussrate von 40<br />
µl/min. Zur Auswertung wurde das zum Gerät gehörende Programm Biacore T100<br />
Evaluation Software (Version 1.1) verwendet. Bei allen herangezogenen Daten<br />
handelt es sich um Differenzmesswerte (Signal der Referenzzelle subtrahiert vom<br />
Signal der Bindungsmesszelle). Die erhaltenen Sensorgramme wurden durch<br />
Anwendung der steady-state-affinity ausgewertet.<br />
163
9 Literaturverzeichnis<br />
9 Literaturverzeichnis<br />
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169
9 Literaturverzeichnis<br />
170
10 Anhang<br />
10.1 HPLC-offline-MS-Charakterisierung<br />
10.1.1 Modellpeptid 77<br />
1250<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
0<br />
-250<br />
mAU<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
H 2N<br />
O<br />
HN<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
O<br />
H<br />
N<br />
Chemical Formula: C 68H99N16O17S +<br />
Exact Mass: 1443,7089<br />
Molecular Weight: 1444,6751<br />
O<br />
N<br />
O<br />
O<br />
N<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
HN<br />
NH2<br />
O<br />
S NH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
13.404<br />
15.014<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
0<br />
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min<br />
16.948<br />
10 Anhang<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
171
10 Anhang<br />
10.1.2 Peptid 63 (Trp-Xaa Sollbruchstelle)<br />
Cyclo[Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu(bAla-bAla-Phe(4Br)-Arg-Hsl)] (63→ 64)<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (45-100% B in 20 min, 1 ml/min) tR = 11,1 min<br />
ESI-MS: 1397,9 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C61H83BrN19O16 + (1398,53 m/z)<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
-50<br />
-100<br />
HPLC-Chromatogramm<br />
mAU<br />
300<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
172<br />
0<br />
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min<br />
ESI-IT-Massenspektrum<br />
10.965 11.133<br />
H 2N<br />
13.672<br />
O<br />
HN<br />
O<br />
O<br />
N<br />
H<br />
N<br />
N<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
NH O<br />
O<br />
NH<br />
18.054<br />
HN<br />
NH<br />
O<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
H<br />
N<br />
+<br />
Chemical Formula: C61H81BrN19O15 Exact Mass: 1398,5337<br />
Molecular Weight: 1400,3176<br />
O<br />
N<br />
H<br />
H 2N NH 2<br />
O<br />
Br<br />
NH<br />
H<br />
N<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
O<br />
O<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10
10.1.3 Peptid 71 (enzymatische Ringöffnung)<br />
cyclo-[Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(bAla-Pro-Pro-bAla-Hsl)] (71→72)<br />
10 Anhang<br />
Analytische RP-HPLC (Eurospher Säule): (10-100% B° in 20 min, 1 ml/min) tR = 12,1 min<br />
MALDI-MS: 1274,5 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C60H85N14O17 + (1273,6212 m/z)<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
HPLC-Chromatogramm<br />
mAU<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
-500<br />
0<br />
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min<br />
MALDI-TOF-Massenspektrum<br />
12.112<br />
HO<br />
O<br />
NH 3<br />
NH<br />
NH<br />
N O<br />
H<br />
O HN<br />
O<br />
O O<br />
O NH<br />
HN<br />
O<br />
O<br />
HN O<br />
O NH<br />
NH<br />
O<br />
H<br />
N<br />
HN<br />
O<br />
O<br />
HO<br />
