Nachhaltige Biokatalyse - ATB

9. Jahrgang | ISSN 1435-5272 | A 49017
BioTechnologie Nachrichten-Magazin
Sonderheft
Nachhaltige Biokatalyse
2003
Herausgegeben von Dr. Stefanie Heiden und Dr. Rainer Erb, Deutsche Bundesstiftung Umwelt – www.dbu.de

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Fax-Antwort Nr.: (0541) 9633-190
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Zu welcher Zielgruppe würden Sie sich zählen? (bitte ankreuzen)
Wirtschaft/Unternehmen Forschung/Hochschule
− Mitarbeiterzahl Bildungseinrichtung
− Branche Umweltverband
privat
Politik/Verwaltung
sonstige
Ich möchte mit Ihnen in Kontakt bleiben und habe Interesse an weiteren
Informationen über die Deutsche Bundesstiftung Umwelt:
Förderleitlinien/Informationen zur Antragstellung
aktueller Jahresbericht Jahresbericht (regelmäßiger Bezug)
Kurzinfo zur Deutschen Bundesstiftung Umwelt
aktuelle CD-ROM der DBU
Broschüre „Landwirtschaft und Umwelt“
Broschüre „Naturschutz“
Broschüre „Innovationen“
Info-Mappe „Produktionsintegrierter Umweltschutz“
„Integrierte Biotechnologie - Sensorik“
„Integrierte Biotechnologie - Biokatalyse
„Nachhaltige Chemie“
„Regenerative Energien“
Publikationsliste der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

Industrielle Biokatalyse – nachhaltig gestaltet ............ 4
Dr. Stefanie Heiden und Dr. Rainer Erb
Verbund Biokatalyse und InnovationsCentrum ............ 6
Biokatalyse - Biokatalysatoren im Dienste eines
integrierten Umweltschutzes
Dr. Ralf Grote und Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian
Biotechnologische Innovationen in der ...................... 12
Aminosäure-Darstellung
Dr. Petra Peters-Wendisch, Carsten Protsch, Henning
Serger, Prof. Dr. Hermann Sahm, Dr. Robert Faurie, Priv.-
Doz. Dr. Roland Ulber
Neue Wege zur Bioproduktion pharmazeutischer ...... 16
Wirkstoffe mit Corynebacterium glutamicum
Dr. Petra Peters-Wendisch, Dr. Lothar Eggeling, Dr. Birgit
Klaßen, Dr. Robert Faurie und Prof. Dr. Hermann Sahm
Umweltfreundliche Aufbereitung von ........................ 17
Hühnerfedern mittels extremthermophiler Bakterien
und thermostabilen Enzymen
Dipl.-Biotechnol. Julia Brodersen, Dr. Sabine Rießen,
Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian, Prof. Dr. Herbert
Märkl
Aerobe thermophile Reinigung fetthaltiger ................ 20
Abwässer der Lebensmittelindustrie mit Bacillus
thermoleovorans
Dipl.-Biol. Matthias Krüger, Dipl.-Ing. Ingo Reimann,
Prof. Dr.-Ing. Herbert Märkl, Dr. Jörg Taube, Dipl.-Ing.
Wolfgang Eckert
Kühlschmierstoffe aus technischen tierischen .......... 24
Fetten und Altspeisefetten – Herstellung, Technologie
und Ökobilanzierung
Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c. Jürgen Hesselbach, Dr.-Ing.
Christoph Herrmann, Dr.-Ing. Ralf Bock, Dipl.-Geoökol.
Tina Dettmer, Dr. rer. nat. Gerd Kley, Dr. rer. nat. Rudolf
Brenneis, Prof. Dr.-Ing. Roland Meyer-Pittroff, Dipl.-Ing.
Oliver Falk, Dipl.-Geoökol. Anja Hansen
4
17
Entwicklung eines biotechnologischen ..................... 28
Verfahrens zur stofflichen Wiederverwertung
kautschukhaltiger Rest- und Abfallstoffe
Dipl.-Biol. Matthias Arenskötter, Dipl.-Biol. Dirk
Baumeister, Dipl.-Biol. Daniel Bröker, Dr. Udo Hölker,
M.Sc. Ebaid M. A. Ibrahim, Dr. Jürgen Lenz, Dipl.-Biol.
Karsten Rose, und Prof. Dr. Alexander Steinbüchel
Umweltgerechte biotechnologische Herstellung ........ 33
von biokompatiblen Polymerwerkstoffen für die
Medizintechnik
Dr. Frank Thunecke, Dr. Karin-Dagmar Wendlandt, Dr.
Roland A. Müller, Dipl.-Chem. Gabriele Mirschel, Dipl.-
Ing. Carmen Kunze, Dipl.-Ing. Hans-Frieder Listewnik
Überwachung der Immunsuppressions-Therapie ...... 37
nach Organtransplantation mit Hilfe einer wirkungsbezogenen
Analysenmethode
Dr. Bernfried Specht, Dr. Manfred Fobker, Dr. Beate
Vollenbröker, Dr. Michael Erren, Dr. Ulrich Müller, Dipl.-
Ing. Jan Hendrik Koch, PD Dr. Helge Hohage, Prof. Dr.
Friedrich Spener und Dr. Norbert Bartetzko
Chemoenzymatische Synthese ................................. 40
von Oligosacchariden und glykosylierten Naturstoffen
Dr. Jürgen Seibel, Prof. Dr. Klaus Buchholz
Hefezellen als Bioindikatoren zur schnellen .............. 42
Identifizierung hochselektiver umweltfreundlicher
Wirkstoffe
Prof. Dr. K.-D. Entian, Dr. Dietmar Eschrich, Dr. Jürgen
Recktenwald, Dr. Thomas Gassenmeier, Dr. Andrea
Sättler, Dr. Jörg Hauf, Dr. Joachim Klein, Dr. Martina
Rimmele
Wirkstoffe aus extremophilen Mikroorganismen ....... 43
Dr. Guido Meurer, Dr. Stephanie Grond, HD Dr. Arnulf
Kletzin, Dr. Ralf Grote und Prof. Dr. Garabed Antranikian
Genetische Optimierung der Bäckerhefe ................... 47
zur Produktion von L-Glycerol-3-Phosphat
Huyen Thi Thanh Nguyen M.S., Almut Dieterich, Prof. Dr.
Ulf Stahl, Dr. Elke Nevoigt
Sonderband | 2003 | INHALT
1
24
33
Umweltverträgliche Synthese chiraler ....................... 50
2-Oxazolidinone
Dr. Martin Bertau, Dr. Thomas Daußmann
Phospholipasen in der Biokatalyse ........................... 51
Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann
Extremophile Amidasen für die enantioselektive ....... 54
Synthese von Amino- und Carbonsäuren
Dipl.-Biol. Ksenia Egorova, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed
Antranikian, Dr. Stefan Buchholz, Dr. Stefan Verseck,
Dr. Harald Trauthwein, Dr. Shukrallah Na’amnieh
Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung .................... 55
Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz, Dipl.-Biotech. Robert
Puskeiler, Dr.-Ing. Klaus Kaufmann, Dr. Gernot John, Dr.-
Ing. Matthias Arnold
Mikrotiterplatten-Reaktoren mit integrierten ............. 59
pH-Sensoren und Autodisplay in E. coli zur evolutiven
Enzymentwicklung
Prof. Dr. Elmar Heinzle, staatl. gepr. LMChem. Svenja
Weiß, Prof. Dr. Otto Wolfbeis, Dipl. Chem. Sarina Arain,
Prof. Dr. Ingo Klimant, Dr. Gernot John, Dr. Christian
Krause, Dr. Thomas Räbiger, Günther Müller, Dr. Harald
Waltenberger, Dr. Joachim Jose, Dipl.-Biol. Eva
Schultheiss
Entwicklung einer innovativen DNA-Chip- ................ 63
Technologie zur industriellen Herstellung rekombinanter
Proteine und zur Identifizierung von Mikroorganismen
Dipl.-Biol. Daniel G. Weber, Dipl.-Phys. T. Injinaash, Dr.
Tino Polen, Dipl.-Ing. K. Dembowski, Dipl.-Biol. Andrea
Veit, Dipl.-Phys. U.Lehmann, Dr. Kerstin Sahm, Dr.
Volker F. Wendisch, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed
Antranikian, Prof. Dr.-Ing Jörg Müller, Prof. Dr. Hermann
Sahm
Entwicklung von innovativen Mikrotiterplatten- ........ 66
reaktoren zur Bewertung des Abbaus und der Toxizität
neuer Wirkstoffe auf Basis von Mikrosomen und
Säugerzellen
Prof. Dr. Elmar Heinzle, M.Technol. Rahul Ravi
Deshpande, Dr. Udo Bock, Dr. Gernot John, Dr. Christian
Krause, Dr. Günther Müller, Dr. Harald Waltenberger,
Dr. Ruth Maas
43
63

Information & Communication for Biotechnology
MAGAZINES | BOOKS | DATABASES | MEDIA SERVICES | CONSULTING
www.biocom.de
Foto: Bayer AG
S I N C E 1 9 8 6
BIOCOM AG

Primärscreening von Mikroorganismen unter ........... 67
Fed-Batch Bedingungen
Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs, Priv. Doz. Dr. rer. nat. Doris
Klee, Dr.-Ing. Tibor Anderlei
Plant Made Pharmaceuticals (PMP) – Die Pflanze ..... 69
als Bioreaktor
PD Dr. rer. nat. Michael Kleine
Innovative Nachweisverfahren .................................. 73
für Mykotoxine
Dr. Bernhard Reck, Dr. Richard Dietrich, Dr. Christine
Bürk, Björn Lauer, Dr. Thomas Reinard
Dr. Bernhard Reck, Dr. Richard Dietrich, Dr. Christine
Bürk, Björn Lauer, Dr. Thomas Reinard
Biokatalytische Synthese enantiomerenreiner .......... 78
Building Blocks
Dr. Markus Kähler, Dr. André Rieks, Dr. Ulrike Kirchner,
Kerstin Wiggenhorn, Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer,
Marlen Schmidt, Angelika Eisner, Dr. Wolfgang Petersen,
Frauke Ellerbrock, Stefan Bollow
Esterasen und Lipasen aus kultivierten und nicht- .... 81
kultivierten Mikroorganismen
Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Dr. Anna Musidlowska-
Persson, Dominique Böttcher, Dr. Klaus Liebeton, Dr.
Patrick Lorenz, Dr. Jürgen Eck, Dr. Holger Zinke, Dr.
Christa Schleper, Prof. Dr. Peter Langer, Dr. Harald
Trauthwein, Dr. Andreas Karau, Dr. Stefan Buchholz
73
81
88
Produktion der Phytase von Escherichia coli ............. 85
Dr. Gerhard Miksch, Dr. Sophia Kleist, Dr. Bernd
Hitzmann, Dr. Michael Arndt, Dr. Karl Friehs, Dr. Arno
Cordes, Prof. Dr. Erwin Flaschel
Herstellung bakterieller Oxidasen zur Synthese ........ 88
chiraler Feinchemikalien
Dr. Birgit Geueke, Priv.-Doz. Werner Hummel, Dipl.-Ing.
Ingo Knabben, Dr. Simon Curvers, Dr. Tibor Anderlei
Das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca ........ 90
gottschalkii als Quelle stabiler Enzyme zur Herstellung
hochwertiger Kohlenhydrate
Volker Thiemann, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian,
Dr. Hans-Peter Klenk, Angela Vollstedt, Prof. Dr. Roland
Freudl, Catharina Jürgens, Prof. Dr. Reinhard Sterner,
Prof. Dr. Wolfgang Liebl
Einsatz effizienter Expressionssysteme und .............. 94
Membranverfahren: Produktion von Biokatalysatoren
aus extremophilen Mikroorganismen
Dr. Karen Sonnenberger, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed
Antranikian, Prof. Dr. Roland Freudl, Prof. Dr. Horst
Chmiel, Dr. Ralph Nonninger, Dr. Thomas Schäfer
Pyruvat-Produktion aus Glucose mit ......................... 96
rekombinanten Escherichia coli-Stämmen
Dr. Ralf Takors, Dipl.-Ing. Bruno Zelié, Dr. Tanja Gerharz,
Prof. Dr. Michael Bott
110
Entwicklung biotechnologischer Verfahren zur ........ 100
mikrobiellen Reduktion von Ketoverbindungen
Andrea Weckbecker, PD Dr. Werner Hummel, Maya
Amidjojo, Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz, Michel Brik
Ternbach, Dr. Ralf Takors, PD Dr. Michael Müller, Prof.
Dr. Ch. Wandrey
Enzymatische Gasphasenkatalyse zur Produktion ... 105
chiraler Substanzen
Dipl.-Chem. Clara Ferloni, Dipl.-Ing. Matthias
Heinemann, Dr. Thomas Daußmann, Prof. Dr.-Ing.
Jochen Büchs
Sonderband | 2003 | INHALT
3
94
Modulares membranadsorbertechnologisches ........ 109
Baukastensystem zum integrierten Downstream
Processing von Pharmatargets
Dr. Sascha Beutel, Dr. Alexander Loa, Dr. Oskar-Werner
Reif, Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber, Prof. Dr. Thomas
Scheper
119
Prozessintegrierte rekombinante Biokatalyse für .... 110
hochselektive Oxyfunktionalisierung von Kohlenwasserstoffen
Dr. Andreas Schmid, Dr. Bruno Bühler, Dr. Bernd Bauer,
Prof. Dr. Horst Chmiel, Dr. Bernhard Hauer, Dr. Tilo
Habicher, Dr. Rudolf Krumbholz
Magnettechnologie in der Bioproduktaufreinigung .... 112
Dr.-Ing. habil. Matthias Franzreb, Dipl.-Ing. Niklas Ebner,
Dr. rer. nat. Martin Siemann-Herzberg
Oxidative Enzyme in der Textilindustrie ................... 115
Dr. Eva Schuh, Dr. Elisabeth Heine, Dipl.-Chem. Nabil
Daâloul, Prof. Dr. Hartwig Höcker, Dipl.-Ing. Rudi Breier,
Dr. Anke Mondschein, Dr. Anke Apitz, Prof. Dr. Karl-
Heinz van Pée, Dr. Katrin Scheibner
Ökoeffizienz-Bewertung in der Prozessentwicklung .. 118
Arno Biwer, Pascal Zuber, Prof. Dr. Klaus Bellmann,
Dr. Dieter Sell, Peter Gebhart, Prof. Dr. Elmar Heinzle
Praxisnahe Implementierung biotechnologischer .... 122
Verfahren in mittelständischen Textilbetrieben
Peter Gebhart, Dr. Dieter Sell
122
Umweltorientierte Bewertung von Produktions- ...... 125
prozessen am Beispiel der Verbundinitiative BIOL
Dipl.-Ing. René Gildemeister, Dr. Cornelia Haase, Dr.
Horst Moormann, Dr. Jens Wohlers, Prof. Dr. Norbert
Räbiger
Impressum ............................................................. 111

4 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
EDITORIAL
Industrielle Biokatalyse –
nachhaltig gestaltet
� Dr. Stefanie Heiden1 und Dr. Rainer Erb2 1 2 Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU), Osnabrück, Zentrum für Umweltkommunikation der Deutschen Bundesstiftung Umwelt gGmbH, Osnabrück
Die Deutsche Bundesstiftung Umwelt
DBU blickt im Jahr 2003 auf eine 12jährige
Fördertätigkeit zurück, in der
sie bereits mehr als 5.500 Projekte
unterstützte. Die DBU wurde im Jahr
1990 auf Initiative des Bundesfinanzministers
a.D. Dr. Theo Waigel und
des Bundesbankpräsidenten a.D.
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hans Tietmeyer
per Gesetz durch den Deutschen
Bundestag errichtet. Als Organisationsform
wurde eine private Stiftung
bürgerlichen Rechts gewählt, die ein
hohes Maß an Selbstständigkeit und
Flexibilität gewährleistet. Die DBU hat
sich dem Leitbild der „Nachhaltigen
Entwicklung“ (Sustainable development)
verpflichtet, dem auch das Finanzkonzept
der Stiftung folgt: Von
den Erträgen leben, ohne das Kapital
zu verzehren. Von dem ursprünglich
aus der Privatisierung des Salzgitter-
Konzerns zur Verfügung gestellten
Stiftungskapital in Höhe von rund
1,28 Milliarden Euro hat die DBU
immer einen Teil zur Bildung von
Rücklagen verwendet. Heute beläuft
sich das Stiftungskapital auf rund 1,6
Milliarden Euro, wurde also nominal
erhöht; inflationsbereinigt ist das Stiftungskapital
in dieser Zeit in etwa
konstant geblieben. Gleichzeitig
konnten mehr als 1 Milliarde Euro
für innovative Umweltschutzprojekte
bereitgestellt werden.
Innovation mit Anspruch –
Die Förderphilosophie der
DBU
Die Stiftung fördert Vorhaben der angewandten
Umweltforschung, der
Umwelttechnik, der Umweltbildung
sowie Projekte zur Bewahrung und
Wiederherstellung des nationalen Natur-
und Kulturerbes. Entscheidendes
Förderkriterium ist der konkrete Beitrag
eines Vorhabens zur nachhaltigen
Umweltentlastung und Ressourcenschonung.
Die Projekte sollen
über die Erfüllung gesetzlicher
Pflichtaufgaben hinausgehen und sich
deutlich vom gegenwärtigen Stand
des Wissens und der Technik abheben.
Ihre praktische Umsetzbarkeit
gewährleistet eine möglichst weite
Verbreitung. Dabei steht die besondere
Förderung kleiner und mittlerer
Unternehmen, die bei der Umsetzung
innovativer Ideen unterstützt
werden sollen, im Vordergrund. Mit
ihrer Fördertätigkeit will die DBU
wortwörtlich „anstiften“, neue und
teilweise risikoreiche Wege zu gehen.
Wenn sich die DBU nach einer maximal
förderfähigen Laufzeit von drei
Jahren zurückzieht, sollen die unter-
stützten Projekte idealerweise zu einem
„Selbstläufer“ geworden sein.
Der Erfolg geförderter Projektideen
muss regelmäßig analysiert und
bewertet werden, weshalb eine Evaluation
von Projekten integraler Bestandteil
der Stiftungsarbeit ist. Die
DBU wird auch weiterhin konsequent
auf vorsorgenden produkt- und prozessintegrierten
Umweltschutz sowie
die Innovationskraft kleiner und mittlerer
Unternehmen setzen. Durch die
Ausschreibung von Förderschwerpunkten
werden aktiv aktuelle Themen
aufgegriffen und neue Ansatzpunkte
im Umweltschutz entwickelt.
Hierfür geben die Förderleitlinien den
Rahmen, der dynamisch den wissenschaftlichen
und technischen Anfor-
derungen angepasst wird. Umweltschutz
war und ist niemals eine statische
Angelegenheit; die DBU wird
daher auf Flexibilität unter Einbindung
von Bewährtem setzen.
Integrierte Biotechnologie
– Ein Schwerpunkt der
DBU
Mit dem Förderschwerpunkt „Integrierte
Biotechnologie“ wurde ein
besonderer Akzent gesetzt. Dieses
Thema bietet wichtige Möglichkeiten
für ein nachhaltiges Wirtschaften und
wird somit auch in Zukunft einen
Schwerpunkt der Fördertätigkeit der
DBU darstellen. Bislang geförderte
Projekte zeichnen sich dadurch aus,
dass es sich um Kooperationsvorhaben
zwischen wissenschaftlichen Einrichtungen
und Industrieunternehmen
der mittelständischen Wirtschaft
handelt.
Die Projektförderung im Bereich
Biotechnologie wird durch eine Reihe
von Informationsmaßnahmen in
Form eigener Veranstaltungen, wie
den Osnabrücker Umweltgesprächen
(z. B.: „Nachhaltige Biokatalyse“ am
09.12.2002) oder geförderter internationaler
Tagungen, wie beispielhaft
„Extremophiles 2000“, „BioTrans
2001“, „Biocat 2002“, „Metageno-
mics 2003“, „Biofilms - Prevention
of Microbial Adhesion 2004“ oder
„Biocat 2004“, sowie einer Vielzahl
von Publikationen und Vorträgen bei
Fachkongressen begleitet. Hierbei
wird stets auch der Aspekt des Umweltkostenmanagements
betont: Das
Erreichen ökologischer Ziele ist vielfach
eng an ökonomische Ziele gekoppelt.
Durch Einsatz vorsorgender
und professionell integrativ umgesetzter
Umweltschutzmaßnahmen wird
anhand zahlreicher Beispiele deutlich,
dass Ökologie und Ökonomie
sehr wohl Hand in Hand gehen. Dieser
Ansatz der DBU zieht sich als roter
Faden nicht nur durch die Aktivitäten
im Bereich Biotechnologie, sondern
durch die gesamte Fördertätigkeit.
Bei Förderung interdisziplinärer
Verbundvorhaben im Rahmen des
vornehmlich auf den produkt- und
produktionsintegrierten Einsatz biotechnologischer
Verfahren und Produkte
ausgerichteten Förderschwerpunkts
„Integrierte Biotechnologie“
werden vor allem umweltrelevante
Problemlösungen und Entwicklungen
im Rahmen von Verbundvorhaben
unterstützt. Diese sollen vornehmlich
in interdisziplinärer (natur-, ingenieur-
und wirtschaftswissenschaftlicher)
und institutionsübergreifender
Kooperation (zwischen mittelständischen
Unternehmen und Hochschulen/Forschungseinrichtungen
oder
zwischen verschiedenen Unternehmen)
verfolgt werden. Durch diese
Kompetenzbündelung verspricht sich
die DBU, ihre Zielvorstellungen von
„nachhaltig betriebener Biotechnologie“
ein maßgebliches Stück voranzubringen.
Nachhaltige Biokatalyse
Beispiele für derartige Kompetenzbündelungen
sind der im Jahr 2000
etablierte Forschungsverbund „Industrielle
Nutzung von Biokatalysatoren“
(www.biokatalyse.de) sowie die

