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4vv max12 v maxK M[S]Abbildung 1 Verlauf der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Substratkonzentrationgemäß der Michaelis-Menten-Kinetik (1. Ordnung, nullter Ordnung)wahren v max - und damit auch des K M -Werts ist aber problematisch. Deshalb wird dielinearisierte Lineweaver-Burk-Auftragung vorgezogen, bei der die reziprokenSubstratkonzentrationen gegen die reziproken Geschwindigkeiten augetragen werden. Aus derSteigung und den Achsenabschnitten lassen sich dann v max und K M herleiten. Außerdem kannauch die Berechnung der kinetischen Parameter durch eine Anpassung der Meßdaten überComputerprogramme erfolgen. Das ist besonders in Hinblick auf mögliche Inhibitormodellenützlich.1v1v maxAbbildung 2-1K MAuftragung nach Lineweaver and Burk1[S]Abweichungen vom Michaelis-Menten-ModellBei den meisten enzymatischen Reaktionen kommt es jedoch zu Abweichungen. So könnenbeispielsweise Inhibitoren die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sogenannte kompetitiveInhibitoren konkurrieren mit dem eigentlichen Substrat um das aktive Zentrum des Enzyms.Dabei wird die Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt, da die Wahrscheinlichkeit, daß einEnzym-Substratkomplex gebildet wird, kleiner ist. Diese Inhibierung läßt sich aber durch einehohe Substratkonzentration zurückdrängen, da die Wahrscheinlichkeit der Bildung desKomplexes zunimmt, und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v max kann wieder erreichtwerden. Kompetitive Inhibitoren können auch die Substrate oder Produkte sein.Bindet ein Inhibitor nicht an dem aktiven Zentrum, sondern an einer regulatorischenEinheit eines Enzyms, kann durch eine Konformationsänderung auch die Enzymaktivitätherabgesetzt werden. Diese nicht-kompetitive Inhibierung läßt sich nicht durch eine Erhöhungder Substratkonzentration zurückdrängen. Beide Hemmtypen lassen sich leicht im
5Lineweaver-Burk-Plot erkennen. Weitere kinetische Betrachtungen und Hemmtypen(unkompetitive Hemmung, Substrat- oder Produkthemmung) sind in den Lehrbüchernausführlich beschrieben.EnzymimmobilisierungFür die technische Nutzung von Enzymen muß die Stabilität, die Abtrennbarkeit und dieWiederverwendbarkeit der Biokatalysatoren geklärt werden. Beispielsweise sind dietechnischen Enzyme zur Stärkeverzuckerung billig und unterliegen im Prozeß einerDesaktivierung. Eine Wiederverwertbarkeit ist nicht nötig. Sobald aber die Enzymkosten einentscheidener Faktor bei den Produktionskosten sind, muß eine Wiederverwertbarkeit derEnzyme in Betracht gezogen werden. Eine Wiedergewinnung der Enzyme mit den bei derHerstellung verwendeten Methoden (Chromatographie, Ultrafiltration) ist im allgemeinen zuteuer. Besser sind Methoden zur Enzymimmobilisierung, also Techniken, die das„Molekulargewicht“ der Enzyme drastisch erhöhen und sie so vom Prozeßbeginn anzurückhalten. Grob kann man zwei Klassen von Immobilisierungsmethoden unterscheiden:Die Immobilisierung durch Kupplung und die Immobilisierung durch Einschluß. BeideGruppen können wieder in Untergruppen eingeteilt werden.Immobilisierung durch Kupplung:- Adsorptive Bindung- Ionische Bindung- kovalente Bindung- Cross linkingImmobilisierung durch Einschluß- Matrixeinhüllung- MembranabtrennungKinetik immobilisierter EnzymeBei der Immobilisierung von Enzymen auf festen Trägern möchte man auf wenigTrägermaterial viel frei zugängliches Enzym immobilisieren. Das heißt, daß man einen Trägermit großer Oberfläche benötigt, also einen porösen Träger. Bei der Immobilisierung kann einTeil der Enzymaktivität durch Denaturierung (extreme Konformationsänderung) oder durchungünstiges Fixieren am Träger (katalytisches Zentrum ist nicht mehr frei zugänglich)verloren gehen. Dies kann man durch eine Bilanzierung der Proteinkonzentration und derEnzymaktivität feststellen. Bekannt ist die eingesetzte Enzymmenge in Aktivitätseinheitenund deren Konzentration. Anschließend wird im Überstand und im ersten Waschpuffer dieRestaktivität und Proteinkonzentration bestimmt. So läßt sich einfach bestimmen, wievielProtein auf dem Träger gebunden wurde. Ist die Menge des aktiven Enzyms auf dem Trägerauch einer Aktivitätsmessung mit dem Immobilisat zugänglich, kann man berechnen, wievieldes gebundenen Proteins aktives bzw. inaktives Enzym ist.Wichtig ist aber auch, daß durch die porösen Träger zwar eine große Oberfläche vorhanden,diese jedoch unterschiedlich gut zugänglich ist. Diese Tatsache ist aus der allgemeinen
Seite 1 und 2: 1EnzymkinetikIn diesem Kapitel wird
Seite 3: 3Es lassen sich zwei Grenzfälle be
Seite 7 und 8: 71vDiffusionshemmung1v maxohne Hemm
Seite 9 und 10: 9H 2 O+(D, L)-RCOOHEnzymL-Aminosäu
Seite 12 und 13: 12Technische AnwendungenStärkeverz

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