O<br />
+<br />
Chemical Formula: C60H85N 14O17 Exact Mass: 1273,6212<br />
Molecular Weight: 1274,4000<br />
N<br />
N<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
173
10 Anhang<br />
10.1.4 Peptid 53 (HMBA- bzw. Glykolamid-Linker)<br />
Ac-Phe-Trp-Arg-Ala-NHPropyl<br />
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (55-100% B° in 30 min, 1 ml/min) tR = 15,2 min<br />
ESI-MS: 662,0 m/z [M+H] +<br />
Berechnet: C34H48N9O5 + (662,3773 m/z)<br />
2250<br />
2000<br />
1750<br />
1500<br />
1250<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
0<br />
-250<br />
HPLC-Chromatogramm<br />
mAU<br />
2500 220nm,4nm (1.00)<br />
-500<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min<br />
174<br />
ESI-Massenspektrum<br />
15.213<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
H<br />
N<br />
NH<br />
H 2 N<br />
O<br />
Chemical Formula: C 34H 48N 9O 5 +<br />
Exact Mass: 662,3773<br />
Molecular Weight: 662,8017<br />
N<br />
H<br />
NH<br />
NH 2<br />
O<br />
H<br />
N<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10
10.1.5 SPR Peptide 92-97<br />
H-Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (95)<br />
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR= 13,2 min<br />
ESI-QTOF: 1252,6679 m/z (±1,7 ppm)<br />
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)<br />
1250<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
mAU<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
0<br />
-250<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min<br />
Intens.<br />
x105<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
Intens.<br />
x105<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
1252.6679<br />
13.156<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
10 Anhang<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
+MS, 1.9min #113<br />
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z<br />
1252.6679<br />
1272.1458<br />
1274.6499<br />
1290.6182<br />
1296.6313<br />
+MS, 1.9min #113<br />
1250 1260 1270 1280 1290 1300 m/z<br />
175
10 Anhang<br />
H-cyclo[Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (94)<br />
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 13.2 min<br />
ESI-QTOF:1234,6557 m/z (±0,4 ppm)<br />
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)<br />
mAU<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
1500<br />
1250<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
0<br />
-250<br />
Intens.<br />
x104<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Intens.<br />
x104<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
176<br />
13.239<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min<br />
1234.6557<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
+MS, 0.8-0.8min #(47-48)<br />
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z<br />
1234.6557<br />
1256.6359<br />
+MS, 0.8-0.8min #(47-48)<br />
1230 1240 1250 1260 1270 1280 m/z
H-Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (97)<br />
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 12,3 min<br />
ESI-QTOF: 1252,6663 m/z (±0,4 ppm)<br />
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)<br />
mAU<br />
400<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
350<br />
300<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
-50<br />
-100<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min<br />
Intens.<br />
x104<br />
2.0<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