im Jahr 2002 durch die Stiftung ins
Leben gerufene Initiative „InnovationsCentrum
Biokatalyse ICBio –
Eine Initiative der DBU zur Förderung
der Nachhaltigen Biokatalyse“
(www.icbio.de). Für den Verbund
Biokatalyse (Laufzeit Mai 2000 – Dezember
2003) wurden für 11 Projekte
bei Gesamtkosten von rund 10,1
Millionen Euro Fördermittel in Höhe
von rund 5,8 Millionen Euro zur Verfügung
gestellt. Im Rahmen der Initiative
ICBio, die weiterhin offen ist
für neue Projektanträge, werden derzeit
19 Vorhaben mit einer Gesamtfördersumme
von 6,2 Millionen Euro
bei Gesamtkosten in Höhe von 14,3
Millionen Euro durch die DBU unterstützt.
Die Koordination der im Rahmen
beider Initiativen geförderten
Vorhaben liegt bei Prof. Garabed Antranikian,
Technische Universität
Hamburg-Harburg.
Biotechnologischen Innovationen
kommt, wie auch in der Agenda 21
detailliert ausgeführt, eine besondere
Bedeutung bei der Realisierung ökonomisch
rentabler und ökologisch
vorteilhafter Produktionsverfahren zu:
Ressourcen werden geschont, Umweltbelastungen
a priori vermieden
oder verringert und unternehmerische
Risiken minimiert. Dies gilt insbesondere
für zahlreiche Beispiele des
Einsatzes von Biokatalysatoren, die
maßgeblich dazu beitragen können,
eine Umweltentlastung im Sinn eines
produkt- bzw. produktionsintegrierten
Umweltschutzes zu erreichen. Für nahezu
jede chemische Stoffumwandlung
lässt sich ein geeignetes Enzym
finden, das potenziell in der Lage ist,
einen klassischen chemisch-physikalischen
Prozess durch ein biochemisches
bzw. biotechnologisches Verfahren
zu ersetzen bzw. zu optimieren.
Enzyme gehören somit zu den wichtigsten
Werkzeugen der Biotechnolo-
gie, deren produktionsintegrierter
Einsatz vielfach zu einer besseren Ausnutzung
von Rohstoffen, einer Verringerung
von Schadstoffimissionen und
einer Herabsetzung des Energieverbrauchs
bei gleichzeitig verbesserter
Produktqualität und -reinheit führt. Einem
verbreiteten Einsatz von Enzymen
in chemischen Synthesen stehen jedoch
häufig inhärente Nachteile von
Biokatalysatoren entgegen: So ist eine
hohe katalytische Aktivität konventioneller
Enzyme häufig nur innerhalb
enger Temperatur- und pH-Wert-Grenzen
gegeben; Enzyme sind in der Regel
nur in wässrigen Medien aktiv und
besitzen ein begrenztes Substratspektrum,
wobei die Enantioselektivität für
unnatürliche synthetische Substrate
gering ist. Darüber hinaus ist auch die
Stabilität und Aktivität konventioneller
Enzyme für eine wirtschaftliche
Nutzung häufig nicht ausreichend.
Daher ist das Auffinden außergewöhnlicher
Enzymaktivitäten, die Optimierung
industriell relevanter Eigenschaften
sowie die Entwicklung effizienter
Produktionsverfahren für Enzyme im
Sinn einer nachhaltigen Entwicklung
Forschungsgegenstand der o. g. Initiativen.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
5
Die übergeordneten Ziele der geförderten
Vorhaben liegen in der
– Entwicklung innovativer umweltfreundlicher
Produktionsverfahren
für die Herstellung neuartiger Wirkund
Wertstoffe auf Basis biotechnologischer
Innovationen;
– Entwicklung und Optimierung umweltfreundlicher
biotechnologischer
Verfahren zur Substitution konventioneller
industrieller Produktionsverfahren
(z. B. für die Herstellung von
Grund- und Feinchemikalien, von
Biokatalysatoren sowie von Monound
Polymeren);
– Effizienzsteigerung bestehender
Produktionsprozesse durch Neukombination
mit biotechnologischen Verfahren/Produkten.
Berücksichtigung finden hierbei
sowohl neue Ansätze aus dem Bereich
Dr. Stefanie Heiden
Bereichsleiterin Biotechnologie
Deutsche Bundesstiftung Umwelt
An der Bornau 2
D-49090 Osnabrück
Tel.: 0541-9633 321
Fax: 0541-9633 193
eMail: s.heiden@dbu.de
der Bio-/Verfahrenstechnik (Modellierung,
Downstream-Processing,
Sensorik) als auch innovative Produktionssysteme
(Ganzzellsysteme,
isolierte Biokatalysatoren) sowie moderne
molekularbiologische und chemische
Ansätze (Expressionssysteme,
evolutives Biokatalysatoren-Design,
Stoffwechselflux-Analysen). Für ausgesuchte
Vorhaben ist jeweils eine
Ökoeffizienzanalyse vorgesehen, welche
die Summe aller Stoff- und Energieströme
sowie die mit einer Produktionsumstellung/-etablierungverbundenen
Kosten berücksichtigt.
In der vorliegenden Publikation
sind die verschiedenen Forschungsund
Entwicklungsvorhaben der Partner
der o. g. Initiativen dargestellt.
Die in diesem Band zusammengefassten
Beiträge renommierter Wissenschaftler
aus dem Bereich Biokatalyse/Biotechnologie
sollen nicht nur als
Bestandsaufnahme der geförderten
Projekte, sondern vielmehr als Ausblick
in die Zukunft verstanden werden:
Erfolgreiche Konzepte werden
weiterentwickelt, weniger Erfolgreiches
angepasst, neue Ansatzpunke
aufgenommen und konsequent weiterverfolgt.
Die hier zusammengefassten
Beiträge, bei deren Lektüre wir
Ihnen viel Freude wünschen, bieten
hierfür eine viel versprechende
Grundlage.
Osnabrück, im August 2003
Dr. Rainer Erb
Projektleiter Biotechnologie
Zentrum für Umweltkommunikation
der Deutschen Bundesstiftung
Umwelt gGmbH
An der Bornau 2
D-49090 Osnabrück
Tel.: 0541-9633 950
Fax: 0541-9633 990
eMail: r.erb@dbu.de

6 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
BIOKATALYSE
Verbund Biokatalyse und
InnovationsCentrum Biokatalyse -
Biokatalysatoren im Dienste eines
integrierten Umweltschutzes
� Dr. Ralf Grote und Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian, Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg, Hamburg
Keywords: Verbund Biokatalyse, InnovationsCentrum Biokatalyse, ICBio, DBU.
Mit den Netzwerkprojekten „Verbund
Biokatalyse“ und „InnovationsCentrum
Biokatalyse“ hat die Deutsche
Bundesstiftung Umwelt (DBU) zwei
wegweisende Förderprogramme initiiert,
die deutschlandweit eine Vorreiterrolle
bei der Erforschung und beim
Einsatz biokatalytischer Verfahren im
Sinne eines produkt- bzw. produktionsintegrierten
Umweltschutzes eingenommen
haben. Der Verbund Biokatalyse
(Laufzeit: Mai 2000 bis Dezember
2003) hat mit insgesamt elf
Projekten das Potenzial enzymatischer
Verfahren zur umweltverträglichen
Produktion von Feinchemikalien,
Wirkstoffen und Textilien eindrucksvoll
unter Beweis gestellt.
Rund 4,8 Mio. Euro (bei Gesamtkosten
von rund 10,1 Mio. Euro) investierte
die DBU in diesen Verbund, der
von Professor Garabed Antranikian
(Technische Universität Hamburg-
Harburg) federführend koordiniert
wird. Kernpunkt dieses Bündnisses
für Biokatalyse ist die enge Zusammenarbeit
von Partnern aus Hochschulen
sowie kleinen und mittelständischen
Unternehmen. Integraler Bestandteil
des zukunftweisenden Verbundes
ist die ökologische und ökonomische
Evaluation biokatalytischer
Prozesse. Denn nur wo umweltfreundliche
Verfahren auch wirtschaftlich
sinnvoll sind, kann eine
nachhaltige Entwicklung voranschreiten.
Die positiven Erfahrungen aus dem
Verbund Biokatalyse und die Erkenntnis,
dass Synergien und Kommunikation
eine herausragende Rolle bei der
Weiterentwicklung der Biokatalyse in
Deutschland spielen, haben die DBU
im Juli 2002 darin bestärkt, die Initiative
„InnovationsCentrum Biokatalyse
– Eine Initiative der DBU zur Förderung
der Nachhaltigen Biokatalyse“
- kurz: ICBio - ins Leben zu rufen.
ICBio ist im Gegensatz zum Verbund
Biokatalyse ein offenes Forschungskonsortium
unter dessen Dach DBUgeförderte
Projekte mit biokatalytischer
Ausrichtung gebündelt werden.
Zurzeit gehören ICBio 19 Projekte
mit einer Gesamtfördersumme von
rund 6,2 Mio. Euro an (bei Gesamtkosten
von bisher rund 14,3 Mio.
Euro ). Schwerpunkte von ICBio, das
ebenfalls von Professor Antranikian
koordiniert wird, bilden die strategisch
wichtigen Forschungsfelder
Screeningsysteme, Expression und
Downstream-Processing/Produktaufbereitung
mit dem Ziel der Gewinnung
von Wirk- und Wertstoffen.
Langfristig soll ICBio zu einer festen
Institution werden und als zentrale
Einrichtung den horizontalen und
vertikalen Wissenstransfer sowie die
Vernetzung zwischen Industrie und
Hochschule fördern.
Tab. 1: Überblick über wichtige industrielle Biokatalyseverfahren nach
Syldatk et al. [4].
Maßstab und Enzym Produkt Firma
>1.000.000 t/a:
Glucoseisomerase Isosirup (Gluc/Fruct) Verschiedene
>10.000 t/a:
Nitrilhydratase Lipase Acrylamid Nitto, DSM
(Mucor mihei) Kakaobutter Fuji Oil Co., Unilever
>1.000 t/a:
Penicillinamidase 6-APA Verschiedene
Aspartase L-Asp Tanabe
Thermolysin Aspartam Tosoh, DSM
Hydantoinase/Carbamoylase D-Phg Verschiedene
Hydantoinase D-Phg Verschiedene
Aldonolactonase D-Pantothensäure Fuji Chem. Ind.
Lipase (S)-Methoxyisopropylamin BASF
>100 t/a:
Fumarase L-Malat Tanabe
Aminoacylase L-Met, L-Val, L-Phe Degussa, Tanabe
β-Tyrosinase L-DOPA Ajinomoto
Lipase (Pseudomonas sp.) (S)-Acylthioisobutyrat DSM, Tanabe
Nitrilase (R)-Mandelsäure BASF
Lipase Optisch aktive Amine BASF
Lipase Optisch aktive Alkohole BASF
>10 t/a:
Lipase (R)-Glycidylbutyrat DSM
Dehydratase L-Carnitin Lonza
Biotechnologie - Eine
moderne
Querschnittstechnologie
Die Biotechnologie gilt neben der
Informations- und der Siliziumtechnologietechnologie
als die dritte Megatechnologie
des 21. Jahrhunderts. Das
hohe Problemlösungspotenzial dieser
Zukunftstechnologie liegt darin begründet,
dass es sich um eine wirklich
integrative Technologie handelt,
die das Know-how von Biologen, Chemikern,
Medizinern, Ingenieuren und
Informatikern synergistisch bündelt
und zusätzlich Erkenntnisse aus den
Bereichen Ökonomie und Soziologie
integriert. Es ist unstrittig, dass die
Biotechnologie als interdisziplinäre
und innovationsträchtige Querschnittswissenschaft
alle Voraussetzungen erfüllt,
um neue umweltschonende Prozesse
und Produkte im Bereich Life
Sciences zu erschließen [1]. Mit Hilfe
der modernen Biotechnologie können
nicht nur Optimierungen an bestehenden
Verfahren vorgenommen
werden, sondern auch völlig neuartige
Prozesse und Produkte entwickelt
werden. Einen zunehmend wichtigen
Beitrag leisten hierbei Verfahren unter
Einsatz von Biokatalysatoren.
Biokatalysatoren - Enzyme
und Ganzzellsysteme
Der Biokatalyse kommt eine bedeutende
Rolle zu, wenn es darum geht,
nachhaltige Prozesse unter Verwendung
erneuerbarer Ressourcen zu
verwirklichen. Oft werden Biokatalysatoren
dabei mit Enzymen gleichgesetzt.
Diese Definition ist aber häufig

zu kurz gefasst, denn auch Ganzzellsysteme
können mit ihrer Vielzahl an
zelleigenen Enzymen für biokatalytische
Prozesse, wie beispielsweise Co-
Faktor abhängige Reaktionen oder die
fermentative Herstellung von Feinchemikalien,
die ökonomisch sinnvollste
Alternative darstellen (Stichwort Zellfabrik).
Die natürliche Funktion von
Enzymen ist es, Stoffwechselreaktionen
zu ermöglichen, die unter physiologischen
Bedingungen ohne Hilfe von
Biokatalysatoren nicht oder nur sehr
langsam ablaufen würden. Enzyme
sind entsprechend ihrer physiologischen
Funktion den klassischen Katalysatoren
oft überlegen, da ihre hohe
Spezifität beispielsweise dafür sorgt,
dass katalysierte Reaktionen enantioselektiv
ablaufen und zu hochreinen
Produkten führen [2, 3].
Aufgrund ihrer Summe an positiven
Eigenschaften wie Spezifität, Selektivität
und Effektivität nehmen Biokatalysatoren
in der modernen Biotechnologie
eine herausragende Stellung
ein. Für fast jede chemische
Stoffumwandlung lässt sich ein geeignetes
Enzym finden, welches potenziell
in der Lage ist, einen klassischen
chemisch-physikalischen Prozess
durch den Einsatz eines biochemischen
bzw. biotechnologischen Verfahrens
zu optimieren oder in einigen
Fällen sogar zu ersetzen. Enzyme
gehören somit zu den wichtigsten
Werkzeugen der Biotechnologie.
Auch unter dem Aspekt der Arbeitssicherheit
spielen Biokatalysatoren
eine wichtige Rolle, da sie Prozesse
bei atmosphärischem Druck und in
unkritischen Lösungsmitteln (z.B.
Wasser) katalysieren.
Biokatalyse - Ein Markt mit
Zukunft
Die Anwendung von Biokatalysatoren
in biotechnologischen Produktionsverfahren
führt vielfach zu einer besseren
Ausnutzung von Rohstoffen, einer
Minimierung von Schadstoffemissionen
und einer Herabsetzung des
Energieverbrauchs bei gleichzeitig
verbesserter Produktqualität und -
reinheit. Aufgrund dieser Vorteile
wird der Einsatz von Enzymen in industriellen
Prozessen, in denen zurzeit
noch chemische oder physikalische
Verfahren dominieren, weiter
zunehmen.
Obwohl die Natur über eine Vielzahl
von Biokatalysatoren verfügt
(Schätzungen gehen von 7000 unterschiedlichen
Enzymen aus von denen
heute etwa 3000 bekannt sind), werden
bislang nur wenige Enzyme in der
Tab. 2: Projektpartner im Verbund Biokatalyse.
Synthese hochwertschöpfender Substanzen
eingesetzt. So werden insgesamt
erst 19 Enzyme in einem Maßstab
von 10 bis 1.000.000 Tonnen pro
Jahr in industriellen Biokatalyseverfahren
genutzt (Tab. 1). Die jährlich
durch Biokatalysatoren erzeugten
Produkte haben einen Marktwert von
rund 100 Mrd. US-$, wovon etwa 6
Mrd. US-$ auf die Sparte Feinchemikalien
(chirale und nicht-chirale Chemikalien)
entfallen. Unser Wissen
über die Enzymausstattung von Mikroorganismen
nimmt durch die über
51 abgeschlossenen und 208 zurzeit
laufenden Genomprojekte rapide zu
[5]. Die Menge an so gewonnenen genetischen
Informationen ist immens:
Auf hochgerechnet über 380.000 potenzielle
Biokatalysatoren (259
durchsequenzierte Mikroorganismen
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
7
Projekt Partner
Verbundkoordination Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
Dr. Dieter Sell DECHEMA, Frankfurt/M.
Ökologische und Prof. Dr. Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des Saarlandes
ökonomische Evaluation Dr. Dieter Sell DECHEMA, Frankfurt/M.
Prof. Dr. Klaus Bellmann Lehrstuhl für Allgemeine BWL und Produktionswirtschaft,
Universität Mainz
Mikrobielle Reduktion von Prof. Dr. Christian Wandrey Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum Jülich
Ketoverbindungen Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, TU München
Dr. Thomas Daußmann Jülich Fine Chemicals GmbH, Jülich
Prof. Dr. Werner Hummel Institut für Enzymtechnologie, Universität Düsseldorf
Biodehydrierung Pyruvat Prof. Dr. Hermann Sahm Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich
Dr. Robert Faurie Amino GmbH, Frellstedt
Kohlenhydratpharmaka Prof. Dr. Ulf Stahl FG Mikrobiologie und Genetik, TU Berlin Versuchs- und
Dipl.-Kfm. E. Weinmann Lehranstalt für Spiritusfabrikation und
Fermentationstechnologie, Berlin
Aminosäuren und Peptide Prof. Dr. Herbert Märkl Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, TU Hamburg-
Harburg
Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
Dr. Hans Friedmann Friedmann & Scholz GbR, Hamburg
Rekombinante Phospholipase Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann Institut für Biotechnologie, Universität Halle/Saale
Birgit Rebmann Lipoid GmbH, Ludwigshafen
Hochwertige Kohlenhydrate Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
Dr. Hans-Peter Klenk e-gene Biotechnologie GmbH, Bernried
Prof. Dr. Roland Freudl Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich
Prof. Dr. Reinhard Sterner Institut für Biochemie, Universität Köln
Prof. Dr. Wolfgang Liebl Institut für Mikrobiologie und Genetik, Universität Göttingen
Oxidative Enzyme Dr. Elisabeth Heine Deutsches Wollforschungsinstitut a. d. RWTH Aachen e.V.
Rudi Breier Textilchemie Dr. Petry GmbH, Reutlingen
Prof. Dr. Karl-Heinz van Pée Institut für Biochemie, TU Dresden
Dr. Katrin Scheibner JenaBios GmbH, Jena
Enzymscreening Prof. Dr. Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des Saarlandes
Prof. Dr. Otto Wolfbeis Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik,
Universität Regensburg
Dr. T. Räbinger BMG GmbH, Offenburg
J. Maier Microcoat, Bernried
Dr. Joachim José Medizinische und Pharmazeutische Chemie, Universität
des Saarlandes
DNA-Chips Prof. Dr. Jörg Müller Arbeitsbereich Halbleitertechnologie, TU Hamburg-
Harburg
Dr. Volker Wendisch Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich
Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
Ralf Siebert/Uwe Lehmann SLS µ-Technology GbR, Hamburg
mit je 1.500 Proteinen) kann in naher
Zukunft zurückgegriffen werden.
Im Vergleich zu den bisher ca. 200
industriell genutzten Enzymen ergeben
sich hierdurch ungeahnte Chancen.
Abb. 1: Logo des Verbundprojekts
Biokatalyse.
Biokatalysatoren im
Dienste des integrierten
Umweltschutzes
Der Einsatz von Biokatalysatoren in
den Vorhaben des Verbundes Biokatalyse
und von ICBio verfolgt ein gemeinsames
Ziel: Umweltentlastung
durch die Etablierung von innovativen
biotechnologischen Verfahren
und Produkten. Hierbei macht man
sich zu Nutze, dass durch die intrinsischen
Eigenschaften von Enzymen
eine höhere Produktreinheit und -
ausbeute erzielt werden kann und
dies bei gleichzeitiger Reduzierung
unerwünschter oder umweltrelevanter
Neben- und Abfallprodukte. Im
Sinne der Nachhaltigkeit ist die Abkehr
von End-of-pipe Maßnahmen
zur Beseitigung von Umweltschäden

8 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Tab. 3: Derzeitige Projektpartner im InnovationsCentrum Biokatalyse ICBio (Stand: Mai 2003).
Projekt Partner
Dachprojekt Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
Dr. Ralf Grote
Wirkstoffe aus extremophilen Dr. Guido Meurer BRAIN AG, Zwingenberg
Mikroorganismen Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
Dr. Arnulf Kletzin Institut für Mikrobiologie und Genetik, TU Darmstadt
Dr. Stephanie Grond Institut für Organische Chemie, Universität Göttingen
Identifizierung Prof. Dr. Karl-Dieter Entian Institut für Mikrobiologie, Universität Frankfurt/M.
hochselektiver Wirkstoffe Dr. Helmut Blum Phenion GmbH & Co. KG, Frankfurt/M.
Dr. Jörg Hauf SRD GmbH, Oberursel
Dr. M. Rimmele RiNA GmbH, Berlin
Entwicklung von innovativen Prof. Dr. Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des Saarlandes
Mikrotiterplattenreaktoren Dr. Udo Bock Across Barriers GmbH, Saarbrücken
Dr. Günter Müller Mikrocoat GmbH, Bernried
Dr. Ruth Maas Pharmacelsus GmbH, Saarbrücken
Dr. Gernot John PreSens GmbH, Regensburg
Entwicklung von Dr. Tibor Anderlei PD AC Biotech GmbH, Jülich
Expressionssystemen und Dr. Werner Hummel Lehrstuhl für Enzymtechnologie, Universität Düsseldorf
Analysetechnologien
Effiziente Expressionssysteme für Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
die Produktion von Biokatalysatoren Prof. Dr. Roland Freudl Institut für Biotechnologie I, FZ Jülich
Prof. Dr. Horst Chmiel upt GmbH, Saarbrücken
Dr. Ralph Nonninger ItN GmbH, Saarbrücken
Dr. Thomas Schäfer Novozymes A/S, Dänemark
Aktivitätscharakterisierte Prof. Dr. Uwe Bornscheuer Institut für Technische Chemie und Biochemie,
Enzymbank für die Feinchemie Universität Greifswald
Dr. Patrick Lorenz BRAIN AG, Zwingenberg
Prof. Dr. Peter Langer Institut für Chemie und Biochemie, Universität
Greifswald
Dr. Christa Schleper Institut für Mikrobiologie und Genetik, TU Darmstadt
Innovatives Downstream-processing Prof. Dr. Thomas Scheper Institut für Technische Chemie und Biochemie,
von Pharmatargets Universität Hannover
Dr. Oskar Reif Sartorius AG, Göttingen
Dr. Alexander Tappe Cell Culture Service GmbH, Hamburg
Einsatz von Magnettechnologie zur Dr. Matthias Franzreb Institut für Technische Chemie, FZ Karlsruhe
Bioproduktaufarbeitung Prof. Dr. Christoph Syldatk Institut für Bioverfahrenstechnik, Universität Stuttgart
Dr. Lothar á Brassard chemagen AG, Baesweiler
Dr. Uwe Habich Steinert Elektromagnetbau GmbH, Köln
Stammentwicklung und Dr. Petra Peters-Wendisch Institut für Biotechnologie I, FZ Jülich
Downstream-processing bei der Dr. Albert deGraaf Metex GmbH, Jülich
Produktion von L-Serin Dr. Robert Faurie Amino GmbH, Frellstedt
Entwicklung von Parallelverfahren Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, TU München
zur Etablierung biokatalytischer Dr. Klaus Kaufmann H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim
Prozesse Dr. Gernot John PreSens GmbH, Regensburg
Dr. Matthias Arnold DASGIP AG, Jülich
Primärscreening von Prof. Dr. Jochen Büchs Institut für Bioverfahrenstechnik, RWTH Aachen
Mikroorganismen unter Dr. Doris Klee Lehrstuhl für Textilchemie und Makromolekulare
Fed-Batch-Bedingungen Chemie, RWTH Aachen
Dr. Tibor Anderlei AC Biotech GmbH, Jülich
Entwicklung eines Verfahrens zur Prof. Dr. Horst Chmiel upt GmbH, Saarbrücken
prozessintegrierten Biokatalyse Dr. Andreas Schmid ETH Zürich
für Epoxidierungen Dr. Bernhard Hauer BASF AG, Ludwigshafen
Dr. Rudolf Krumbholz K.D.-Pharma GmbH
dringend geboten. Nur vorbeugende,
produkt- bzw. produktionsintegrierte
Maßnahmen unter Ausnutzung biotechnologischer
Verfahren haben das
Potenzial, ökologische und ökonomische
Vorteile miteinander zu verbinden,
und so dem Wirtschaftsstandort
Deutschland entscheidende Impulse
zu verleihen. Während große Chemie-
und Pharmaunternehmen diese
Chancen bereits erkannt und zu
nutzen begonnen haben, bleiben kleine
und mittelständische Unternehmen
dagegen häufig aufgrund fehlender
F&E-Aktivitäten von den Chancen
der Biotechnologie ausgeschlossen.
Hier sollen der Verbund Biokatalyse
und das InnovationsCentrum Biokatalyse
mit ihrem ausgeprägten Netzwerkgedanken
entscheidend dazu
beitragen, den Wissenstransfer zwischen
Hochschule und Industrie zu
fördern sowie innovative Verfahren
und Produkte in eine industrielle Nutzung
zu übertragen. Vergleichbar mit
einem „Bündnis für die Biokatalyse“
soll die Leistungsfähigkeit der integrativen
Querschnittsdisziplin Biotechnologie
unter Beweis gestellt
werden.
Impulse für die
Biokatalyse
Die Deutsche Bundesstiftung Umwelt
hat das Problemlösungspotential des
Einsatzes von Enzymen in biotechnologischen
Prozessen und Produkten
frühzeitig erkannt und fördert seit
1997 eine Vielzahl von Forschungsvorhaben
im Rahmen des Programms
„Integrierte Biotechnologie“.
Das im Mai 2000 gestartete Verbundprojekt
Biokatalyse bündelt
Kompetenzen, um das Potenzial der
Biokatalyse in den Bereichen Feinchemikalien,
Wirkstoffe, Textilien
und Methoden unter Beweis zu stellen.
Verbund Biokatalyse -
Wegbereiter für innovative
Biotechnologie
Der Verbund Biokatalyse umfasst
bundesweit 11 Projekte an denen
über 50 Wissenschaftler und 9 Firmen
aus dem Bereich kleiner und mittelständischer
Unternehmen (KMU) beteiligt
sind (Tab. 2). Als Schwerpunkte
des Verbundvorhabens wurden die
Themenbereiche Feinchemikalien,
Wirkstoffe, Textilien und Methoden
definiert, da hier ein großes Potenzial
zur Demonstration der Leistungsfähigkeit
biokatalytischer Verfahren
gesehen wurde.

Umweltgerechte
Produktion von
Feinchemikalien,
Wirkstoffen und Textilien
Die Themenbereiche „Feinchemikalien“
und „Wirkstoffe“ nehmen mit
sechs Projekten einen großen Raum
innerhalb des Verbunds ein. Feinchemikalien
und pharmakologische
Wirkstoffe müssen hinsichtlich ihrer
Reinheit besonders hohen Qualitätsansprüchen
genügen. Im Gegensatz
zu so genannten Bulk-Chemikalien
werden sie in relativ geringen Mengen
hergestellt und haben eine hohe
Wertschöpfung. Die industrielle Nutzung
von Biokatalysatoren hat in diesem
Bereich ein großes Potenzial, da
beispielsweise enantiomerenreine
Produkte mit weniger Syntheseschritten
und einfacherer Aufarbeitung hergestellt
werden können. Die Produktion
von Feinchemikalien ist außerdem
ein klassisches Betätigungsfeld
kleiner und mittelständischer Unternehmen,
die in der Lage sind, flexibel
auf kleine Nischenmärkte zu reagieren.
Hier bietet die Kooperation im
Verbundprojekt Biokatalysatoren gerade
solchen Unternehmen neue
Chancen, die in Ermangelung eigener
F&E-Aktivitäten bisher keine biotechnologischen
Verfahren entwickeln
konnten.
In der Textilproduktion sind viele
Prozesse (Stoffveredelung, Färben)
durch einen hohen Energieverbrauch
und eine häufig signifikante Gewässerbelastung
gekennzeichnet, und
zwar unabhängig davon, ob es sich
um die Herstellung und Verarbeitung
von Kunst- oder Naturfasern (Baumwolle,
Wolle, Seide) handelt. Hier
werden im Verbund Biokatalyse neue
Verfahren entwickelt, die diesen ökologischen
Problemen wirkungsvoll
begegnen, beispielsweise durch den
Einsatz von Oxidasen/Peroxidasen zur
enzymatischen Rohstoffbehandlung
von Wolle und Baumwolle.
Methodenentwicklung -
DNA-Chips und
Screeningstrategien
Der Methodenentwicklung und -pflege
widmen sich im Verbund Biokatalyse
zwei Projekte. Zum einen steht die
Etablierung und Optimierung der
DNA-Chiptechnologie für den Bereich
Diagnostik und Analyse im Vordergrund.
Zum anderen werden neuartige
Mikroreaktoren mit pH- und Sauerstoffsensoren
entwickelt, die ein effizientes
Enzymscreening ermöglichen
sollen. Beide Methoden werden der
Tab. 3: Fortsetzung.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
9
Projekt Partner
Einsatz von Amidasen zur Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg
enantioselektiven Synthese von
Amino- und Carbonsäuren
Dr. Shukrallah Na’amnieh X-Zyme GmbH, Düsseldorf
Enzymatische Herstellung von Prof. Dr. Klaus Buchholz Technische Chemie, TU Braunschweig
Oligosacchariden Dr. Shukrallah Na’amnieh X-Zyme GmbH, Düsseldorf
Enzymatische Altfettalkoholyse Dr. Gerd Kley Bundesanstalt für Materialforschung, Berlin
Dipl.-Chem. Gerhard Grothe Greibo Chemie GmbH, Velten
Dr. Ralf Bock Institut für Werkzeugmaschinen und Fertigungstechnik,
TU Braunschweig
Franziska Reh Volkswagen AG, Wolfsburg
Dr. Rüdiger Freitag Castrol Industrie GmbH, Mönchengladbach
Wiederverwertung Prof. Dr. Alexander Steinbüchel Institut für Mikrobiologie, Universität Münster
kautschukhaltiger Reststoffe Dr. Udo Hölker Höfer Bioreakt GmbH, Bonn
Glyoxylat-Produktion Prof. Dr. Michael Bott Institut für Biotechnologie I, FZ Jülich
Dr. Thomas Schwarz bitop GmbH, Witten
Pflanzliche Bioreaktoren zur PD Dr. Michael Kleine Planton GmbH, Kiel
Pharmaproduktion Prof. Dr. Jens-Michael Schröder Universitätshautklinik, Kiel
Synthese chiraler 2-Oxazolidinone Dr. Martin Bertau Institut für Biochemie, TU Dresden
Dr. Thomas Daußmann Jülich Fine Chemicals GmbH, Jülich
Biotechnologie entscheidende Impulse
verleihen. So können beispielsweise
unterschiedliche Screeningprogramme
schnell und kostengünstig
durchgeführt werden und biotechnologische
Potenziale früher bewertet
werden. Die Integration dieser methodischen
Forschungsfelder in den Verbund
Biokatalyse spielt darüber hinaus
auch für die Vernetzung der Projekte
untereinander eine wichtige Rolle,
da beide Methoden für verbundübergreifende
Fragestellungen zur
Verfügung gestellt werden können.
Abb. 2: Logo des InnovationsCentrum
Biokatalyse
Ökologische und
ökonomische Evaluation
Integraler Bestandteil des Verbundvorhabens
ist das Projekt „Ökonomische
und ökologische Evaluation“. Dieses
übergreifende Vorhaben hat bei vier
ausgewählten Projekten des Verbunds
eine ökonomische und ökologische
Evaluation biokatalytischer Prozesse
während der Entwicklung durchgeführt.
Es hat sich herausgestellt, dass
in sehr frühen Phasen eines Projekts
die wesentlichen Weichenstellungen
erfolgen. Daher ist es bei der Entwicklung
neuer Verfahren von großer Bedeutung,
dass die Realisierungschancen
schon frühzeitig beurteilt werden.
Die Umsetzung biokatalytischer Verfahren
scheitert oft trotz zu erwartender
ökonomischer und ökologischer
Vorteile, da die Entwicklungschancen
als zu ungewiss eingestuft werden. Um
diesem Dilemma zu begegnen, wurden
im Rahmen des Themenschwerpunktes
„Evaluation“ Methoden zur
Beurteilung der Nachhaltigkeit auf
Basis ökonomischer und ökologischer
Parameter unter Einbeziehung
umfassender Stoff- und Energiebilanzen
(Ökobilanzierung) weiterentwikkelt.
Die Software-gestützten Methoden
haben, wie alle Projekte des Verbundvorhabens,
Beispielcharakter
und können auf die Evaluierung neuer
biotechnologischer Verfahren übertragen
werden.
Die Ergebnisse der am Verbund
Biokatalyse beteiligten Projekte werden
in den nachfolgenden Artikeln
dieser Sonderveröffentlichung detailliert
beschrieben.
Koordination des
Verbundprojekts
Die Kooperation innerhalb des Verbunds
wird durch ein Koordinationsprojekt
unter der Leitung von Professor
Garabed Antranikian (Technische
Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg)
abgestimmt. Zusammen mit
dem stellvertretenden Koordinator Dr.
Dieter Sell (DECHEMA e.V.) und dem
Leiter des Koordinationsbüros Dr. Ralf
Grote (TU Hamburg-Harburg) sorgt
der Koordinator für die Förderung von
Synergieeffekten und eine intensive
Kommunikation zwischen den Projektgruppen.
Die Verbundkoordination
betreut auch die administrative und
kaufmännische Abwicklung des Gesamtverbunds.
Ein wichtiges Werkzeug,
verbundübergreifende Aufgabenstellungen
effizient bearbeiten zu
können, sind die sogenannten Taskforcegruppen.
Im Verbund Biokatalyse
existieren zurzeit vier Taskforcegruppen
zu den Themenbereichen
„Methoden“, „Kommunikation“,
„Projektmanagement” und „Evaluation“.
Ziel ist es, den Gesamtverbund
flexibel zu gestalten und jederzeit einen
Zugriff auf die Resultate der einzelnen
Partner zu ermöglichen. Hierbei
wird besonderer Wert darauf gelegt,
einzelne Problemstellungen
nicht unabhängig voneinander zu bearbeiten,
sondern die Arbeiten aufeinander
abzustimmen, um Duplikationen
zu vermeiden. Wichtige Aufgaben
des Koordinators sind außerdem
die Außenpräsentation des Verbundvorhabens,
die Organisation von Statusseminaren
und internationalen
Kongressen sowie die allgemeine Öffentlichkeitsarbeit,
wie beispielsweise
auf Fachmessen wie der BIOTECH-
NICA in Hannover. Unter der Adresse
http://www.biokatalyse.de ist der In-