Intens.<br />
x104<br />
2.0<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
1097.5973<br />
1234.6558<br />
12.286<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
10 Anhang<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
+MS, 1.7min #103<br />
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z<br />
1234.6558<br />
1250.6365<br />
1256.6369<br />
1272.6121<br />
+MS, 1.7min #103<br />
1230 1240 1250 1260 1270 1280 m/z<br />
177
10 Anhang<br />
H-cyclo[Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (96)<br />
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR =13,5 min<br />
ESI-QTOF: 1234,6558 m/z (±0,5 ppm)<br />
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)<br />
mAU<br />
400<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
350<br />
300<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
-50<br />
-100<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min<br />
Intens.<br />
x104<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Intens.<br />
x104<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
178<br />
996.5123<br />
1252.6663<br />
13.506<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
+MS, 1.8min #108<br />
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z<br />
1252.6663<br />
1274.6501<br />
1290.6325<br />
1296.6302<br />
+MS, 1.8min #108<br />
1250 1260 1270 1280 1290 1300 m/z
H-Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (93)<br />
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 12,4 min<br />
ESI-QTOF: 1252,6653 m/z (±0,4 ppm)<br />
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)<br />
mAU<br />
800 214nm,4nm (1.00)<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
-100<br />
-200<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min<br />
Intens.<br />
8000<br />
6000<br />
4000<br />
2000<br />
0<br />
Intens.<br />
8000<br />
6000<br />
4000<br />
2000<br />
0<br />
1110.7854<br />
1252.6653<br />
12.365<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
10 Anhang<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
+MS, 1.7-1.9min #(100-112)<br />
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z<br />
1246.7652<br />
1252.6653<br />
1264.6479<br />
1274.6490<br />
1286.6632 1290.6378<br />
1296.6296<br />
+MS, 1.7-1.9min #(100-112)<br />
1250 1260 1270 1280 1290 1300 m/z<br />
1304.7154<br />
179
10 Anhang<br />
H-cyclo[Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (92)<br />
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 13,1 min<br />
ESI-QTOF: 1234,6576 m/z (±1,9 ppm)<br />
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)<br />
mAU<br />
214nm,4nm (1.00)<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
-100<br />
-200<br />
0<br />
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min<br />
Intens.<br />
x105<br />
2.5<br />
2.0<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
Intens.<br />
x105<br />
2.5<br />
2.0<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
180<br />
1021.3025<br />
1234.6576<br />
13.123<br />
%<br />
B.Conc.(Method)<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
+MS, 1.7min #100<br />
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z<br />
1234.6576<br />
1256.6400<br />
1292.6183<br />
1314.5974<br />
+MS, 1.7min #100<br />
1200 1220 1240 1260 1280 1300 1320 m/z
10.2 Massenspektren der fluoreszenzmarkierten<br />
Phosphopeptide<br />
Intens.<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