10 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
ternetauftritt des Verbunds Biokatalyse
zu erreichen, der eine wichtige interne
und externe Kommunikationsplattform
darstellt.
InnovationsCentrum
Biokatalyse
Wie auch am Beispiel des Verbunds
Biokatalyse deutlich geworden ist, haben
die immensen Forschungsaktivitäten
in den vergangenen Jahren unser
Wissen über das Vorkommen und
die Funktionsweise von Enzymen
rasch anwachsen lassen. Enzymmechanismen
und Struktur-Funktions-
Beziehungen wurden an Proteinen aus
verschiedensten Quellen (Bakterien,
Archaeen, Hefen, höhere Organismen)
vergleichend untersucht. Biokatalysatoren
aus extremophilen Mikroorganismen
ermöglichen beispielsweise
den Einsatz von Enzymen in industriellen
Prozessen, auch unter harschen
Bedingungen, bei denen konventionelle
Proteine vollständig denaturieren
würden [6]. Dennoch haben
vergleichsweise wenig enzymatische
Prozesse und Verfahren den Weg in
eine intensive kommerzielle Nutzung
gefunden. Nur rund 2,5% aller bekannten
Enzyme werden zurzeit industriell
genutzt [7]. Zu einer nachhaltigen
Entwicklung gehört aber gerade
die Umsetzung wissenschaftlicher Ergebnisse
zu innovativen Verfahren und
Produkten, welche zur Lösung der
globalen Herausforderungen beitragen
können. Dieses wurde öffentlich
im Rahmen des 21. Osnabrücker Umweltgesprächs
„Nachhaltige Biokatalyse“
am 9. Dezember 2002 diskutiert,
wo auch ICBio als Initiative der DBU
zur Förderung nachhaltiger Biokatalyse
erstmals vorgestellt wurde.
Ausgehend von den positiven Erfahrungen
im Verbund Biokatalyse, soll
versucht werden, durch ICBio dauerhafte
Strukturen zu schaffen, um biokatalytische
Verfahren in Deutschland
nachhaltig zu stärken. Das InnovationsCentrum
Biokatalyse soll als „Virtuelles
Haus der Biokatalyse“ einen
wichtigen Schritt in diese Richtung gehen.
In einem flexiblen Zusammenschluss
innovativer Projekte mit einer
klaren Koordinationsstruktur werden
die drei strategisch wichtigen Themenschwerpunkte
Screeningsysteme, Expression
und Downstream-Processing/Produktaufbereitung
mit dem
Ziel der Gewinnung von Wirk- und
Wertstoffen intensiv bearbeitet. In Kooperation
mit Industrie und Hochschule
sollen Flaschenhälse eliminiert
werden, die den Einsatz von Biokatalysatoren
blockieren.
Gewinnung von Wirk- und
Wertstoffen
Ziel jeden biotechnologischen Fortschritts
sind innovative Verfahren und
Produkte. Die Gewinnung von vermarktbaren
Wertstoffen aus Abfallund
Reststoffen stellt eine ökologische
und ökonomische Herausforderung
dar. Die Kombination von Abfallentsorgung
und gleichzeitiger Wertstoffgewinnung
ist mit biotechnologischen
Verfahren und unter Verwendung von
Biokatalysatoren möglich. Den Anforderungen
von Abfallwirtschafts- und
Abfallkreislaufgesetz wird hierbei in
besonderem Maße Rechnung getragen.
Von besonderem Interesse ist
aber auch die Umsetzung nachwachsender
Rohstoffe wie Stärke, Cellulose
und Hemicellulose zu hochwertschöpfenden
Produkten. Neuartige
Produktionsverfahren unter Einsatz
lebender Zellen als so genannte „Zellfabriken“
ermöglichen darüber hinaus
die ressourcenschonende Herstellung
von Wert- und Wirkstoffen jenseits
von konventionellen Produktionsanlagen.
Ein Demonstrationsprojekt
mit diesem Schwerpunkt ist beispielsweise
die Produktion von Biopharmazeutika
in Pflanzen (Biofarming)
oder die fermentative Herstellung
von Aminosäuren.
Ein Centre of Excellence
der Biokatalyse
Das InnovationsCentrum Biokatalyse
als ein Centre of Excellence auf dem
Gebiet der Biokatalyse wird durch ein
in Hamburg ansässiges Koordinationsbüro
mit ausgeprägtem Dienstleistungscharakter
unter der Leitung von
Professor Antranikian koordiniert. Zu
den vornehmlichen Aufgaben gehören
hierbei:
– Aufbau einer Kommunikations- und
Kompetenzplattform für den Wissenstransfer
zwischen Hochschulen und
Industrie.
– Erhöhung der Durchlässigkeit zwischen
Hochschule und Industrie.
– Organisatorische und wissenschaftliche
Abwicklung von Projektvorhaben
zwischen Hochschulen und Industriepartnern.
–Erarbeiten von Lösungsansätzen für
Probleme der deutschen Biotech-Industrie
durch Koordination internationaler
Projektkooperationen.
–Sicherstellung eines horizontalen
Know-how Transfers durch Austausch
von Doktoranden, Wissenschaftlern
und Managern.
– Aus- und Weiterbildung von Fachkräften.
– Entwicklung eines Konzepts zum
Aufbau einer Internationalen Sammlung
von Biokatalysatoren.
–Organisation und Durchführung
von nationalen und internationalen
Tagungen und Kongressen.
– Organisatorische und logistische
Unterstützung von Antragstellern.
Unter dem Dach der Initiative InnovationsCentrum
Biokatalyse werden
zurzeit 19 Projekte durch die DBU
gefördert, die in drei Themenschwerpunkten
angesiedelt sind (Tab. 3).
Intelligente
Screeningsysteme
Ziele dieses Schwerpunkts sind Entwicklung,
Optimierung und Einsatz innovativer
Screeningverfahren in der
Biotechnologie. Die im Rahmen dieses
Schwerpunkts bearbeiteten Projekte
lassen die Identifizierung neuartiger
und innovativer Zellkomponenten
für eine breite Anwendung in biotechnologischen
und pharmakologischen
Anwendungsgebieten erwarten.
Durch die Einbeziehung neuer Organismenklassen,
beispielsweise extremophiler
Mikroorganismen, sowie
durch den Einsatz modernster Screeningtechnologien(Aktivitätsprofilierung,
PCR-Typisierung, Mikrotiterplattenreaktoren,
TOP-DS, TOP-HS) haben
die Vorhaben einen besonders
innovativen Charakter. Durch die Identifizierung
neuartiger Leitstrukturen
können die Grundlagen zur Entwicklung
innovativer Wirkstoffgruppen geschaffen
werden.
Effiziente Expression
Die Anwendung von Biokatalysatoren
in biotechnologischen Produktionsverfahren
scheitert vielfach noch daran,
dass die benötigten Enzyme nicht
in ausreichender Menge aus den Wildtypstämmen
isoliert werden können.
Es ist daher von besonderer Relevanz,
effiziente Expressionssysteme in mesophilen
Wirtsorganismen zu optimieren
und einzusetzen, um so die natürlichen
Quellen von Biokatalysatoren
für Umwelt und Gesellschaft zu nutzen.
In den Vorhaben dieses Themenschwerpunkts
werden daher innovative
Expressionssysteme auch in Grampositiven
Mikroorganismen (Bacillus,
Staphylococcus) und in Hefen intensiv
erforscht.
Downstream-Processing
Das Downstream-Processing spielt in
biotechnologischen Produktionsverfahren
eine entscheidende Rolle. Die
katalytische Umsetzung mittels immobilisierter
Enzyme bzw. die Aufreinigung
von Bioprodukten erfordert typischerweise
feststofffreie Lösungen,
die sich innerhalb von Festbett- und
Membranenreaktoren oder Chromatographiesäulen
einsetzen lassen. Die
zum Erreichen eines feststofffreien Zustands
eingesetzten Techniken, wie
Fällung, Zentrifugation oder Mikrofiltration,
machen oft ein kompliziertes
vielstufiges Downstream-Processing
erforderlich, das oftmals mit einem erheblichen
Chemikalien- und Energieaufwand
sowie einem Produktverlust
verbunden ist. Strategien zur Vereinfachung
von Downstream-Prozessen,
beispielsweise durch Einsatz innovativer
Trenn- oder Membrantechnologien,
werden in diesem Themenschwerpunkt
untersucht, um die Konkurrenzfähigkeit
biotechnologischer
Produktionsverfahren zu erhöhen.
ICBio-Koordination
Da es sich bei ICBio um ein offenes
Forschungsnetzwerk handelt, können
die zurzeit bewilligten Projekte durch
weitere Vorhaben in den oben genannten
Themenschwerpunkten ergänzt
werden. Übergeordnetes Ziel ist es,
das herausragende Potenzial biokatalytischer
Verfahren und Produkte unter
einem Dach zu bündeln, um hierdurch
nachhaltig innovative Strukturen
und Vernetzungen zu schaffen.
Die durch das ICBio Management
als Serviceleistung generierten Dienstleistungen
finanzieren sich aus DBU-
Fördermitteln, die von den beteiligten
Partnern in Form von Unteraufträgen
an ICBio weitergeleitet werden.
Schwerpunkte der Aktivitäten des IC-
Bio Managements sind: Kommunikation,
Öffentlichkeitsarbeit und Wissenstransfer.
Um Synergieeffekte zu generieren
ist eine intensive Kommunikationskultur
von zentraler Bedeutung. Das
ICBio Management ist als ständig
präsenter Ansprechpartner sowohl für
die Sicherstellung der internen Kommunikation
zwischen den Projektpartnern
als auch für die externe Kommunikation
mit Interessensgruppen und
der breiten Öffentlichkeit verantwortlich.
Neben dem Aufbau eines
Internetportals unter der Adresse
www.icbio.de gehören hierzu Veröffentlichung
in Form von Broschüren,
Beiträgen in Sonderpublikationen sowie
in fach- und populärwissenschaftlichen
Zeitschriften. Um den Wissenstransfer
jenseits von Großveranstaltungen
wie Messen und Kongressen zu
fördern, fungiert das ICBio Manage-

ment als Vermittlungsstelle zwischen
Know-how-Gebern und -Nehmern. Im
Bereich Weiterbildung bietet ICBio für
seine Projektpartner kostenlose Seminare
an. So wurde beispielsweise im
Mai 2003 eine Seminarreihe zum Thema
Projektmanagement gestartet, die
im September 2003 weitergeführt
wird.
ICBio Taskforcegruppen
Wie die Erfahrungen im Verbund Biokatalyse
gezeigt haben, sind Taskforcegruppen
ein wichtiges Instrument zur
Verzahnung der Projekte. Die Taskforcegruppen
bearbeiten definierte,
erst während der Projektlaufzeit entstandene
Probleme und bieten übergreifende
Lösungen an. So können die
ICBio-Projekte flexibel an aktuelle
Fragestellungen angepasst werden.
Taskforcegruppe „Methoden“:
Diese Taskforcegruppe soll die im
Rahmen von ICBio angewandten Methoden
evaluieren, katalogisieren und
allen interessierten Projektpartnern
zugänglich machen. Hierdurch soll gewährleistet
werden, dass die im IC-
Bio vorhandene Methodenvielfalt allen
beteiligten Partnern zur Verfügung
steht und gegebenenfalls für eigene
Arbeiten genutzt werden kann.
Taskforcegruppe „Projektmanagement“:
Die Aufgabe der Taskforcegruppe
„Projektmanagement“ besteht
darin, einheitliche Strukturen des Projektmanagements
und Projektcontrolling
zu erarbeiten und allen ICBio-
Partnern zur Verfügung zu stellen. Ziel
ist die Etablierung eines EDV-gestützten
Systems zur Sicherstellung eines
effizienten Projektmanagements bei
Industrie- und Hochschulpartnern.
Taskforcegruppe „Evaluation“:
Die Taskforcegruppe „Evaluation“ soll
Kriterien zur Verfügung stellen, welche
die wesentlichen betriebswirtschaftlichen
(Marktanalyse, Erlös- und
Kostenanalyse, ökonomische Umfeldanalyse)
und ökologischen Parameter
(Inputanalyse, Outputanalyse, ökologische
Umfeldanalyse) ausgewählter
Projekte erfasst. Ziel ist es, schon in
frühen Phasen der Entwicklung eine
Abschätzung der Konkurrenzfähigkeit
der neuentwickelten Verfahren und
Produkte zu ermöglichen.
Organisation von
Kongressen,
Messeauftritten und
Statusseminaren
Das ICBio Koordinationsbüro veranstaltet
Meetings und Kongresse mit
dem Schwerpunkt Biokatalyse. Insbesondere
soll der International Congress
on Biocatalysis (biocat), der im
Juli 2002 erstmals in Hamburg stattgefunden
hat, als eine feste Plattform
der in ICBio vernetzten Projekte auf
internationaler Ebene etabliert werden
(weitere Informationen: http://
www.biocatalysis.de). Darüber hinaus
werden die in ICBio vertretenen Projekte
auf wichtigen Messen (z.B. Biotechnica)
öffentlichkeitswirksam präsentiert.
Die Förderung eines intensiven
Erfahrungsaustausches zwischen
den Projekten wird durch regelmäßig
stattfindende Statusseminare sichergestellt.
Verbund Biokatalyse und
ICBio - Life Science auf
hohem Niveau
Rund 90% aller Chemieprodukte
durchlaufen bei ihrer Herstellung ein
katalytisches Verfahren, oft unter Einsatz
umweltgefährdender Katalysato-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
11
ren. Es ist unzweifelhaft, dass Biokatalysatoren
aus den verschiedensten
(Mikro-)Organismen in Zukunft die
selektivere und spezifischere Alternative
darstellen werden. Gerade im Bereich
der pharmazeutischen Industrie
und der Sparte Fein- und Spezialchemikalien
mit ihren hohen Anforderungen
an Produktreinheit und -qualität
wird die Biokatalyse eine herausragende
Rolle spielen. Einer Studie von Frost
& Sullivan (2001) [8] zufolge wird der
Marktwert für Chiraltechnologie von
6,6 Mrd. US-$ im Jahr 2000 auf 16
Mrd. US-$ im Jahr 2007 anwachsen.
Die Biokatalyse wird hierbei eine zunehmend
wichtige Ergänzung zur
asymmetrischen Synthese darstellen
und dem Bereich Life Sciences entscheidende
Impulse verleihen. Die
Projekte im Verbund Biokatalyse und
in ICBio sind durch ihre thematische
Ausrichtung optimal in der Zukunftstechnologie
Biokatalyse positioniert.
Die in beiden Forschungsnetzwerken
bearbeiteten Projekte werden dazu
beitragen, die moderne Biotechnologie
um wichtige biokatalytische Verfahren
und Produkte zu bereichern.
Gleichzeitig wird dem Gedanken der
Nachhaltigkeit Rechnung zu tragen,
indem sichergestellt wird, dass durch
Biokatalyse Umweltschutz und Wettbewerbsfähigkeit
in Einklang gebracht
werden.
Literatur
Besuchen Sie unsere Homepage
www.dbu.de
Dort finden Sie weitere
Biotechnologie-Projekte in
unserer Projektdatenbank
(www.dbu.de/db/)
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Initiativen zum Umweltschutz,
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Verlag, Berlin.
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Market (Report 3835), New
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Korrespondenzadresse
Dr. Ralf Grote
Koordinationsbüro Verbund
Biokatalyse und ICBio
TU Hamburg-Harburg
Technische Mikrobiologie
Kasernenstraße 12
D-21073 Hamburg
Tel.: 040-42878 3336
Fax: 040-42878 2729
eMail: grote@tuhh.de
Web: www.biokatalyse.de,
www.icbio.de

12 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
AMINOSÄUREN
Biotechnologische Innovationen in
der Aminosäure-Darstellung
� Dr. Petra Peters-Wendisch1 , Carsten Protsch2 , Henning Serger3 , Prof. Dr. Hermann Sahm1 , Dr. Robert Faurie3 , Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber2 ,
1 2 3 Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich GmbH, D-52425 Jülich, Institut für Technische Chemie, Callinstr. 3, D-30167 Hannover, AMINO
GmbH, An der Zuckerraffinerie 10, D-38373 Frellstedt
Einleitung
Aminosäuren sind wirtschaftlich wertvolle
Produkte, die in der Pharmaindustrie,
sowie der Nahrungs- und Futtermittelindustrie
Verwendung finden.
Sie werden für pharmazeutische
Zwecke in höchster Reinheit ohne Anwesenheit
von Nebenprodukten benötigt.
Beispielsweise sind Aminosäuren
Bestandteile von Infusionslösungen
für die prä- und postoperative parenterale
Ernährung, wo vor allem die für
den Menschen essenziellen Aminosäuren,
wie Lysin, Tryptophan oder Isoleucin,
wichtig sind. Obwohl die Aminosäure
Serin als nicht-essenziell eingestuft
ist, weiß man jedoch heute,
dass sie im menschlichen Organismus
nicht in ausreichender Menge synthetisiert
werden kann. Damit wird auch
sie in Zukunft eine immer bedeutendere
Rolle als pharmazeutischer Wirkstoff
und als Nahrungsergänzungsmittel
spielen. Ferner wird Serin als Vorstufe
zur enzymatischen Synthese von
Tryptophan, einem ebenfalls wichtigen
pharmazeutischen Wirkstoff benötigt.
Die Herstellung vieler Aminosäuren
erfolgt großtechnisch durch Prozesse
wie chemische Synthese oder saure
Hydrolyse proteinogener Rohstoffe.
Diese Methoden zeichnen sich jedoch
durch eine hohe Umweltbelastung
aus. So erfordert die saure Hydrolyse
zusammen mit der nachfolgenden
chromatografischen Trennung
und Aufarbeitung einen sehr hohen
Energie- und Chemikalieneinsatz. Alternative
Verfahren sind zum Beispiel
die Fermentation mit geeigneten Mikroorganismen,
die direkte enzymatische
Katalyse oder die chromatographische
Aufreinigung von Aminosäuren
aus nachwachsenden Rohstoffen.
Alle alternativen Verfahren haben den
Vorteil, dass ausschließlich die biologisch
aktiven L-Aminosäuren gebildet
werden. Des Weiteren bietet die enzymatische
Hydrolyse proteinhaltiger,
industrieller Nebenprodukte die
Möglichkeit, unter schonenden Bedingungen
ein breites Spektrum an
Aminosäuren zu gewinnen. Allen innovativen
Darstellungsmethoden von
Aminosäuren, speziell für den Pharmabereich,
ist bisher die Notwendigkeit
einer aufwändigen Aufreinigung
und Aufarbeitung gemeinsam. Hier ist
die Etablierung neuer Verfahren zur
prozessintegrierten selektiven Abtren-
nung von Aminosäuren erforderlich.
Die im nachfolgenden vorgestellten
vier Projekte beschäftigen sich mit der
mikrobiellen Serinproduktion, der
Optimierung der Tryptophanproduktion
sowie der Hydrolyse von proteinogenen
Rohstoffen mittels Extremozymen
und der Veredelung regionaler
Rohstoffe durch neue Aufarbeitungsverfahren.
Abb. 1: Schema des Zentralstoffwechsels und der Serinbiosynthese in C.
glutamicum und der darin vorgenommenen gezielten Veränderungen zur
Konstruktion eine Serinproduktionsstammes. PGDH, 3-Phosphoglycerat-
Dehydrogenase; PSAT, Phosphoserin-Aminotransferase; PSP, Phosphoserin-Phosphatase;
L-SD, L-Serin-Dehydratase.
Mikrobielle
Serinproduktion
Die Aminosäure Serin L-Serin wird
derzeit großtechnisch im Wesentlichen
auf zwei Wegen gewonnen:
Durch Extraktion von Eiweißhydrolysaten
bzw. durch Biotransformation
oder fermentativ aus der Aminosäure
Glycin. Die für die erste Methode eingesetzte
saure Hydrolyse proteinogener
Rohstoffe erfordert einen sehr
hohen Energie- und Chemikalieneinsatz
und ist daher nur unter ökologisch
und wirtschaftlich problematischen
Bedingungen durchführbar,
während die Umwandlung von Glycin
zu Serin, aufgrund des hohen Glycin-
Preises wirtschaftlich eher unrentabel
ist.
Ziel war daher die Etablierung eines
mikrobiellen Verfahrens zur Produktion
von Serin ausgehend von dem
nachwachsenden kostengünstigen
Rohstoff Glukose und die anschließende
Ökobilanzierung des neuen
Verfahrens im Vergleich zum herkömmlichen
Verfahren der sauren
Hydrolyse.
Zur gezielten Konstruktion eines
Serinproduktionsstammes mittels
molekularer Methoden wurde das
Bakterium Corynebacterium glutamicum
verwendet, das bezüglich
seiner Fähigkeit andere Aminosäuren,
wie Lysin und Glutamat, in großen
Mengen zu bilden gut untersucht ist
[1]. Zunächst wurde die Biosynthese
von Serin analysiert. Die drei relevanten
Gene serA, serC und serB wurden
aus C. glutamicum kloniert. Die Regulation
der Synthese erfolgt auf Enzymaktivitätsebene
durch Hemmung
des ersten Enzyms des Wegs, der 3-
Phosphoglycerat-Dehydrogenase
(PGDH, serA) durch Serin. Durch die
gezielte Konstruktion von Allelen des
serA-Gens von C. glutamicum mittels
PCR wurden PGDH-Muteine erzeugt,
die sich nicht mehr durch Serin hemmen
lassen [2]. Der Wildtyp von

C. glutamicum scheidet kein Serin
aus, und erstaunlicherweise führte die
alleinige Überexpression deregulierter
serA-Gene nicht zu einer gesteigerten
Serinbildung. Die Überexpression
aller drei Biosynthesegene im Wildtyp
führte jedoch zu einer geringen, aber
signifikanten Steigerung der Serinbildung.
Es wurde daher zusätzlich zur
Synthese auch der Abbau von Serin
untersucht. Serin ist neben der Proteinsynthese
auch Vorstufe der Synthese
zahlreicher anderer zellulärer Metabolite.
Es konnte gezeigt werden,
dass die Umsetzung von Serin zu Pyruvat
durch das Enzym L-Serin-Dehydratase
katalysiert wird und diese Reaktion
wesentlich für die Serinakkumulation
ist. Das Ausschalten dieser
Reaktion führte bei gleichzeitiger
Überexpression der Biosynthesegene
zu einer 80-fachen Steigerung der
Serinbildung. Um auch eine mögliche
Limitation in der Bereitstellung der
Vorstufe für die Serinbildung, dem Glykolyseintermediat
3-Phosphoglycerat,
auszuschalten, wurden Mutanten hergestellt,
die Glykolyseintermediate
anstauen. Die Kombination dieser
Mutationen mit der Überexpression
der Serinbiosynthesegene und einer
Reduktion des Serinabbaus (Abb. 1)
führte letztlich zu einer nochmaligen
Steigerung der Serinausbeute bezogen
auf das Produkt um das 6-fache, auf
2,5 g/l.
Trotz dieser ermutigenden Ergebnisse
sind weitere Fortschritte erforderlich,
um auch eine wirtschaftliche
Produktion von Serin im industriellen
Maßstab zu ermöglichen. Als Ziel für
die Produktion wurde in der Modellbildung
für die Ökobilanz und die
Wirtschaftlichkeitsanalyse für das fermentative
Verfahren von 30 g/l Produktausbeute
und 47 % Aufarbeitungsausbeute
ausgegangen. Unter
diesen Bedingungen zeigen sich signifikante
ökologische Vorteile des fermentativen
Verfahrens gegenüber dem
Referenzverfahren der sauren Hydrolyse.
Insbesondere in den ökobilanziellen
Wirkungskategorien Energiebedarf,
Treibhauseffekt, Wasserverbrauch,
Abwasser und mit Einschränkungen
auch in der Kategorie Ozonbildung
ist das fermentative Verfahren
der sauren Hydrolyse überlegen. Aus
ökonomischer Sicht bietet die Fermentation
bei diesen Zielparametern
relativ zur sauren Hydrolyse und unter
den Bedingungen eines deutschen
Produktionsstandorts zwar Kostenvorteile,
um im internationalen Wettbewerb
dauerhaft bestehen zu können
und um angesichts des herrschenden
Preisdrucks auf dem Markt für Ami-
nosäuren auch in ungünstigen Marktphasen
mit ausreichenden Deckungsbeiträgen
produzieren zu können, ist
jedoch eine weitere Verbesserung des
Stamms und des Gesamtprozesses erforderlich.
Veredelung regionaler
Rohstoffe durch innovative
Aufreinigungsverfahren
Die bei der Zuckerrübenverarbeitung
anfallende Zuckerrübenmelasse stellt
einen interessanten nachwachsenden
Rohstoff für verschiedene Einsatzbereiche
dar. Das von der AMINO
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
13
Die Prozessführung des Trennverfahrens
basiert auf online gemessenen
physikalischen Parametern. Allerdings
können diese Parameter bei der
Bestimmung der Schnittgrenzen für
die Serin-Fraktion nur Anhaltspunkte
liefern, sodass das Elutionsverhalten
aufgrund von Erfahrungswerten
abgeschätzt und in regelmäßigen Abschnitten
durch Probenahme und
Analyse im Labor offline kontrolliert
wird. Die Analysenergebnisse stehen
erst mit einer zeitlichen Verzögerung
von 12 – 24 h zur Verfügung. Erst
dann kann festgestellt werden, ob die
Trennung optimal verlaufen ist.
tion ist proportional zur D-Serin-Konzentration.
Zwar ergeben sich durch
ein schwankendes Konzentrationsverhältnis
von D- zu L-Serin in der Melasse
deutliche Abweichungen bei der
Absolutkonzentration der D,L-Seringesamtkonzentration,
was aber für
die Bestimmung der Schnittgrenzen
unerheblich ist. Der mit Hilfe des Biosensors
bestimmte Konzentrationsverlauf
des Serin-Peaks stimmt sehr gut
mit der HPLC-Referenzanalytik überein.
Der Zeitbedarf des Biosensorsystems
von zwei Minuten pro Analyse
erlaubt es zwar nicht, dass die Schnittgrenzen
während der Elution festge-
Abb. 2: Konzept der In-Time-Analytik der D-Serinkonzentration während der chromatographischen Melasseentzuckerung
[5].
GmbH, Frellstedt, im industriellen
Maßstab betriebene chromatographische
Verfahren zur Melasseentzuckerung
erlaubt neben der Extraktion des
Zuckers auch die gezielte Anreicherung
anderer Melasseinhaltsstoffe.
Bei diesem Verfahren wird die Melasse
durch Ionenausschluss-Chromatographie
in einzelne Fraktionen getrennt.
Bedingt durch die Säulenhöhe
ist es möglich, nach zwei Stunden
eine neue Melassecharge auf die Säule
aufzugeben, obwohl ein kompletter
Chromatographiezyklus etwa
sechs Stunden benötigt. Durch diese
Prozessführung befinden sich insgesamt
drei Trennläufe gleichzeitig auf
einer Säule und der Zyklus verkürzt
sich auf knapp zwei Stunden. Von
besonderem Interesse für die hier
dargestellten Arbeiten ist die Serin-
Fraktion [3-5].
Um diese Probleme bei der Schnittführung
zu umgehen, wurde ein biosensorisches
Verfahren an dem Prozess
etabliert, welches die Schnittgrenzen
der Serin-Fraktion in-time
und on-column ermittelt und somit
zur Prozesssteuerung eingesetzt werden
kann. Um Kreuzsensitivitäten mit
anderen Aminosäuren im Elutionsprofil
zu vermeiden, war das Enzym
D-Serin-Dehydratase in Kombination
mit Lactat-Dehydrogenase als biologische
Komponente für diesen Sensor
am besten geeignet. Dabei macht
man sich zunutze, dass unter den Bedingungen
der Zuckergewinnung das
Serin im geringen Ausmaß racemisiert.
Die Detektion erfolgt photometrisch
über das bei der Umsetzung verbrauchte
Cosubstrat NADH in einem
Durchflussphotometer bei 340 nm.
Die Abnahme der NADH-Konzentra-
legt werden, dieses ist aber durch die
geringe Änderung des Elutionsverhaltens
der Trennkolonnen zwischen
zwei Trennzyklen auch nicht zwingend
notwendig. Für eine Optimierung
des chromatographischen Prozesses
ist es ausreichend, wenn die
Analysenergebnisse in der Zeit zwischen
zwei Serin-Peaks zur Verfügung
gestellt werden können. Auf
diese Weise können die Schnittgrenzen
der jeweils nachfolgenden Fraktion
optimal gesetzt werden (s. Abb.
2). Im Vergleich zum anfänglichen
Zustand kann bei optimaler Auslegung
des Prozesses eine bis zu 60 %
höhere Produktkonzentration erzielt
werden. Daraus können bei den
nachfolgenden Aufreinigungsschritten
und der Umsetzung des Serins zu
Tryptophan weitere Einsparungen erzielt
werden.

14 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Optimierung der
Tryptophanproduktion
Bei der AMINO GmbH werden Aminosäuren
nicht nur über das beschriebene
chromatographische Verfahren
sondern auch über nachgeschaltete
Biotransformationen (enzymatische
Katalyse) gewonnen. So wird die Serin-Fraktion
durch eine biokatalysierte
Reaktion mit Indol zum Tryptophan
umgesetzt [6-11]. Die Umsetzung erfolgt
mit dem Enzym Tryptophansynthase
als Biokatalysator und Pyridoxalphosphat
als Coenzym. Für den Prozess
wird eine Wildtypmutante von
Escherichia coli eingesetzt, die das
Enzym konstitutiv überexprimiert. Der
Biokatalysator wird in der serinhaltigen
Reaktionslösung suspendiert und
das Indol im Fed-Batch-Verfahren zugegeben.
Dabei muss eine zu hohe Indolkonzentration
vermieden werden,
da sonst eine inhibierende Wirkung
die Prozesseffektivität herabsetzt. Die
Zellwände werden durch das Indol
permeabilisiert, sodass die Reaktanden
zum Enzym gelangen können. Die
Konzentrationen von Tryptophan und
Indol im Prozess werden mittels online-HPLC-Analyse
verfolgt. Ausgehend
von diesen Messwerten wird die notwendige
Indolkonzentration durch
entsprechende Dosierung aufrecht
erhalten. Nach Beendigung des Prozesses
wird die Biomasse abzentrifugiert
und kann dann erneut eingesetzt
werden. Die tryptophanhaltige Lösung
wird durch Aktivkohle und mehrmaliges
Umkristallisieren gereinigt.
Eine nicht optimale Prozessführung,
und damit verbunden eine zu
kleine Reaktionsgeschwindigkeit,
führt zu signifikanten Serinverlusten,
sodass die Indolkonzentration ständig
den aktuellen Prozessbedingungen
(Enzymaktivität, Serinkonzentration)
angepasst werden muss. Dies setzt
eine Prozessführung voraus, bei der
sämtliche Substrat- und Produktkonzentrationen
gemessen werden, um so
die gesamte Reaktionskinetik und die
variierende Biokatalysatoraktivität zu
erfassen und die Reaktandenkonzentration
dementsprechend optimal einstellen
zu können. Die hierdurch erreichbare
maximale Produktivität bei
gleichzeitiger optimaler Katalysatornutzung
und -schonung bewirkt direkt
eine Umweltentlastung und Einsparung
von Ressourcen (Energie, Substrate
etc.).
Ziel des Projekts war die Entwicklung
und der Einsatz eines innovativen
Messsystems. Damit werden aktuelle
Prozesszustände schneller erfasst
und somit die Prozessführung
Abb. 3: Schematischer Aufbau des Messsystems zur On-Coulmn-Detektion fluorogener Aminosäuren bei der
chromatographischen Melasseentzuckerung [11].
dahingehend optimiert, dass eine
maximale Raum-Zeit-Ausbeute, ein
geringer Indolverbrauch sowie eine
hohe Produktkonzentration gewährleistet
sind. Dazu wurde ein 2D-Prozessfluorimeter
an den Prozess angekoppelt
(Abb. 3), das online alle fluoreszierenden
Komponenten der Reaktionsmischung,
z. B. Tryptophan und
Indol, innerhalb kürzester Zeit erfassen
kann [12]. Mit Hilfe einer Sensitivitätsanalyse
der Spektren wurde
überprüft, welche Wellenlängenbereiche
Einfluss auf die Bestimmung der
Konzentrationsverläufe für Tryptophan,
Serin und Indol nehmen. Zur
Auswertung der 2D-Fluoreszenzspektren
wurden chemometrische Modelle
benutzt, um mit Hilfe der Spektren
die Prozessvariablen vorherzusagen.
Um die Vorhersagefehler zu minimieren,
wurden die Onlinevorhersagen
mit Hilfe eines Kalman-Filters gefiltert.
Durch diese Vorhersagen konnte der
Prozesszustand online ermittelt werden,
welches die Grundlage der Führung
eines optimierten Prozesses ist.
Die optimale Prozessführung zeichnet
sich durch eine kontinuierlich abnehmende
Indolkonzentration aus, wodurch
eine Prozessführung im Bereich
der höchst möglichen Reaktionsge-
schwindigkeit möglich wird. Aufgrund
dieses Optimierungsansatzes wurde in
den industriellen Prozess regelnd eingegriffen.
Durch die Onlinevorhersage
der Prozessvariablen wurde der
Prozesszustand bestimmt und entsprechend
einer optimalen Prozessführung
das Indol zugegeben. Die Tryptophanausbeute
kann bei optimaler
Prozessführung um bis zu 30% gesteigert
werden, der Serinverlust um 25%
gesenkt werden. Durch eine weitere
Verbesserung der Indolzugabe lassen
sich die erzielbaren Tryptophanausbeuten
weiter erhöhen. Durch die optimierte
Prozessführung wurden eine
erhöhte Produktkonzentration und
Ausbeute erreicht, wodurch die ökologisch
und ökonomisch anspruchsvolle
Aufarbeitung vereinfacht werden
konnte.
Hydrolyse mittels
Extremozymen
Kartoffelfruchtwasser (potatoe protein
liquor, PPL) ist wie Molke und Melasse
einer der landwirtschaftlichen
Reststoffe, die in Deutschland in gewaltigen
Mengen anfallen. Die jährliche
Verarbeitungskapazität von Kartoffeln
zu Stärke liegt bei ca. 3,4 Millio-
nen Tonnen. Bei dieser Aufarbeitung
fällt das PPL an, aus dem die Kartoffelproteine
isoliert werden können. Beim
gegenwärtigen Stand der Technik denaturieren
die Proteine weitestgehend
und verlieren nahezu vollständig ihre
funktionellen Eigenschaften, sodass
die Proteinisolate zurzeit nur als Viehfutter
geeignet sind. Der hohe Anteil
der essenziellen Aminosäuren Leucin,
Lysin, Valin und Phenylalanin macht
eine Weiterverarbeitung wie die Hydrolyse
zu Aminosäuren oder Peptiden
interessant. Um die Aminosäuren aus
dem Protein zu gewinnen, muss dieses
hydrolysiert werden. Stand der
Technik bei der Herstellung von Proteinhydrolysaten
sind saure Hydrolyseverfahren,
die zwar ausgereift sind,
aber neben einer schlechten Energiebilanz
auch hohe Salzfrachten verursachen.
Die sauren Hydrolyseverfahren
sind von der Umweltbelastung aus
gesehen bedenklich. Nachteilig bei diesem
Hydrolyseprozess ist außerdem,
dass die enantiomeren Reinheiten der
Aminosäuren verloren gehen. Eine alternative
Methode zur Hydrolyse von
Proteinen findet sich in der Anwendung
von Enzymen (Proteasen) [13].
Die enzymatische Hydrolyse läuft unter
moderaten Temperaturen und

Drücken ab. Der Einsatz von Chemikalien
und die damit verbundene Salzfracht
im Abwasser ist stark reduziert.
Ein weiterer Vorteil von enzymatischen
Verfahren liegt darin, dass mit Asparagin
und Glutamin Aminosäuren zugänglich
sind, die bei einer sauren
Hydrolyse zerstört werden. Ebenfalls
deutlich reduziert ist die Racemisierung
der gewünschten Produkte. Als
Enzyme werden Proteasen verwendet,
die in der Lage sind, die Peptidbindungen
zwischen den einzelnen Aminosäuren
zu spalten. Dabei werden
sowohl Endo- als auch Exoproteasen
eingesetzt.
Da bei der Verwendung von Kartoffelfruchtwasser
als Substrat die inhi-
Um die Aminosäuren aus den Hydrolysaten
zu isolieren, mussten diese
noch weiter aufgearbeitet werden.
Besonders die Peptide sollten abgetrennt
werden, da sie als Nebenprodukt
noch einen hohen Marktwert
besitzen und damit dazu beitragen,
den Prozess wirtschaftlich interessanter
zu machen. Für den industriellen
Prozess stehen für die Abtrennung Filterpressen
zur Verfügung. Im Laborversuch
wurde die Abtrennung über
Zentrifugation und anschließende
Rotationsverdampfung des Überstands
durchgeführt, um ein aufkonzentriertes
Filtrat zu erhalten. Die der Filtration
folgende Ionenausschluss-Chromatographie
lieferte eine Auftrennung
Abb. 4: Prozessschema zur Gewinnung von Aminosäuren aus Kartoffelprotein [10].
bierende Wirkung der im PPL enthaltenen
Proteinklasse der Proteaseinhibitoren
auf die eingesetzten Proteasen
zu groß war, wurde auf Kartoffelkleber
zurückgegriffen, der in der Stärkeproduktion
bei der Firma Emslandstärke
in großen Mengen anfällt. Dem
Aufbau des enzymatischen Verfahrens
lag die Idee zugrunde, dass das Protein
über einen zweistufigen Prozess
hydrolysiert wird. Im ersten Schritt
sollte eine Endoprotease die Proteine
in kleinere Bruchstücke zerteilen und
somit die Löslichkeit des Kartoffelproteins
erhöhen. Über eine anschließend
zugesetzte Exoprotease sollten
diese Bruchstücke dann weiter in die
einzelnen Aminosäuren gespalten werden.
Um optimale Hydrolyseergebnisse
zu erzielen, musste eine geeignete
Kombination von Endo- und Exoproteasen
gefunden werden, die sich auch
im industriellen Maßstab einsetzen
lässt. Als geeigneteste Kombinationen
in Hinblick auf den Hydrolysegrad
konnte die Kombination der Endoproteasen
Alcalase oder Savinase mit der
Exoprotease Flavorzym ermittelt werden.
Da die enzymatische Hydrolyse
selbst bei sehr hohen Hydrolysegraden
unter den gewählten Bedingungen
nicht vollständig abläuft, erhält
man neben den Aminosäuren fast
ebensoviel Peptide.
von Peptiden und Aminosäuren (s.
Abb. 4).
Da bei diesem Verfahren nur Wasser
als Eluent verwendet wird, zählt
es zu den umweltschonenden Methoden
der Aufarbeitung. Die gewonnenen
Peptidfraktionen der Ionenausschluss-Chromatographie
können als
Nahrungsmittelzusätze genutzt werden.
Die Aminosäurefraktion sollte als
Ausgangslösung für die schnelle Isolierung
von Aminosäuren mit Zeolithen
dienen. Anhand von Untersuchungen
an Modellgemischen, konnte
prinzipiell gezeigt werden, dass ein
solches Verfahren für einzelne Aminosäuren
möglich ist.
Bei der wirtschaftlichen Bewertung
der enzymatischen Hydrolyse zeigte
sich, dass vor allem in der höheren
Qualität der Koppelprodukte der enzymatischen
Hydrolyse Ertragspotentiale
liegen, die das der sauren Hydrolyse
um ein Vielfaches übersteigen.
Letztlich wird dadurch die Rentabilität
des enzymatischen Prozesses
stark erhöht und die Vorteilhaftigkeit
gegenüber der sauren Hydrolyse
steigt. Auch für die ökologischen Faktoren
bei der Aminosäuregewinnung
ergibt sich bei der Einführung der
enzymatischen Hydrolyse von Kartoffelfruchtwasser
eine deutliche Verbesserung.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
15
Zusammenfassung
Bei einer industriellen Umsetzung solcher
Verfahren müssen natürlich auch
unter dem Gesichtpunkt der zunehmenden
Globalisierung der Wirtschaft
die zu leistenden Investitionen zum
Aufbau der Verfahren stark gewichtet
werden. Was nützt ein ökologisch ausgewogenes
Produktionsverfahren,
wenn der hiesige Anbieter durch billigere,
eventuell auf Umwelt unverträglichem
Wege hergestellte Konkurrenzprodukte
aus anderen Ländern vom
Markt gedrängt wird? Im Falle der Kartoffelproteinhydrolyse
konnte aber
aufgezeigt werden, dass der Prozess
in Hinblick auf die Kosten für den Ka-
talysator (Enzym statt Säure) zwar
deutlich kostenineffizienter erscheint,
dieser Malus durch höherwertige Koppelprodukte
aber ausgeglichen werden
kann. Durch die Integration neuer
Verfahrenschritte in die bestehenden
Produktionswege werden neue
oder verbesserte Produkte zugänglich.
Durch eine effiziente Prozesskontrolle
und der damit ermöglichten Prozessregelung
können komplexe biotechnologische
Systeme wie die biokatalytische
oder fermentative Herstellung
von Aminosäuren optimal geführt
werden. Während in der universitären
Forschung hierfür schon seit langem
bioanalytische Systeme eingesetzt werden,
ist deren Einsatz in der industriellen
Praxis eher selten. Solche innovativen
Verfahren erfüllen aber sehr
eindrucksvoll die so oft geforderte
Nachhaltigkeit industrieller Verfahren
– sowohl ökonomischer als auch
ökologischer Natur. Ohne eine stetige
Weiterentwicklung biotechnologischer
Verfahrenstechniken käme diese
Entwicklung zum Erliegen.
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Collinstr.3, D-30167 Hannover
Tel.: 0511-762 2509
Fax: 0511-762 3004
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16 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
BIOPRODUKTION
Neue Wege zur Bioproduktion
pharmazeutischer Wirkstoffe mit
Corynebacterium glutamicum
� Dr. Petra Peters-Wendisch1 , Dr. Lothar Eggeling1 , Dr. Birgit Klaßen2 , Dr. Robert Faurie2 und Prof. Dr. Hermann Sahm1 1 2 Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich GmbH, 52425 Jülich, Amino GmbH, An der Zuckerraffinerie 10, 38373 Frellstedt
Viele Primärmetabolite, die als pharmazeutische
Wirkstoffe interessant
sind, stellen zentrale Stoffwechselintermediate
dar. Dies stellt besondere
Anforderungen an die gezielte
Konstruktion eines Organismus, mit
dem ein solcher Primärmetabolit
biotechnologisch produziert werden
kann. Für die Aminosäure Serin wird
daher modellhaft ein neues resourcenschonendes
Verfahren erarbeitet,
bei dem zunächst durch klassische
Mutation Produktionsstämme von
Corynebacterium glutamicum erzeugt
werden. Deren Mutationen werden
dann aber anhand hochauflösender
Techniken wie DNA-Chip-, Metabolom-
oder Stoffflussanalyse molekular
aufgeklärt, um so einen systemischen
Zugang zur Zelle zu erhalten.
Das gewonnene Wissen wird anschließend
gezielt eingesetzt, um
mittels etablierter molekularer Methoden
den Stoffwechsel zu verändern
und so einen Hochleistungsstamm
für die Produktion von Serin
zu generieren. Im Sinne eines produktionsintegrierten
Umweltschutzes
erfolgt parallel zur Stammkonstruktion
eine Optimierung der Aufarbeitung
von Serin durch Einführung einer
kontinuierlichen Ionenaustauschchromatographie.
Metabolic Engineering
Corynebacterium glutamicum wurde
als Glutamat-produzierendes Bakterium
isoliert und wird heute in großem
Maßstab für die biotechnologische
Produktion der Aminosäuren
Glutamat und Lysin eingesetzt. Im Gegensatz
zu Glutamat kann Lysin nur
durch geeignete Mutantenstämme
von C. glutamicum hergestellt werden.
Während diese Bakterienstämme
bislang weitgehend empirisch
durch Mutation und Selektion ge-
wonnen wurden, ermöglichen heutzutage
detaillierte Untersuchungen
der Stoffwechselwege und deren Regulationsmechanismen
sowie die
Aufklärung der Genomsequenz eine
gezielte Stammverbesserung mit Hilfe
gentechnischer Methoden (Metabolic
Engineering) [1].
In vorangegangenen Arbeiten
konnte durch das rationale Metabolic
Engineering des Serin-Biosynthesewegs,
des Abbaus von Serin und
der Verbesserung der Vorstufenbereitstellung
bereits ein Produktionsstamm
von C. glutamicum erzeugt
werden, der jedoch vergleichsweise
geringe Mengen Serin im Medium akkumuliert.
Obwohl durch das Meta-
bolic Engineering schon eine Reihe
von hervorragenden Aminosäureproduzenten
von C. glutamicum gewonnen
werden konnten, beinhaltet dieser
Ansatz jedoch keine Möglichkeit,
Quervernetzungen zu anderen Stoffwechselwegen
aufzudecken, die das
Gesamtsystem betreffen. Darüber
hinaus ignoriert dieser Ansatz
zwangsläufig ein Drittel der Gene des
Genoms, da deren Funktion nicht bekannt
ist und er vernachlässigt auch
die Bedeutung von sogenannten „
leaky“ Mutationen. So konnte kürzlich
gezeigt werden, dass die Expression
von nur drei Genen, teilweise mit
“leaky” Mutationen, im Wildtyp-Hintergrund
von C. glutamicum zu ei-
Abb. 1: Dreistufiges Konzept zur Gewinnung eines hocheffizienten Serin-
Produktionsstamm basierend auf der Strategie des „Inverse Metabolic
Engineering“. Stufe I: Mutagenese und Selektion (Screening nach Stämmen
mit verbesserten Eigenschaften), Stufe II: Analyse (Vergleich von
Wildtyp und undefiniertem Produzent durch DNA-Microarrays, Fluss-Analyse
und Bestimmung von Metabolit Pools), Stufe III: Synthese und Expression
(Konstruktion von Stämmen mit verbesserten Eigenschaften).
Parallele Optimierung des Downstream-Processings zur Isolierung der
reinen Aminosäure Serin.
nem Stamm führt, der bereits bis zu
100 g/l Lysin produziert [2].
Inverses Metabolic
Engineering
Das Ziel ist es daher, das bisher rational
nicht erschlossene Potenzial klassisch
gewonnener Produktionsstämme
in einem neuen, wiederum rationalen
Ansatz (Inverse Metabolic Engineering)
zu nutzen, um einen Hochleistungsproduktionsstamm
für Serin
zu erzeugen. Dazu wird eine dreistufige
Strategie verfolgt (Abb. 1). Das
Konzept sieht im ersten Schritt als
wesentliches Element ein Screening
aufgrund einer geeigneten Selektion
zur Isolierung eines Stamms vor, der
in der Lage ist, Serin auszuscheiden.
Hierzu wird zunächst ausgehend vom
Wildtyp oder einem „Low-level“-Produktionsstamm
von C. glutamicum
ein zunächst widersinnig erscheinender
Stamm geschaffen, der einen sehr
hohen Bedarf an Serin hat. Von diesem
werden aber im zweiten Schritt
Klone isoliert, die dann auch ohne
externe Zugabe hoher Serin-Konzentrationen
wachsen können. In diesem
Schritt wird also auf Mutationen selektioniert,
die zu hoher Serin-Bildung
führen. Auf dieser Stufe erfolgt
die globale Genom-weite Analyse der
evolvierten Klone mittels der DNA-
Chip Analyse zur Identifizierung veränderter
Genexpressionsmuster [3].
Als weitere globale Analyse werden
Metabolom- sowie Stofffluss-Analysen
zur Aufklärung von veränderten internen
Metabolitkonzentrationen und
Stoffflüssen durchgeführt. Dadurch
werden die mutierten Zielgene identifiziert,
deren Veränderung als Auswirkung
zu erhöhter Serin-Bildung
führen. Diese Gene werden kloniert,
sequenziert und anschließend auf
ihre Funktion hin untersucht.