(pY230)<br />
Intens.<br />
x105<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
10 Anhang<br />
SRBA-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (Y230)<br />
478.0<br />
615.1<br />
893.6<br />
1082.6<br />
1248.0<br />
1433.4<br />
1744.0<br />
2036.7<br />
2285.4<br />
2580.4 2733.1 2938.4 3092.9 3242.6 3370.4 3500.1<br />
500 1000 1500 2000 2500 3000 m/z<br />
SRBA-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH<br />
303.2<br />
439.4<br />
601.4<br />
789.2<br />
1183.4<br />
2364.4<br />
+MS, 0.1-0.8min #(4-20)<br />
500 1000 1500 2000 2500 m/z<br />
SRBA-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-Met-Asp-His-Lys-Ala-OH (Y241)<br />
181
10 Anhang<br />
Intens.<br />
x106<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
231.2<br />
(pY241)<br />
Intens.<br />
x104<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
182<br />
478.3<br />
671.4<br />
796.2<br />
958.2<br />
1193.9<br />
1591.6<br />
2387.7<br />
+MS, 0.5-0.6min #(11-14)<br />
500 1000 1500 2000 2500 m/z<br />
SRBA-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Cys-Arg-Met-Asp-His-Lys-Ala-OH<br />
231.3<br />
355.4<br />
478.3<br />
1+<br />
559.3<br />
617.3<br />
1+<br />
671.3<br />
822.8<br />
2+<br />
1233.8<br />
1644.7<br />
1+<br />
2467.6<br />
±MS, 0.0-1.1min #(2-23)<br />
500 1000 1500 2000 2500 m/z
10.3 MALDI-TOF-Massenspektren nach PED<br />
10.3.1 Model peptide:<br />
Intens.<br />
6000<br />
4000<br />
2000<br />
0<br />
418.5<br />
449.7<br />
485.1<br />
524.0<br />
Na - 1.1<br />
545.9<br />
563.9<br />
585.9<br />
621.9<br />
EKPed(ox) + 1.9<br />
656.9<br />
722.0<br />
757.8<br />
827.1<br />
800.0<br />
884.1<br />
Na - 1.0<br />
906.1<br />
926.1<br />
F<br />
981.1<br />
1031.2<br />
Na - 1.0<br />
G<br />
1057.2<br />
1088.2<br />
Na - 1.0<br />
P + 0.1<br />
Na - 1.0 Na - 1.0<br />
1185.3<br />
A + 0.1<br />
10 Anhang<br />
121.1<br />
1256.5<br />
G + 0.1<br />
400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z<br />
10.3.2 Hitbeads aus der Bibliothek:<br />
Intens.<br />
1500<br />
1250<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
727.3<br />
787.3 809.3<br />
832.3<br />
854.3<br />
18.0<br />
883.4<br />
903.4 925.4<br />
Z<br />
951.4 986.4<br />
1008.4<br />
1036.4<br />
18.0<br />
1054.4<br />
A Q - 0.1 P H<br />
1107.4<br />
18.0<br />
1125.4<br />
1154.4<br />
1202.4<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1235.4<br />
18.0<br />
1303.4<br />
1332.4<br />
119.0<br />
1469.5<br />
18.0<br />
1489.4<br />
Na + 1.0<br />
1313.5<br />
1598.5<br />
183
10 Anhang<br />
Intens.<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
Intens.<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
184<br />
715.3<br />
736.4<br />
758.4<br />
784.4<br />
807.4<br />
770.4 797.3<br />
829.4<br />
861.0<br />
877.0<br />
G<br />
912.4<br />
940.4<br />
958.4<br />
A<br />
983.5<br />
1011.4<br />
1029.5<br />
1054.5<br />
Q<br />
1119.4<br />
1139.4<br />
1157.5<br />
P<br />
1191.5<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
861.1<br />
877.1<br />
931.5<br />
F<br />
966.5<br />
988.5<br />
1011.6<br />
1030.5<br />
G<br />
1066.1<br />
1087.5<br />
1105.5<br />
Q<br />
1150.6<br />
1186.5<br />
1215.6<br />
1236.5<br />
1233.6<br />
1274.5<br />
P<br />
1283.6<br />
H<br />
119.0<br />
1308.5<br />
1337.5<br />
1328.6<br />
1355.5<br />
1350.7<br />
1373.5<br />
H<br />
1393.5<br />
119.0<br />
1385.7<br />
1431.7<br />
1402.7<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1449.7<br />
1486.5<br />
1531.6<br />
1526.7<br />
1562.7
Intens.<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
Intens.<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
721.6<br />
750.5 776.6<br />
807.6<br />
861.3<br />
877.3<br />
A<br />
908.6<br />
935.7<br />
954.6<br />
G<br />
983.7<br />
1011.7<br />
Q<br />
1033.7 1066.3<br />
1110.7<br />
1139.7<br />
P<br />
1207.8<br />
H<br />
119.0<br />
1236.7 1308.8<br />
1355.8<br />
1373.8<br />
1433.0<br />
10 Anhang<br />
1532.0 1559.9<br />
1504.9<br />
1592.1<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
767.7 840.8<br />
883.8<br />
901.8<br />
A<br />
925.9<br />
954.9<br />
972.9<br />
Z<br />
1031.9<br />
1107.9<br />
Q<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1236.0<br />
P<br />
1304.1<br />
1333.1<br />
1375.1<br />
H<br />
119.1<br />
1470.2<br />
1530.2<br />
1599.3<br />
185
10 Anhang<br />
Intens.<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
Intens.<br />
600<br />
400<br />
200<br />
186<br />
727.7<br />
739.6<br />
761.7<br />
819.9 842.8<br />
883.8<br />
Q + 0.1<br />
966.0<br />
994.9<br />
1012.0<br />
G<br />
1069.0<br />
Q<br />
1197.0<br />
P<br />
1265.2<br />
1294.1<br />
H + 0.1<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
808.7830.8 845.5<br />
861.4<br />
877.4<br />
910.9<br />
928.8<br />
E<br />
955.9<br />
997.8<br />
977.8<br />
1012.8<br />
1038.9<br />
F<br />
1066.91092.9<br />
1110.0<br />
1137.0<br />
1159.9<br />
Q<br />
1237.0<br />
1267.0<br />
1288.0<br />
P<br />
119.1<br />
1395.2<br />
1385.1<br />
1413.2<br />
1431.3<br />
1423.1<br />
H + 0.1<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
119.1<br />
1491.3<br />
1500.2<br />
1522.2<br />
1559.4
Intens.<br />
x104<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0.0<br />
Intens.<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
743.6<br />
734.9<br />
774.9<br />
791.0<br />
861.4<br />
831.1<br />
18.0<br />
883.7<br />
925.8<br />
E<br />
959.8<br />
994.8<br />
18.0<br />
1012.8<br />
G<br />
1030.8<br />
18.0<br />
1069.8<br />
1102.7<br />
Q<br />
1197.9<br />
18.0<br />
P<br />
1295.0<br />
1336.6<br />
H + 0.1<br />
119.1<br />
1396.0<br />
1414.1<br />
18.0<br />
1432.1<br />
10 Anhang<br />
1561.2<br />
1590.2<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
817.0<br />
861.4<br />
877.4<br />
G<br />
911.8<br />
925.8<br />
940.8<br />
958.8 982.8<br />
H<br />
1077.9<br />
1095.9<br />
Q<br />
1137.9<br />
1176.9<br />
1205.9<br />
P<br />
1274.0<br />
1303.0<br />
H + 0.1<br />
119.1<br />
1393.1<br />
1375.1<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1440.1<br />
1500.2<br />
1569.3<br />
187
10 Anhang<br />
Intens.<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
Intens.<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
188<br />
723.6<br />
724.7<br />
750.6<br />
750.8<br />
769.5 797.5<br />
767.7<br />
818.3<br />
839.3<br />
861.3<br />
877.3<br />
897.7<br />
A<br />
920.7<br />
940.7<br />
954.7<br />
972.7<br />
F<br />
1025.8<br />
1066.3<br />
1101.8<br />
1119.8<br />
Q<br />
1178.8<br />
1200.9<br />
1229.8<br />
P<br />
1267.9<br />
1297.9<br />
1326.9<br />
H<br />
119.1<br />
1399.0 1417.0<br />
22.0<br />
18.0<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
794.8<br />
821.8<br />
847.9<br />
883.8<br />
901.8<br />
A<br />