Die dritte Stufe beinhaltet die gezielte
Nutzung der erhaltenen Erkenntnisse,
indem die zur Serin-
Überproduktion notwendigen Mutationen
gezielt z.B. in den Wildtyp eingebracht
werden. Dies geschieht ggf.
in Kombination mit den schon aus
den Vorarbeiten bekannten notwendigen
Veränderungen, mit dem Ziel,
durch die Kombination aller erforderlichen
Eigenschaften einen hocheffizienten
Serin-Produktionsstamm
zu gewinnen. Auf jeder Stufe der
Stammentwicklung stehen Stämme
zur Verfügung, die bereits von Beginn
des Projekts an zur Optimierung der
Fermentation und des Downstream-
Processings eingesetzt werden können.
Die Optimierung des Downstream-Processings
beinhaltet vor al-
EXTREMOPHILE
lem die Etablierung eines einstufigen
Verfahrens zur Isolierung von Serin
aus dem Fermentationsmedium über
einen kontinuierlichen Ionenaustauscher
[4].
Systembiologie zur
Bioproduktion
Dieser innovative systembiologische
Ansatz zeichnet sich dadurch aus,
dass die zunächst undefinierten Veränderungen
klassisch erzeugter Serin-Produktionsstämme
analysiert
und auf molekularer Ebene aufgeklärt
werden, und dass im Weiteren
die Mutationen, die zu diesen notwendigen
Veränderungen führen,
gezielt eingesetzt werden um definierte
Serin-Produktionsstämme zu er-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
17
halten. So sind Hochleistungsstämme
zu erwarten, bei deren Fermentation
keine Nebenprodukte anfallen, die
eine optimale Substratumsetzung aufweisen
und mit denen erheblich umweltverträglicher
Serin produziert
werden kann als es mit vorhandenen
Serin-Produktionsstämmen möglich
ist. Darüber hinaus trägt dieser Ansatz
zum besseren Verständnis der
gesamten Zelle und zur funktionellen
Charakterisierung bisher unbekannter
Gene bei.
Literatur
[1] Eggeling, L., Pfefferle, W., Sahm, H.,
In: Basic Biotechnology, Cambridge
University Press, 2. Auflage (2001),
281-303.
[2] Ohnishi, J., Mitsuhashi, S., Hayashi,
M., Ando, S., Yokoi, H., Chiai, K.,
Ikeda, M., Appl. Microbiol. Biotechnol.
58 (2002), 217-223.
[3] Lange, C., Rittmann, D., Wendisch,
V.F., Bott, M., Sahm, H., Appl.
Environ. Microbiol. 69 (2003),
2521-32.
[4] Schick, R., In: Zuckerindustrie 122
(2000), 34-38.
Korrespondenzadresse
Dr. Petra Peters-Wendisch
Institut für Biotechnologie 1
Forschungszentrum Jülich GmbH
D-52425 Jülich
Tel.: 02461-615430
Fax: 02461-612710
eMail: p.wendisch@fz-juelich.de
Umweltfreundliche Aufbereitung
von Hühnerfedern mittels
extremthermophiler Bakterien und
thermostabilen Enzymen
� Dipl.-Biotechnol. Julia Brodersen1 , Dr. Sabine Rießen2 , Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian2 , Prof. Dr. Herbert Märkl1 1 2 Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, Technische Universität Hamburg-Harburg , Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg
Bei einer jährlichen Geflügelproduktion
von etwa 800.000 t in Deutschland
fallen große Mengen von Abfallstoffen
an. Eine Komponente davon
bilden die Federn, welche zum Teil als
Bettfedern weiterverwertet werden.
Der restliche Anteil der Federn von
mehr als 20.000 t muss als Abfall entsorgt
werden, was sich für Geflügelschlachtereien
als zunehmend problematisch
darstellt. Neben der Entsorgung
in Tierkörperbeseitigungsanlagen
und der Kompostierung wird ein
Großteil zu Federmehl verarbeitet und
findet nach den EU- „Hygienevorschriften
für nicht zum menschlichen
Verzehr bestimmte tierische Nebenprodukte“
vorwiegend Einsatz als Zuschlagstoff
für die Herstellung von
Kleintierfutter. Die nativen Federn und
das Federmehl stellen allerdings mehr
Ballaststoff als hochwertiges Futterprotein
dar, da es kaum verdaulich ist.
Stand der Technik
Keratine, die wesentlichen Bestandteile
von Federn, sind eine komplexe Mischung
von unlöslichen Proteinen und
in der Natur weit verbreitet. Die strukturbildenden
Aminosäuren sind zu einem
β-Faltblatt angeordnet. Nach dem
„Twisted-sheet“-Modell bilden jeweils
zwei gegenläufige Stränge von β-Faltblatt-Ketten
(Abb. 1) eine linksdrehende
helikale Superstruktur, die
durch die hervorstehenden Seitenketten
vernetzt wird [1]. Das β-Keratin
weist eine hohe mechanische Stabilität
aber nur eine geringe Elastizität auf.
Die Stabilität, die Unlöslichkeit und
das weitgehend inerte Verhalten ge-
genüber Umwelteinflüssen sind vermutlich
auf den hohen Gehalt an intramolekularen
Cystinbrücken und
Peptidbindungen zwischen den einzelnen
Aminosäureketten zurückzuführen
[2,3]. Hierauf beruht auch die
Resistenz gegenüber den meisten Proteasen,
wie z. B. Trypsin [1]. Federkeratin
ist besonders reich an den
Aminosäuren Serin, Glutamat, Cystein,
Prolin, Leucin und Valin.
Als Futtermittelzugabe wird aus den
Abfallfedern Federmehl hergestellt.
Durch die Dampfhydrolyse oder die
Extrudierung bei hohen Scherkräften
wird die Verfügbarkeit der Proteine
durch das Aufbrechen der Disulfidbrücken
erhöht. Die chemische
Hydrolyse wird mit Wasserdampf und
bei Drücken von bis zu p = 6,9 bar
durchgeführt. Das Mehl kann jedoch
nur in Anteilen von 5% bis 8% dem
Futtermittel zugemischt werden, da
nur geringe Mengen an primär limitierenden
Aminosäuren Cystein und
Methionin enthalten sind.
Unter der Vielzahl an Produkten,
die aus Abfallfedern hergestellt werden
können, stellen Aminosäuren und
Peptide insgesamt betrachtet die wertvollsten
Erzeugnisse dar.
Zur Herstellung eines hochwertigen
Futtermitteladditivs oder hochwertiger
Aminosäuren aus Federn wird derzeit
die chemische Hydrolyse mit Salzsäure
oder Natronlauge eingesetzt [4].
Diese führt jedoch zu einem breiten
Produktspektrum, sodass eine aufwändige
Aufarbeitung erforderlich ist.
Die resultierende hohe Salzfracht im
Produktstrom ist zudem umweltbelastend.
Chemische Hydrolyseverfahren

18 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 1: Sekundärstruktur des Keratins: ß-Faltblattstruktur. 95 % der Federn
bestehen aus β-Keratin [10].
können im Übrigen zur Entstehung
unerwünschter Nebenprodukte führen,
beispielsweise zu potenziell kanzerogenen
Chlorverbindungen beim
Einsatz von Salzsäure. Nachteil der
alkalischen Hydrolyse ist der Teilabbau
der freigesetzten Aminosäuren
unter anderem durch Desaminierung
[5]. Dies führt zu einer Verminderung
der Bioverfügbarkeit der Nährstoffe
und somit zu einer Verschlechterung
der Futterqualität [6,7].
Vorgehen der
biotechnologischen
Verfahren
Eine Alternative stellen biotechnologische
Verfahren dar, bei der das
schwer zugängliche Keratin durch
spezielle Bakterien und deren Enzyme
in leicht verdauliche Peptide und
Aminosäuren gespalten wird. Die Herstellung
von Futtermittelzusätzen
durch den Einsatz von Mikroorganismen
oder ihren Enzymen hat den Vorteil,
dass bei den enzymatischen Verfahren
im Vergleich zu herkömmlichen
Prozessen weniger unerwünschte
Nebenprodukte erzeugt werden. Die
Rückstände der Fermentation sind
biologisch abbaubar; es entstehen
keine neuen Problemstoffe, die lediglich
eine Verlagerung der Entsorgungsproblematik
darstellen würden.
Im Gegensatz zu den chemischen
Verfahren werden bei einem biotechnologischen
Prozess die Federn bei
moderaten Drücken und Temperaturen
im pH-neutralen Bereich mit Enzymen
abgebaut. Es gibt mehrere
denkbare Verfahrensalternativen (Abbildung
2), bei denen der Rohstoff
Feder ohne weitere chemische Vorbehandlung
oder Zerkleinerung in die
Bausteine des Keratins, die Aminosäuren
und Peptide, gespalten wird. Entweder
wird der Abbau in vivo von extrem
thermophilen Bakterien geleistet
oder in vitro mit thermostabilen Enzymen.
In beiden Fällen wird das Keratin
zu löslichen Peptiden und Aminosäuren
umgesetzt und steht damit
als hochwertiges Futtermitteladditiv
zur Verfügung.
mophilen Organismen führen hingegen
zu einer deutlichen Absenkung der
Keimbelastung und verhindern das
Wachstum mesophiler, möglicherweise
pathogener Keime.
Bei ausreichender Thermostabilität
der Enzyme lassen sich Reaktionen bei
Temperaturen von T = 70°C und darüber
durchführen, bei denen die Gefahr
einer Kontamination durch mesophile
Organismen deutlich verringert
wird. Der Abbauprozess unter
extrem thermophilen Bedingungen
muss nicht steril geführt werden, was
den apparativen Aufwand deutlich verringert
und einen entscheidenden Vorteil
darstellt. Somit ist zu erwarten, dass
ein thermophiles Verfahren am ehesten
unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten
durchgeführt werden kann.
Ergebnisse
Auswahl geeigneter
Bakterien
Im Zuge eines Screeningprogrammes
auf den Azoren wurden thermophile
keratinabbauende Mikroorganismen
angereichert. Es konnten mehrere Organismen
isoliert werden, die in der
Lage sind, auf nativen Federn als Kohlenstoffquelle
zu wachsen. Zwei der
Abb. 2: Wege zum Ziel: Die Federn können entweder durch extremophile
Bakterien oder durch Einsatz von thermostabilen Enzymen (Proteasen) in
Aminosäuren und Peptide gespalten werden. Letztere verwandeln die Abfallfedern
in ein hochwertiges Futtermitteladditiv.
Warum extrem thermophil?
Bei der Schlachtung werden die Federn
unweigerlich mit Wasser und geringen
Mengen von Schlachtabfällen vermischt,
die einen idealen Nährboden
für Keime darstellen. Für einen mesophilen
Abbau müssten die Federn vor
dem Abbau hygienisiert werden. Der
Abbauprozess müsste weitgehend
aseptisch geführt werden. Höhere Prozesstemperaturen
von etwa 70°C mit
an diese Temperatur angepassten ther-
Isolate, Fervidobacterium pennivorans
und Thermoanaerobacter keratinophilus,
erschienen für den Abbau
von nativem Federkeratin zur Gewinnung
von Peptiden und Aminosäuren
besonders geeignet.
Der erste anaerobe Stamm, Fervidobacterium
pennivorans, ein zur
Ordnung der Thermotogales zählendes
Bakterium, welches optimal bei
70°C und pH 7,0 wächst, weist eine
hohe Protease- bzw. Keratinaseaktivität
auf [8]. So konnten native Federn
innerhalb von zwei bis drei Tagen nahezu
vollständig zu Peptiden und Aminosäuren
abgebaut werden. Die Keratinase
aus Fervidobacterium pennivorans
besitzt ein Molekulargewicht
von 130 kDa und einen isoelektrischen
Punkt von pH 3,8. Sie wurde als alkalische
Serinprotease klassifiziert, die
bei Temperaturen zwischen T = 65°C
und T = 90°C und pH-Werten von
pH 6 bis pH 12 aktiv ist und überwiegend
zellgebunden vorliegt.
Der zweite Stamm, Thermoanaerobacter
keratinophilus, ein neues thermophiles
anaerobes Bakterium [9], ist
der erste Vertreter der Gattung Thermonanaerobacter,
für den der Abbau
keratinhaltiger Fasern beschrieben
wurde. Der stäbchenförmige Organismus
wächst optimal bei 70°C und pH
7,0. An der Hydrolyse des Federkeratins
durch T. keratinophilus ist vorwiegend
ein extrazelluläres proteolytisches
Enzym beteiligt (s. Abbildung
5).
Die extrazelluläre Protease aus T.
keratinophilus ist optimal aktiv bei
85°C und pH 8,0 und besitzt eine hohe
Temperaturstabilität bei 70°C. Die
Halbwertszeit liegt bei über 2 Tagen.
Diese Temperaturstabilität bei optimaler
physiologischer Wachstumstemperatur
ist für den in vivo Abbau von
nativen Federn durch T. keratinophilus
vorteilhaft. Da die Wachstumsbedingungen
denen von F. pennivorans
sehr ähneln, könnte eine künstliche
Mischkultur für einen verbesserten
Federabbau sorgen. In diesem Fall stehen
zwei Proteasen gleichzeitig für die
Abbau zur Verfügung, die voraussichtlich
an verschiedenen Stellen das Keratin
spalten und damit den Prozess
beschleunigen könnten.
Charakterisierung des
Abbaus mit lebenden
Bakterienkulturen
Für eine Charakterisierung des Abbauverhaltens
wurden Rein- und Mischkulturen
von F. pennivorans und
T. keratinophilus eingesetzt und hinsichtlich
Substratkonzentration, einer
möglichen Kostenreduktion bezüglich
notweniger Zuschlagstoffe sowie vereinfachten
Prozessbedingungen zur
Begrenzung des apparativen Aufwands
untersucht.
Im Zuge einer Medienoptimierung
ausgehend von einem komplexen Anaerobiermedium
(Mineralsalze, Hefeextrakt,
Trypton, Reduktionsmittel,
Abb. 3) mit 1-2g/l Federn mit über
80%-igem Abbau binnen 2-3 Tagen
wurde eine für den Abbau zu löslichen
Proteinen optimale Federkonzentra