925.9<br />
954.9<br />
972.9<br />
A<br />
996.9<br />
1025.9<br />
1043.9<br />
1073.0<br />
Q<br />
1125.0<br />
1154.0<br />
1192.0<br />
P H<br />
1222.1<br />
1249.1<br />
1267.1<br />
1293.1<br />
119.1<br />
1368.1<br />
1386.2<br />
1442.0<br />
1462.0<br />
1465.2<br />
1483.2<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1541.0<br />
1546.3<br />
1572.3<br />
1595.0
Intens.<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
Intens.<br />
3000<br />
2000<br />
1000<br />
0<br />
720.9<br />
731.6<br />
748.9<br />
762.9<br />
791.0<br />
776.7 802.7<br />
817.0<br />
839.4<br />
861.4<br />
877.4<br />
G<br />
909.9<br />
940.9<br />
966.9<br />
F<br />
1011.9<br />
1038.0<br />
1088.0<br />
1120.9<br />
Q<br />
1216.0<br />
P + 0.1<br />
1254.1<br />
1284.1<br />
1329.2<br />
H<br />
119.2<br />
1410.2<br />
1448.3<br />
10 Anhang<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
883.8<br />
P H Q P + 0.1 H<br />
951.9<br />
980.9<br />
18.0<br />
998.9<br />
1099.9<br />
1117.9<br />
18.0<br />
1165.0<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1246.0<br />
18.0<br />
1314.1<br />
16.1<br />
1343.1<br />
119.1<br />
18.0<br />
1415.2<br />
18.0<br />
18.1<br />
1462.2<br />
1480.2<br />
1527.4<br />
1546.5<br />
1540.2<br />
1581.3<br />
189
10 Anhang<br />
Intens.<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Intens.<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
190<br />
736.3<br />
788.4<br />
788.4<br />
758.3<br />
883.4<br />
G<br />
921.5<br />
940.4<br />
G<br />
958.4<br />
997.4<br />
1030.5<br />
Q<br />
1048.5<br />
1125.5<br />
P<br />
1193.5<br />
1222.5<br />
1264.5<br />
H<br />
1283.6<br />
119.0<br />
1341.5<br />
1359.5<br />
1488.6 1517.6<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
825.0<br />
860.9<br />
883.4<br />
G<br />
911.3<br />
940.4<br />
958.4<br />
972.4<br />
998.4<br />
Z<br />
1017.4<br />
1043.4<br />
1093.4<br />
1111.4<br />
Q<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1221.4<br />
P<br />
1259.4<br />
1289.4<br />
1318.5<br />
1356.5<br />
H<br />
119.1<br />
1415.5<br />
1433.5<br />
1453.5<br />
1532.5<br />
1569.6
Intens.<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Intens.<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
721.2 769.1<br />
721.4<br />
760.5<br />
788.4<br />
807.2<br />
824.9<br />
838.8<br />
860.8<br />
883.2<br />
Q Z - 0.1 Q - 0.1 P H<br />
960.2<br />
1011.2<br />
1065.8<br />
1114.3<br />
1164.2<br />
1227.2<br />
1292.2<br />
1360.3<br />
1389.2<br />
1427.3<br />
119.0<br />
10 Anhang<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
823.5<br />
861.0<br />
885.4<br />
G<br />
901.3<br />
917.2<br />
940.4<br />
958.4<br />
H<br />
1027.4<br />
1077.5<br />
1095.4<br />
1119.4<br />
Q - 0.1<br />
1205.5<br />
1225.5<br />
P H<br />
1273.5<br />
1302.5<br />
1344.5<br />
119.1<br />
1399.5<br />
1439.6<br />
1498.6<br />
1526.3<br />
1567.7 1599.5<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
191
10 Anhang<br />
Intens.<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Intens.<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
192<br />
732.8<br />
747.3<br />
748.5<br />
720.5 734.5<br />
763.3<br />
788.4<br />
774.6790.6<br />
823.5<br />
861.0 883.4<br />
901.3<br />
916.3<br />
934.3<br />
E Z Q P H<br />
961.4<br />
987.4<br />
1012.4<br />
1044.4<br />
1072.4<br />
1089.4<br />
1115.4<br />
1141.4<br />
1165.4<br />
1212.5<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
832.3<br />
861.0<br />
18.0<br />
883.3<br />
901.3<br />
972.3<br />
1036.3<br />
1054.3<br />
1093.3<br />
1111.3<br />
1170.3<br />
1188.4<br />
1221.4<br />
1259.4<br />
1293.4<br />
1289.4<br />
1323.5<br />
Z G Q P H<br />
18.0<br />
1316.4<br />
1334.4<br />
119.1<br />
1406.5<br />
1415.5<br />
1432.5<br />
1433.5<br />
18.0<br />
22.0<br />
1453.5<br />
119.0<br />
1527.5<br />
1532.6 1569.6<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1604.6
Intens.<br />
6000<br />
4000<br />
2000<br />
0<br />
Intens.<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
731.4<br />
723.4<br />
750.5<br />
776.5 802.5 847.5<br />
820.5<br />
18.0<br />
883.5<br />
P A Q P H<br />
930.5<br />
980.6<br />
18.0<br />
1022.6<br />
1051.6<br />
17.0<br />
1099.6<br />
1162.7<br />
1179.7<br />
18.0<br />
17.0<br />
1247.7<br />
1276.7<br />
119.0<br />
18.0<br />
18.0<br />
1395.8<br />
1413.8<br />
10 Anhang<br />
1490.9 1526.9<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
776.5 852.5<br />
883.6<br />
A F Q P H<br />
923.6<br />
954.6<br />
1008.7<br />
1025.7<br />
1051.7<br />
1101.7<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
1229.7<br />
1297.8<br />
1326.8<br />
119.1<br />
1398.9<br />
1427.9<br />
1445.9<br />
1523.0<br />
1572.0<br />
193
10 Anhang<br />
Intens.<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Intens.<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
194<br />
731.5<br />
883.4<br />
P H Q P H<br />
980.5<br />
1117.5<br />
18.0 18.0 18.0<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z<br />
882.6<br />
916.6 961.7<br />
980.7<br />
998.7<br />
1037.7<br />
1165.7<br />
1245.6<br />
18.0<br />
1262.8<br />
1304.8<br />
1342.7<br />
P G Q P H + 0.1<br />
119.1<br />
1363.9<br />
1381.9<br />
1399.9<br />
119.1<br />
1429.0<br />
18.0<br />
1443.7<br />
18.0<br />
1461.7<br />
1479.8<br />
1477.0<br />
1514.0<br />
1585.1<br />
1559.0<br />
1602.1<br />
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
10.4 PTH-Val<br />
10.4.1 1 H-NMR-Spektren (250 MHz, CDCl3)<br />
Verbindung 81<br />
Verbindung 82<br />
10 Anhang<br />
195
10 Anhang<br />
10.4.2 IR-Spektren<br />
ATR-FTIR:<br />
O<br />
N<br />
Ph<br />
H<br />
N<br />
O<br />
FTIR (KBr-Pressling):<br />
Identisch zu: SDBS Hit-No. 4318<br />
10.4.3 GC-Massenspektren<br />
196
10 Anhang<br />
197
10 Anhang<br />
10.5 NMR-Daten ermittelt aus ROESY-, COESY-, HSQC- und TOCSY-Spektren<br />
Tabelle 1<br />
Xaa<br />
Pll<br />
198<br />
1 H- und 13 C-NMR chemische Verschiebungen [ppm] des cyclischen Peptides 10, sowie des Peptids nach Photolyse.<br />
Peptid 10<br />
tR = 9,7 min<br />
Peptid 10<br />
tR = 10.1 min<br />
Nach Photolyse<br />
Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)<br />
NH2 8,545 x 8,53 x NH2 x<br />
C α H<br />
C β H<br />
5,51 47,912 5,478 48,748 C α H<br />
1,528 22,71 1,537 23,191 C β H<br />
arom oNO2 7,683 112,335 7,649 112,779 arom oNO2 7,733 109,676<br />
arom mNO2 7,156 112,322 7,124 112,474 arom mNO2 7,235 109,45<br />
arom OMe 4,003 59,093 3,984 59,502 arom OMe 3,992 56,212<br />
kx 4,176 4,153 71,415 kx 4,172 68,436<br />
4,057 _<br />
ky 2,378 34,746 2,037 27,195 ky 2,1 24,146
Peptid 10<br />
tR = 9,7 min<br />
Peptid 10<br />
tR = 10.1 min<br />
Nach Photolyse<br />
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)<br />
Pll<br />
Gly 1<br />
Ala 2<br />
Pro 3<br />