tion von 10g/l (1% Feststoffanteil) ermittelt.
Hierbei konnten bis zu 50%
innerhalb von 3 Tagen in Lösung gebracht
werden. Bei höheren Federkonzentrationen
im Bioreaktor (Abb. 4)
wurden geringere Abbaugrade erzielt.
Es wurde untersucht, ob für das Verfahren
alle Anteile des Komplexmediums
notwendig sind. Hefeextrakt
konnte ohne Umsatzeinbußen um 90%
von 5g/l auf 0,5g/l verringert werden.
Trypton ist als Medienbestandteil nicht
notwendig. Der Austausch von Hefeextrakt
durch andere Komplexbestandteile
wie Sojamehl gelang nicht.
Auf Autoklavieren und steriles Arbeiten
konnte verzichtet werden, da weder
makro- noch mikroskopisch Kontaminationen
beobachtet wurden, was
auf die hoheProzesstemperatur zurückzuführen
ist.
Die Hauptabfallmengen stellen sowohl
Federn als auch Federmehl dar.
Letzteres konnte mit Hilfe einer Mischkultur
von F. pennivorans und T. keratinophilus
mit einer Abbaurate von
15% nur schlecht abgebaut werden.
Die Zellen wuchsen nur bis zu einer
Zelldichte von 3,5x10 7 Zellen/ml. Da
Federmehl nicht nur aus gemahlenen
Federn besteht, sondern alle bei der
Verarbeitung der Hühner anfallenden
Schlachtabfälle beinhaltet, könnten
sich auch zahlreiche Stoffe, die das
Wachstum oder die Enzymaktivität inhibieren,
darin befinden.
Produktion von
thermostabilen Proteasen
für den in vitro Abbau
Da beide Keratinaseproduzenten thermophile
anaerobe Mikroorganismen
sind, ist die Enzymausbeute bedingt
durch den anaeroben Stoffwechsel
gering. Um die Umsetzung von Keratinen
zu Aminosäuren und Peptiden effektiv
durchführen zu können, ist es
erforderlich, die thermostabile Proteasen
rekombinant in mesophilen
Wirtsstämmen, wie z.B. E. coli oder
Bacillus, zu produzieren. Vorteile einer
heterologen Genexpression sind
die deutlich höheren Enzymausbeuten
in sehr gut untersuchten Systemen. Die
Klonierung in Bacillus, einem Grampositiven
Organismus, bietet im Gegensatz
zu E. coli, einem Gram-negativen
Organismus, den möglichen Vorteil
einer Sekretion der rekombinanten
Enzyme in das Kulturmedium. Im
Gegensatz zur intrazellulären Produktion
kann auf diesem Wege die Bildung
von „inclusion bodies“ oder eine toxische
Reaktion des Fremdproteins
auf die Wirtszelle vermieden werden.
Zusätzlich wird durch die Sekretion
Abb. 3: Kulturgefäße
zur Anzucht der anaerobenextremthermophilen
Bakterien
auf Komplexmedium
mit Federn für den
anschließenden Abbau
von Keratin im
Bioreaktor.
des Proteins meist eine signifikante
Produktanreicherung erzielt und ermöglicht
den Einsatz einer kontinuierlichen
Fermentation zur Produktgewinnung.
Basierend auf diesen Erkenntnissen
wäre die Klonierung der keratinasekodierenden
Gene in einem sekretorischen
System vorteilhaft. Bisher
konnten beide Proteasen aus Fervidobacterium
pennivorans sowie
Thermoanaerobacter keratinophilus
in E. coli kloniert werden. Die
Abb. 4: Versuchsanlage im 2-l-
Maßstab zum Abbau der Federn
mit lebenden Bakterien und Produktion
von thermostabilen Enzymen.
rekombinate Keratinase aus F. pennivorans
liegt jedoch nur in der inaktiven
Form vor (Kooperation: Prof. W.
de Vos, Kluskens et al., 2002). Die rekombinante
Protease aus T. keratinophilus
wird derzeit weiter charakteri-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
19
siert. Zusätzlich wird die Klonierung in
Bacillus megaterium in Kooperation
mit Prof. Jahn (Institut für Mikrobiologie,
TU Braunschweig) angestrebt.
Gesteigerte Raum-Zeit-
Ausbeuten durch direkten
Enzymeinsatz
Vergleichend zu den Verfahren mit Enzymen
aus den thermophilen Mikroorganismen
wurde der Abbau von Federn
und Federmehl auch mit käuflichen
Proteasen untersucht. Es konnten
zwei käuflich erhältliche Proteasen
(Alkalase und Erha) für den Abbau
bei 60°C eingesetzt werden. Die
aus dem Handel bezogenen Proteasen
besitzen bei 60°C eine Halbwertszeit
von nur 0,2 und 5 Stunden. Die Protease
von T. keratinophilus hingegen
weist mit einer Halbwertszeit bei 70°C
von mehr als 50 h eine 10fach höhere
Temperaturstabilität auf und ist
damit für die Zielsetzung des umweltschonenden
Federabbaus geeignet.
Von 25g/l Federn wurden mit ausschließlich
Wasser und im Handel erhältlichem
Enzym 16% binnen 24h in
Lösung gebracht. Die Zugabe von Reduktionsmitteln
erbrachte eine Steigerung
auf 25%. Die Präsenz von 50 mM
Phosphatpuffer (pH 8) steigerte den
Abbau auf 80% bei 25g/l Einwaage.
Wurde die Menge der Federn auf
100g/l vervierfacht, ließen sich 20 %
lösen.
Zum Vergleich: Mit der thermostabilen
Protease aus T. keratinophilus
Abb. 5: Elektrophoretische
Auftrennung der
extra- und intrazellulären
Proteasefraktionen
aus Thermoanaerobacter
keratinophilus im
SDS-Polyacrylamidgel
(9%ig). Das im Gel vorliegende
Federmehl
konnte durch keratinolytisch
aktive Proteine in
einem anschließenden
Inkubationsschritt bei
70°C und pH 7,0 hydrolysiert
werden. Nur in der extrazellulären Enzymfraktion wurden keratinolytisch
aktive Proteine nachgewiesen (siehe Pfeil).
konnte ein Umsatz in Gegenwart von
Reduktionsmittel und Puffer von 55%
bei 25g/l Federn und sogar von 37 %
bei 100g/l nachgewiesen werden.
Fazit
Aufgrund der im Vergleich mit käuflichen
Proteasen 10-fach höheren Temperaturstabilität
ist die Protease aus
T. keratinophilus gut für einen umweltschonenden
Federabbau geeignet.
Ziel ist es, in nächster Zeit ausreichende
Mengen des rekombinanten Enzyms
herzustellen und dieses für die
Verfahrensentwicklung zur Verfügung
zu stellen. Nach einer erfolgreichen
Klonierung in einen Produktionsstamm,
der die Protease ins Medium
sekretiert, bedarf es dazu einer weiteren
Produktionsoptimierung im größeren
Maßstab. Weiterhin wird die rekombinante
Protease charakterisiert,
und Ihre Eigenschaften werden mit
denen der Protease aus dem Wildtypstamm
verglichen.
Literatur
[1] Fraser, R.D.B., MacRae, T.P., Rogers,
G.E. (1972): Keratins – Their Composition,
Structure and Biosynthesis.
Charles C. Thomas Publ. Springfield,
Ill. U.S.A.
[2] Crewther, W.G., Dowling, L.M., J. Text.
Inst. 51 (1960), T775.
[3] Harding, H. W. J.,Rogers, G.E., Biochem.
10 (1971), 624.
[4] Hoppe, B., Martens, J., Chemie in
unserer Zeit 18 (1984), 73-86.
[5] Voet, D., Voet, J. G., Biochemistry. 2.
Aufl. John Wiley & Sons, Inc., New
York (1995), 58-59.
[6] Papadopoulos, M. C., Agric. Wastes
14 (1985), 275-290.
[7] Papadopoulos, M. C., Biol. Wastes 29
(1989), 123-138.
[8] Friedrich, A., Antranikian, G., Appl.
Environ. Microb. 62 (1996), 2875-
2882.
[9] Riessen, S., Antranikian, G., Extremophiles
5 (2001), 399-408.
[10] Karlson, P. Kurzes Lehrbuch der Biochemie.
12. Aufl. Georg Thieme Verlag,
Stuttgart (1984), 39-40.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr.-Ing. Herbert Märkl
Bioprozess- und
Bioverfahrenstechnik
TU Hamburg-Harburg
Denickestr. 15
D-21071 Hamburg
Tel.: 040-42878 3017
Fax: 040-42878 2909
eMail: maerkl@tu-harburg.de

20 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
ABWASSERREINIGUNG
Aerobe thermophile Reinigung
fetthaltiger Abwässer der
Lebensmittelindustrie mit
Bacillus thermoleovorans
� Dipl.-Biol. Matthias Krüger1 , Dipl.-Ing. Ingo Reimann1 , Prof. Dr.-Ing. Herbert Märkl1 , Dr. Jörg Taube2 , Dipl.-Ing. Wolfgang Eckert2 1 2 Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, TU Hamburg-Harburg, Fa. Rauschert Verfahrenstechnik GmbH, Steinwiesen
Im Mittelpunkt eines Forschungsvorhabens an der TU Hamburg-Harburg stand die Entwicklung eines neuen leistungsstarken Verfahrens zur Reinigung
fetthaltiger Abwässer aus der Lebensmittelindustrie unter Einsatz des aerob thermophilen Bakteriums Bacillus thermoleovorans IHI-91 sowie einer Zellrückhaltung
durch Membranfiltration. Nach Vorversuchen im Labor konnte durch kontinuierliche Experimente im Pilotanlagenmaßstab die Leistungsfähigkeit
des Verfahrens unter Beweis gestellt werden. Bei einer hydraulischen Verweilzeit von 3 bis maximal 8 Stunden und einer daraus resultierenden
mittleren CSB-Raumbelastung von 2,5 g l -1 h -1 und Fett-Raumbelastung von 1,7 g l -1 h -1 konnte eine CSB-Eliminationsrate von mehr als 90 % erreicht werden.
Die Zelldichte betrug hierbei 8 x 10 8 Zellen ml -1 entsprechend 0,62 g Trockensubstanz ml -1 . Durch die hohe mikrobielle Reinigungsleistung ergibt sich
ein kompaktes Anlagendesign. Der Betreuungsaufwand ist vergleichsweise gering.
Keywords: Reinigung, Fett, Abwasser, Mikrofiltration, Pilotanlage, Bacillus thermoleovorans.
Problemstellung
Fetthaltige Abläufe aus der Lebensmittelindustrie
stellen für die Abwassertechnik
nach wie vor ein ungelöstes
Problem dar, weil Fette wegen ihres
hydrophoben Charakters und hoher
Schmelzpunkte schlecht bioverfügbar
sind und durch mesophile biologische
Verfahren nur eine unzureichende
Abbauleistung erreicht werden
kann. Das in Abwässern der Lebensmittelbranche
oftmals emulgierte Fett
kann durch die konventionellen physikalisch-chemische
Verfahren nicht
zufriedenstellend abgetrennt werden.
Darüber hinaus fallen nicht verwertbare
Schlämme an, die oft einer Verbrennung
oder Deponierung zugeführt
werden.
Ziel eines durch die DBU finanzierten
Forschungsprojekts an der TU
Hamburg-Harburg war die Entwicklung
eines neuen leistungsstarken Verfahrens
zur thermophilen Reinigung
fetthaltiger Abwässer. Zum Einsatz
kam das aerob thermophile Bakterium
Bacillus thermoleovorans IHI-
91. Dieser Mikroorganismus wächst
bei einer Temperatur von 65°C optimal.
Dieses bietet die Möglichkeit,
biologische Reinigungsverfahren bei
höheren Temperaturen durchzuführen,
da die Enzyme zum einen bei
höheren Temperaturen besonders
aktiv sind und gleichzeitig das Substrat
- in diesem Fall die Fette des Abwassers
- dann erst in entscheidenden
Mengen bioverfügbar wird. Im Mittelpunkt
dieses Projekts stand unter Mitwirkung
des Industriepartners, der
Firma Rauschert Verfahrenstechnik,
die Umsetzung vielversprechender
Vorarbeiten im Labor in einen technisch
nutzbaren Prozess. Das Konzept
beinhaltet neben dem mikrobiellen
Fettabbau die Anwendung von Membranen
zur Rückhaltung von Biomasse
im Reaktor. Durch den geplanten
Einsatz geeigneter Nachbehandlungsverfahren
kann das gereinigte Abwasser
im Sinne eines produktionsintegrierten
umweltschonenden Verfahrens
wiederverwendet werden.
Material und Methoden
Der Mikroorganismus.
Bacillus thermoleovorans IHI-91
wurde aus einer Wasserprobe einer
heißen isländischen Quelle isoliert
[1] und ist aus humanpathogener
Sicht völlig unbedenklich. Es handelt
sich um ein katalase-positives, stäbchenförmiges
Bakterium, das in der
Lage ist, terminale ovale Endosporen
zu bilden. Das neuisolierte Bakterium
ist obligat thermophil, es wächst
innerhalb eines Bereichs von 37°C
bis 75°C mit einem Temperaturoptimum
bei 65°C. Im pH-Bereich 5 bis
7,5 ist das Wachstum gut, unterhalb
von pH 4 und oberhalb von pH 8 findet
kein Wachstum statt. Die Toleranz
gegenüber hohen Salzkonzentrationen
ist begrenzt. Bei 2% (w/v) NaCl
ist kein Wachstum mehr feststellbar.
Eine Beschreibung der kinetischen
Parameter findet sich bei Becker et
al. [2].
Abwasserdaten
Im Rahmen des Projekts wurde die
Anwendbarkeit des Verfahrens anhand
diverser Abwässer, z. B. der fischver-
Tab.1: Charakteristische Abwasserdaten des untersuchten Abwassers.
Parameter Laborexperiment Pilotexperiment
Mittelwert Bereich Mittelwert Bereich
pH (20°C) [-] 7,3 6,0 – 9,3 - -
CSB [mg/l] 4500 2300 - 5800 10400 3600 - 21300
Lipophile Stoffe [mg/l] 500 160 - 910 1000 500 - 3000
arbeitenden Industrie, der Speiseölproduktion,
einer Großküche, der
Fleischgewürz- und der Fertigsuppenherstellung,
untersucht (Daten nicht
dargestellt). Die Experimente zur Reinigung
des Abwassers aus der Fleischgewürzherstellung
sollen hier näher
vorgestellt werden. Sie stammten aus
der Produktion von Marinaden und
Würzölen, wobei ein entsprechend
fetthaltiges Abwasser anfällt.
Die Abwasserproben für die Laborexperimente
wurden hinter dem vorhandenen
Fettabscheider entnommen
und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Problematisch für eine repräsentative
Probenahme waren die großen
Schwankungen der Abwasservolumenströme
und -zusammensetzungen,
die durch die chargenweise Produktion
und nachfolgende Reinigungsprozesse
(Cleaning-In-Place)
zustande kamen. Die mittlere Zusammensetzung
sowie der Schwankungsbereich
der verwendeten Abwässer
sind in Tabelle 1 angegeben.
Das verwendete Abwasser für die
Experimente im Pilotmaßstab wurde
diskontinuierlich nach einem Fettabscheider
aus einem Beruhigungstank
entnommen. Die mittlere CSB-Konzentration
lag bei 10,4 g l -1 mit einem
Schwankungsbereich von 3,6 -
21,3 g l -1 . Eine eindeutige Ursache,

Abb. 1a: Schematischer Versuchsaufbau für eine kontinuierliche Abwasserreinigung
im 2-Liter-Folienfermenter mit Zellrückhaltung durch Ultrafiltration
(Trenngrenze: 150 kDa) mit einem externen Modul. Permeat-, Entlüftungs-
und Kreislaufpumpe, Keramikmembranmodul, Folienfermenter,
Substrat-, Säure- und Basepumpe, Substratflasche und Steuereinheit für
den Fermenter.
warum diese Werte damit deutlich
über denen aus den Probenahmen für
die Laborversuche lagen, die von der
gleichen Anfallstelle stammten, konnte
nicht ermittelt werden.
Versuchsaufbau und -
durchführung
Laborexperimente
Für Versuche im Labormaßstab wurde
ein 2-Liter-Folienfermenter der Firma
Bioengineering eingesetzt. Eine
gute Durchmischung konnte über
Scheibenrührer bei einer Drehzahl
von 1000 bis 1200 rpm erreicht werden.
Das Medium wurde mit Luft begast
und die Gelöstsauerstoffkonzentration
gemessen. Die Begasungsrate
ist dabei so eingestellt worden, dass
keinesfalls 20 % der Luftsättigung im
Reaktor unterschritten wurden. Dazu
war bei den erreichten Zelldichten
maximal eine Begasungsrate von 0,3
vvm erforderlich. Das den Reaktor
verlassende Abgas wurde durch einen
Rückflusskühler geleitet, um Verdampfungsverluste
zu minimieren.
Neben der Temperatur wurde auch
der pH-Wert automatisch geregelt. An
den Rührkesselreaktor war zur Zellrückhaltung
extern ein Modul mit einer
keramischen Ultrafiltrationsmembran
mit 95,2 cm 2 Filterfläche
und 150 kDa Trenngrenze angeschlossen
(Firma Tami). Dieses wurde
im Kreislauf durchströmt. Über
eine Füllstandsregelung wurde die
Permeatpumpe angesteuert. Die Zu-
laufpumpe lief kontinuierlich. Das
Abwasser wurde in einer Vorratsflasche
für eine homogene Mischung
permanent gerührt und zur Bilanzierung
gewogen. Eine schematische
Darstellung des Versuchsaufbaus findet
sich in Abbildung 1a, ein Foto der
Versuchsanlage in Abbildung 1b.
Die kontinuierlichen Experimente
wurden begonnen, indem zunächst
eine Batch-Fermentation mit einem
Mineralmedium [3] und Olivenöl als
Substrat durchgeführt und gegen
Ende der exponentiellen Wachstumsphase
auf einen kontinuierlichen Betrieb
umgestellt wurde. Während eines
kontinuierlichen Experiments
wurden neben den online Messwerten,
wie pH-Wert, Temperatur und Gelöstsauerstoffkonzentration
zusätzlich
offline Zelldichte und Lipaseaktivität
sowie CSB- Werte und Fettgehalte von
Substrat, Reaktorinhalt und Permeat
gemessen. Zunächst wurde ohne Zellrückhaltung
bei hoher hydraulischer
Verweilzeit im Reaktor gearbeitet,
d. h. das System arbeitete ohne Einsatz
des Ultrafiltrationsmoduls als
kontinuierlich durchströmter Rührkessel.
Hierbei wurde überprüft, ob
ein ausreichender Reinigungserfolg,
ggf. auch ohne Modul, zu erreichen
wäre. Durch die zu Beginn lange hydraulische
Verweilzeit von 29 h wurde
ein Ausschwemmen der Mikroorganismen
verhindert. Die Verweilzeit
wurde daraufhin stufenweise verringert
und jeweils über den Zeitraum
von mindestens drei Verweilzeiten
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
21
Abb. 1b: Foto der Versuchsanlage für eine kontinuierliche Abwasserreinigung
im 2-Liter-Folienfermenter mit Zellrückhaltung durch Ultrafiltration
(Trenngrenze: 150 kDa) mit einem externen Membranmodul. Nicht abgebildet
sind die Füllstandsregelungstechnik und der Ablauf.
konstant gehalten. Schließlich wurde
der externe Ultrafiltrationskreislauf
zur Zellrückhaltung eingeschaltet.
Hierdurch war eine erhebliche Steigerung
der Reinigungsleistung sowohl
durch die erhöhte Zelldichte als
auch durch den Rückhalt des Fetts
durch die Ultrafiltration möglich.
Aerobe Behandlung im
Pilotmaßstab
Die Laborvorarbeiten dienten zur
Übertragung des Verfahrens in den
Pilotmaßstab. Hierzu wurde in Zusammenarbeit
mit der Firma Rauschert
Verfahrenstechnik GmbH eine
mobile Pilotanlage konzipiert, von
der Firma Rauschert gebaut und im
Vor-Ort-Einsatz betrieben. Aufgrund
der Dringlichkeit der Abwasserbehandlung
und dem daraus folgenden
Interesse des Anwenders sowie der
positiven Laborresultate wurde als erster
Anwendungsfall das Abwasser
der Fleischgewürzherstellung ausgewählt.
Die mobile, komplett in einen 20″-
Standard-Container eingebaute Pilotanlage
war vom Verfahrensschema (s.
Abb. 2a) weitgehend identisch mit
der Laboranlage. Aus einem gerührten
Vorlagebehälter wurde das zu behandelnde
Abwasser in einen elektrisch
beheizten Rührkessel aus Edelstahl
mit ca. 135 l aktivem Reaktorvolumen
gefördert. Im externen
Kreislauf waren zwei Rohrmodule
(Firma Atech Innovations GmbH) mit
19-Kanal-Membranen aus Alumini-
Abb. 2a: Fließschema der mobilen Pilotanlage der Fa. Rauschert Verfahrenstechnik
mit 135 l Arbeitsvolumen und Rohrmodulen (Trenngrenze: 0,04
µm, Gesamtfläche 0,716 m 2 ) zur Zellrückhaltung.