kz 2,08 2,387 34,958 kz 2,465 31,771<br />
NH<br />
H α 2<br />
H α 3<br />
NH<br />
H α<br />
H β<br />
H α<br />
H β<br />
H δ 2<br />
H δ 3<br />
7,767 x 7,959 x NH 8,196 x<br />
3,82 44,936 3,734 H α 2 3,873 42,329<br />
3,517 x 3,654 H α 3 _<br />
7,951 x 7,921 x NH 8,12 x<br />
4,536 50,292 4,512 50,988 H α<br />
1,247 17,936 1,218 18,41 H β<br />
4,302 63,681 4,338 H α<br />
2,122 2,23 H β<br />
4,616 47,583<br />
1,33 15,462<br />
4,385 60,781<br />
2,266 29,067<br />
1,8 1,878 x<br />
3,721 50,34 3,769 50,83 H δ 2 3,807 47,532<br />
3,528 3,594 _ H δ 3 3,657 _<br />
10 Anhang<br />
199
10 Anhang<br />
Peptid 10<br />
tR = 9,7 min<br />
Peptid 10<br />
tR = 10.1 min<br />
Nach Photolyse<br />
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)<br />
Pro 3<br />
Gly 4<br />
Phe 5<br />
Gln 6<br />
200<br />
H γ<br />
NH<br />
H α 2<br />
H α 3<br />
NH<br />
H α<br />
H β<br />
H δ<br />
H ε<br />
H ζ<br />
NH<br />
H α<br />
1,893 27,41 1,994 27,957 H γ<br />
2,035 24,609<br />
8,464 x 8,449 x NH 8,429 x<br />
4,026 3,932 H α 2 3,916 42,297<br />
3,722 3,733 H α 3 3,853 _<br />
8,056 x 8,052 NH 8,01 x<br />
4,434 58,623 4,443 58,89 H α<br />
3,109 38,639 3,114 H β<br />
7,162 131,918 H δ<br />
7,072 129,844 H ε<br />
7,328 131,349 H ζ<br />
4,558 55,159<br />
3,085 36,825<br />
7,215 129,064<br />
7,31 128,613<br />
7,266 127,045<br />
8,11 x 8,035 x NH 8,205 x<br />
4,079 56,019 4,167 56,339 H α<br />
4,26 52,838
Peptid 10<br />
tR = 9,7 min<br />
Peptid 10<br />
tR = 10.1 min<br />
Nach Photolyse<br />
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)<br />
Gln 6<br />
Lys 7<br />
H β 2<br />
H β 3<br />
H γ 2<br />
H γ 3<br />
NH<br />
H α<br />
H β 2<br />
H β 3<br />
H δ<br />
H ε<br />
H γ<br />
H ζ<br />
1,893 29,561 1,93 H β 2 1,994 26,783<br />
1,754 x 1,669 _ H β 3 1,868 _<br />
2,217 2,205 34,497 H γ 2 2,422<br />
1,979 2,144 _ H γ 3 2,338 _<br />
7,984 x 8,116 x NH 8,147 x<br />
4,178 56,168 4,19 56,709 H α<br />
4,166 53,571<br />
1,83 33,038 1,819 33,455 H β 2 1,795 30,561<br />
1,741 x 1,754 _ H β 3 1,701 _<br />
1,679 29,093 1,689 29,518 H δ<br />
2,993 42,171 3,002 42,566 H ε<br />
1,419 24,853 1,433 25,278 H γ<br />
7,523 x 7,521 x H ζ<br />
1,487 28,311<br />
3,054 39,606<br />
1,345<br />
x<br />
10 Anhang<br />
201
10 Anhang<br />
202<br />
Peptid 10<br />
tR = 9,7 min<br />
Peptid 10<br />
tR = 10.1 min<br />
Nach Photolyse<br />
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)<br />
C-Terminus<br />
Boc 1,383 27,555<br />
NH2 7,102 x 7,116 x NH2 7,569 x<br />
7,452 x 7,602 x 7,042 x
10.6 SPR-Experimente<br />
Steady state affinity<br />
Response<br />
RU<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
H-cyclo[KHPQHGE]βAPPR-NH2 (92)<br />
10 Anhang<br />
0 1e-4 2e-4 3e-4 4e-4 5e-4 6e-4 7e-4 8e-4<br />
KD = 0.323 ± 0.024 mM<br />
Response<br />
RU<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
H-KHPQHGEβAPPR-NH2 (93)<br />
Concentration M<br />
0 1e-3 2e-3 3e-3 4e-3 5e-3<br />
KD = 2.76 ± 0.46 mM<br />
Concentration M<br />
203
10 Anhang<br />
Response<br />
RU<br />
300<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
-50<br />
H-cyclo[KHGHPQE]βAPPR-NH2 (94)<br />
0 1e-3 2e-3 3e-3 4e-3 5e-3 6e-3 7e-3 8e-3 9e-3<br />
KD = 8,6 ± 2,7 mM<br />
Response<br />
RU<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
H-KHGHPQEβAPPR-NH2 (95)<br />
Concentration M<br />
0 2e-3 4e-3 6e-3 8e-3 0,01<br />
KD = 1.80 ± 0.24 mM<br />
204<br />
Concentration M