22 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 2b: Fotos der mobilen Pilotanlage der Fa. Rauschert Verfahrenstechnik.
(a) Blick in den geöffneten Container, im Hintergrund der Reaktorraum,
(b) Blick in den Reaktorraum, im Vordergrund der Reaktor, am Boden
die Kreislaufpumpe und darüber eines von zwei Ultrafiltrationsrohrmodulen.
umoxid mit 6 mm Kanalquerschnitt,
ca. 0,358 m 2 Filterfläche je Element,
und einer Trenngrenze von 0,04 µm
in Reihe geschaltet. Hieraus ergab
sich eine relative Filterfläche von
5,3 m 2 m -3 . Die transmembrane
Druckdifferenz betrug ca. 4,5 bar. Die
Filter wurden in Intervallen mit
Druckluft bzw. chemisch mit Natronlauge
zurückgespült (s. Abb. 2b). Die
Begasung des Reaktors erfolgte mit
Druckluft mit bis zu 1 vvm. Die Abluft
wurde über einen Biofilter gereinigt.
Eine pH-Regelung erfolgte mit
Natronlauge. Gegebenenfalls wäre
auch eine Säuredosierung möglich
gewesen, genauso wie Schaumbildung
über eine Anti-Schaumdosierung
hätte bekämpft werden können.
Ein Prozessleitsystem überwachte die
gesamte Anlage, steuerte alle Pumpen
an und sorgte für die Datenaufzeichnung.
Die Probenahme von Zu- und
Ablauf sowie vom Reaktorinhalt erfolgte
manuell. Die Zelldichtebestimmung
erfolgte wie im Labormaßstab
durch Auszählen am Mikroskop.
Analytische Methoden
Die Bestimmung der Lipaseaktivität
erfolgte durch einen Test, der auf einer
Methode von Sigurgisladottier et
al. [4] basiert. Es handelte sich dabei
um einen photometrischen Assay
mit dem chromogenen Substrat p-Nitrophenyllaurat.
Die Messung der CSB-Werte erfolgte
mit Dr. Lange Küvettentests (Dr.
Lange, Düsseldorf). Gesamtglührückstand
und -glühverlust wurden in Anlehnung
an DIN 38 409 H1 gemessen.
Die Bestimmung von schwerflüchtigen
lipophilen Stoffen wurde
durch zweifache Extraktion mit Tri-
chlorethylen in Anlehnung an DIN 38
409 H17 durchgeführt [3]. Die Zelldichte
wurde durch Auszählen unter
dem Mikroskop mit einer Neubauer-
Zählkammer bestimmt, da Filtrationsverfahren
zur Zelltrockengewichtsmessung
sowie die Messung optischer
Dichte aufgrund des Vorhandenseins
vieler Beiprodukte wie Seifen
und suspendierte Feststoffe ausschieden.
Ergebnisse
Laborexperimente
Bei der Anwendung des thermophilen
Verfahrens mit B. thermoleovorans
IHI-91 mit den beschriebenen
Vorteilen war zunächst zu prüfen, ob
der verwendete Mikroorganismenstamm
überhaupt in der Lage ist, auf
dem gebotenen Substrat zu wachsen
und gleichzeitig technisch sinnvolle
Umsätze zu erreichen.
In Abbildung 3 sind die Versuchsergebnisse
der Laborexperimente
dargestellt. Die kontinuierliche Fermentation
von Abwasser aus der
Fleischgewürzproduktion wurde
ohne Zellrückhaltung mit einer Verweilzeit
von 29 Stunden begonnen,
welche dann stufenweise auf 6,5 Stunden
gesenkt wurde. Im Betrieb mit
Zellrückhaltung durch Ultrafiltration
lag die Verweilzeit konstant bei 8,5
Stunden, da der transmembrane Fluss
nicht weiter erhöht werden konnte.
Zudem ist die Fett-Raumbelastung
aufgetragen. Aufgrund der verwendeten
unterschiedlich belasteten Abwasserchargen
stieg die Fett-Raumbelastung
nicht notwendigerweise mit Verringerung
der Verweilzeit an und
schwankte auch, wenn die Verweilzeit
konstant blieb.
Im Betrieb ohne Zellrückhaltung
lag die Gesamtzelldichte weitgehend
konstant im Bereich von 2 x 10 8
Zellen ml -1 . Die Lipaseaktivität war im
Mittel mit 0,1 U ml -1 gering; trotzdem
lag der Abbau des CSB bei ca. 75 %,
fiel jedoch mit Verkürzung der Verweilzeit
auf 6,5 Stunden auf 50 % ab.
Ab dem 16. Versuchstag wurde mit
Zellrückhaltung durch Ultrafiltration
mit einer Trenngrenze von 150 kDa
gearbeitet. Es war ein Anstieg der Gesamtzellzahl
auf im Mittel 4 x 10 9 ml -1
zu beobachten, d. h. eine Steigerung
um den Faktor 20. Mit der Zunahme
der Zelldichte stieg auch die Lipaseaktivität
auf einen Maximalwert von
0,9Uml -1 . Der Abbau des CSB stieg
auf durchschnittlich 90 %. Durch den
Einsatz des Membranmoduls zur Zellrückhaltung
kam es zunächst zu einem
Anstieg des CSB im Reaktor auf
einen Wert oberhalb des Zulauf-CSB.
Diese Konzentration blieb aber nach
2 Tagen auf einem Niveau von 4500
mg l -1 konstant. Ab dem zweiten Tag
des Betriebs mit Zellrückhaltung ist
also ein stationärer Zustand erreicht
worden, d. h. die Differenz zwischen
CSB im Zulauf und CSB im Permeat
wurde vollständig mikrobiell abgebaut;
es fand keine weitere Anreicherung
im Reaktor statt. Die CSB-Raumbelastung
schwankte um den Wert
von 300 mg l -1 h -1 , die CSB-Abbauleistung
lag im Mittel bei 200 mg l -1 h -1 ,
sie stieg sogar auf einen Maximalwert
von 540 mg l -1 h -1 (Werte nicht dargestellt).
Der Fettabbau war bei Betrieb mit
Zellrückhaltung vollständig, da im
Rahmen der Messgenauigkeit kein
Fett im Permeatstrom nachgewiesen
werden konnte. Messungen ergaben,
dass es im Reaktor, insbesondere
auch bei Einsatz des Membranmoduls,
nicht zu einer Fettanreicherung
kam. Ohne Zellrückhaltung lag der
Fettabbau im Mittel bei 50 % (Werte
nicht dargestellt). Der CSB des Per-
Abb. 3: Versuchsdaten einer aerob-thermophilen Behandlung von Abwasser
einer Fleischwürzfabrik im 2 l-Folienfermenter. Ab dem 13. Versuchstag
(s. gepunktete Linie) wurde eine Ultrafiltrationsmodul (150 kDa; 95,2
cm 2 ) zur Zellrückhaltung eingesetzt.

meats lag bei Einsatz der Ultrafiltration
mit 150 kDa Trenngrenze bei
durchschnittlich 350 mg l -1 .
Pilotexperimente
Der Verlauf der Messwerte und der
daraus berechneten Größen ist in
Abbildung 4 dargestellt. Trotz der
CSB-Konzentrationsschwankungen
des Abwassers konnten bei hydraulischen
Verweilzeiten von 3 bis maximal
8 h und einer daraus resultierenden
mittleren CSB-Raumbelastung
von 2,5 g l -1 h -1 und Fett-Raumbelastung
von 1,7 g l -1 h -1 eine CSB-
Eliminationsrate von größer 90 %
erreicht werden. Fett- und CSB-
Raumbelastung blieben auch beim
leichten Anstieg der Zulaufkonzentration
konstant, da sich gleichzeitig
die Verweilzeit erhöhte.
Bedingt durch die höheren transmembranen
Flüsse im Pilotmaßstab
lagen die Raumbelastungswerte signifikant
oberhalb denen der Laborversuche.
Eine Fettanreicherung im
Reaktor konnte auch im Pilotmaßstab
nicht festgestellt werden. Die
mittlere CSB-Konzentration im Permeat
der Pilotanlage lag bedingt
durch die Trenngrenze von 0,04 µm
der hier verwendeten Mikrofiltration
mit 1050 mg l -1 deutlich höher als
im Laborversuch bei der verwendeten
Ultrafiltration (Trenngrenze
150 kDa) mit 350 mg l -1 . Zum Erreichen
von Brauchwasserqualität sind
daher noch weitere Verfahrensschritte
erforderlich.
Zum Testen der Dauerstabilität
des Verfahrens wurde im Rahmen
eines längeren Feiertagsstillstands
der Fabrikproduktion auch ein Ausfall
der Energieversorgung des Systems
simuliert. Wie in Abbildung 4
an der Unterbrechung der Zeitachse
ersichtlich, erreichte die Anlage
nach acht Tagen Betriebsunterbrechung
(Versuchstage 36 - 44) binnen
eines Tages wieder ihre volle
Leistung. Die Biomassesuspension
war während dieser Zeit unversorgt
im Reaktor belassen worden. Über
den gesamten Versuchszeitraum
wurde eine Zunahme der Biomassekonzentration
im Reaktor durch
kontinuierliche Verfahrensoptimierung
durch Verbesserung der Rückspülungsstrategien,Prozessleittechnik,
Begasung usw. festgestellt, obgleich
mit 8 x 10 8 Zellen ml -1 bzw.
0,62 gTS ml -1 noch längst nicht die
gleiche Zelldichte wie im Laborreaktor
mit bis zu 5 x 10 9 Zellen ml -1
bzw. 3,9 gTS ml -1 erreicht wurde.
Dass trotzdem höhere Umsatzraten
Abb. 4: Versuchsdaten einer aerob-thermophilen Behandlung von Abwasser
einer Fleischgewürzfabrik in einer mobilen Pilotanlage mit 135 l Arbeitsvolumen
und Rohrmodulen (Trenngrenze: 0,04 µm, Gesamtfläche
0,716 m 2 ) zur Zellrückhaltung. Vollständige Abschaltung der Anlage von
Tag 36 bis Tag 44.
als im Labormaßstab erzielt wurden
(mittlerer volumenspezifischer CSB-
Abbau: Labor = 0,3 g l -1 h -1 , Pilot =
2,5 gl -1 h -1 ) ist ein Indiz dafür, dass
im Pilotmaßstab der Anteil an aktiven
Zellen an der Gesamtzellzahl
deutlich höher lag.
Innerhalb von zwei Monaten Versuchsbetrieb
musste keinerlei Überschussschlamm
aus dem Pilotreaktor
entfernt werden. Für den Langzeitbetrieb
ist mindestens zur Entfernung
von Inertstoffen aus dem Reaktor
hierfür jedoch eine Möglichkeit
vorzusehen. Abhängig von der
Membranrückhaltung sowie ihrer
biologischen Abbaubarkeit sollten
grobe Partikel bereits vor dem Reaktor
abgetrennt werden.
Optimierungspotenzial besteht
noch bezüglich des Energieaufwands
für die Zellrückhaltung. Rohrmodule
benötigen aufgrund der erforderlichen
Überströmgeschwindigkeiten
eine hohe Pumpleistung. Andere
Membranwerksstoffe als Keramik
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
23
stoßen bei der Reaktorbetriebstemperatur
von 65°C an ihre Stabilitätsgrenzen.
Schlussfolgerungen
Durch Vorversuche im Labormaßstab
konnte gezeigt werden, dass
eine grundsätzliche Abbaubarkeit
von fetthaltigem Abwasser mit einem
thermophilen aeroben Verfahren erzielt
werden kann. Darauf aufbauend
wurde in Zusammenarbeit mit der
Firma Rauschert Verfahrentechnik
GmbH eine Pilotanlage konzipiert.
Die erzielten Ergebnisse in Vor-Ort-
Experimenten zeigten eine enorme
Belastbarkeit des Verfahrens im Hinblick
auf die Reinigungsleistung. Bei
einer hydraulischen Verweilzeit von
3 bis maximal 8 h und einer daraus
resultierenden mittleren CSB-Raumbelastung
von 2,5 g l -1 h -1 und Fett-
Raumbelastung von 1,7 g l -1 h -1
konnte eine CSB-Eliminationsrate
von größer 90 % erreicht werden.
Die Zelldichte betrug hierbei 8 x 10 8
Zellen ml -1 bzw. 0,62 gTS ml -1 . Durch
die hohe mikrobielle Reinigungsleistung
ergibt sich ein kompaktes Anlagendesign
sowie ein geringer Betreuungsaufwand.
Die Möglichkeit der Nutzung des
gereinigten Abwassers als Brauchwasser,
eine Optimierung der Zellrückhaltung
und die Übertragung des Verfahrens
auf andere Problemabwässer
wird Gegenstand der weiteren Forschung
sein. Eine mögliche Nische
dieses Verfahrens ist die Reinigung
relativ kleiner Volumenströme und
einer Abwasserkonzentration im Bereich
bis ca. 5.000 mg CSB/l.
Literatur
[1] Markosyan S., Becker P., Märkl H.,
Antranikian G., Extremophiles 4
(2000) 365-371.
[2] Becker, P., Abu-Reesh, I., Markosyan,
S., Antranikian, G., Märkl, H., Appl.
Microbiol Biotechnol 48 (1997) 184-
190.
[3] Becker, P., Dissertation, TU Hamburg-
Harburg (1999).
[4] Becker, P., Köster, D., Popov, N., Markosyan,
S., Antranikian, G., Märkl, H.,
Wat. Res. 33 (1999) 653-660.
[5] Sigurgisladottir, S., Konradsdottir, M.,
Jonsson, A., Kristjansson, J.K., Matthiasson,
E., Biotechnol. Lett. 15
(1993) 361-366.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr.-Ing. Herbert Märkl
Bioprozess- und
Bioverfahrenstechnik
TU Hamburg-Harburg
Denickestraße 15
D-21073 Hamburg
Tel.: 040-42878 3217
Fax: 040-42878 2909
eMail: maerkl@tu-harburg.de

24 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
ALTFETTALKOHOLYSE
Kühlschmierstoffe aus
technischen tierischen Fetten und
Altspeisefetten – Herstellung,
Technologie und Ökobilanzierung
� Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c. Jürgen Hesselbach1 , Dr.-Ing. Christoph Herrmann1 , Dr.-Ing. Ralf Bock1 , Dipl.-Geoökol. Tina Dettmer1 , Dr. rer. nat. Gerd Kley2 , Dr. rer.
nat. Peter Köcher2 , Dr. rer. nat. Rudolf Brenneis2 , Prof. Dr.-Ing. Roland Meyer-Pittroff3 , Dipl.-Ing. Oliver Falk3 , Dipl.-Geoökol. Anja Hansen4 1 2 3 Institut für Werkzeugmaschinen und Fertigungstechnik, TU Braunschweig, Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung, Berlin, Lehrstuhl für
Energie- und Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie, TU München, 4 LCE Consulting GmbH, Braunschweig.
Bei der zerspanenden Fertigung werden in den meisten Fällen Kühlschmierstoffe eingesetzt. Konventionelle Produkte bestehen in der Regel aus Mineralöl.
Diese Stoffe sind jedoch bezüglich der Arbeitsphysiologie und dem Verbrauch von endlichen Ressourcen als nicht unproblematisch anzusehen. In
einem Forschungsverbund soll nun versucht werden, diese Stoffe durch technische tierische Fette und Altspeisefette zu ersetzen. Neben der Überprüfung
der technologischen Tauglichkeit im Labor und in der Industrie werden auch unterschiedliche Herstellungsverfahren, wie die katalytische und die
enzymatische Umesterung, untersucht. Begleitend dazu werden ebenfalls die Auswirkungen des gesamten Produktlebenswegs in Form einer Produktökobilanz
ermittelt.
Keywords: Enzymatische Alkoholyse, Tierfett, Altspeisefett, Kühlschmierstoff, Umesterung, Produktökobilanz, LCA.
Problemstellung
Die bei der Zerspanung verwendeten
Kühlschmierstoffe bestehen in der
Regel aus Mineralöl mit einer Vielzahl
unterschiedlicher Additive. Diese
Kombination führt zu der bekannten
Problematik bezüglich der Arbeitsphysiologie
sowie der Entsorgung
von endlichen Ressourcen. Eine
Alternative hierzu bieten Kühlschmierstoffe
auf nativer Basis.
Nativbasierte Esterverbindungen
aus gesättigten Fettsäuren zeichnen
sich durch eine verbesserte Schmierwirkung
im Vergleich zu Mineralöl
aus. Sie sind daher für einen Einsatz
als Kühlschmierstoff besonders geeignet.
Bei Untersuchungen am Institut
für Werkzeugmaschinen und
Fertigungstechnik der TU Braunschweig
hat sich gezeigt, dass neben
einer Verlängerung der Werkzeugstandzeiten
auch Verluste durch Ausschleppungen
(Schleifschlamm,
Werkstückanhaftungen) reduziert
werden können. Trotz technologischer
Vorteile werden sie in der Praxis
kaum eingesetzt, da ihre Anschaffungskosten
weit über denen von
konventionellen Produkten auf Mineralölbasis
liegen. Durch diese hohen
basierten Kühlschmierstoffe erst
nach mehreren Jahren.
Um die Herstellungskosten zu senken,
können vermehrt Schlachtnebenprodukte
zur Schmierstoffproduktion
eingesetzt werden. Nach der
Sterilisierung in einer Tierkörperbeseitigungsanlage
werden die Fette in
die gesättigten und ungesättigten Bestandteile
getrennt. In einem weiteren
verfahrenstechnischen Schritt
können aus diesen Fraktionen durch
katalytische Umesterung sowohl Kühlschmierstoffe
(gesättigter Teil) als
auch z.B. Biokraftstoffe (ungesättigter
Teil) hergestellt werden. Hierbei
kommen unterschiedliche Alkohole
zum Einsatz.
Ein weiterer Abfallstoff sind Altspeisefette,
die sich aufgrund des hohen
Anteils an gesättigten Fettsäuren ebenfalls
für die Kühlschmierstoffherstellung
eignen. Bei diesen Stoffen wird
zur Zeit untersucht, ob neben der katalytischen
Umesterung der Ausgangsmaterialien
auch die enzymatische
Alkoholyse zu verwertbaren Schmierstoffen
führt. Erste diesbezügliche
Kosten amortisieren sich diese nativ- Abb 1: Verfahrensschema der katalytischen Umesterung.
Untersuchungen lassen auf positive
Ergebnisse hoffen.
Die Entwicklung nativbasierter
Kühlschmierstoffe aus Abfällen ist nur
durch eine interdisziplinäre Zusammenarbeit
von Forschern aus verschiedenen
Fachrichtungen möglich.
So arbeiten an diesem Vorhaben die
Bundesanstalt für Materialprüfung,
Berlin, der Lehrstuhl für Energie- und
Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie,
TU München, das Institut für
Ökologische Chemie und Abfallanalytik,
TU Braunschweig, sowie das Institut
für Werkzeugmaschinen und
Fertigungstechnik, TU Braunschweig,
sehr eng zusammen. Eine intensive
Kooperation mit der Industrie gewährleistet
die spätere praktische
Umsetzung. Hier sind vor allem die
Volkswagen AG, Wolfsburg, die
Castrol Industrieöl GmbH, Mönchengladbach,
sowie die LCE Consulting
GmbH, Braunschweig, zu nennen.
Katalytische Umesterung
In Deutschland werden im Jahr ca.
1,1 Mio. t mineralölbasierte Schmierstoffe
verbraucht. 50 % davon gelangen
systembedingt oder durch Unfälle
und Leckagen in die Umwelt. Gerade
die Gruppe der Verlust-

schmierstoffe wie z.B. Kühlschmierstoffe
gehen gebrauchsbedingt fast
vollständig verloren. Insbesondere
die in Mineralölprodukten enthaltene
Kohlenwasserstoffe sind toxisch
für Säugetiere, Fische und Bakterien.
Biologisch schnell abbaubare
Schmierstoffe verursachen dagegen
keine oder nur geringe Umweltbelastungen,
wenn sie in die Umwelt gelangen.
Als biologische Kühlschmierstoffe
finden unter anderen Alkylester natürlicher
Fettsäuren Verwendung. Üblicherweise
werden diese Produkte
durch Veresterung von Fettsäuren mit
den entsprechenden Alkoholen hergestellt.
Zu diesem Zweck muss erst
natives Fett unter hohem Temperaturund
Druckniveau in Fettsäuren und
Glyzerin gespalten werden. Anschließend
werden die Fettsäuren unter
hohem Druck und hoher Temperatur
verestert. Die gewonnenen Produkte
sind daher relativ teuer und
kaum konkurrenzfähig zu Mineralölschmierstoffen.
Andererseits werden in der Biodieselindustrie
große Mengen von Fettsäuremethylestern
zu sehr niedrigen
Kosten hergestellt. Insbesondere bei
der Verwendung von Altspeisefetten
oder technischen Tierfetten als Rohstoff
können die Herstellungskosten
dieser Methylester noch gesenkt werden.
In dem von der DBU geförderten
Projekt „Kühlschmierstoffe aus
Altspeisefetten und technischen tierischen
Fetten“ wurden daher am Lehrstuhl
für Energie- und Umwelttechnik
der Lebensmitteltechnologie auf
Altfett basierende Methylester als
Rohstoff für die weitere Umesterung
mit Alkoholen bis zu acht C-Atomen
untersucht. Im Zuge dieses Projekts
wurden als erster Schritt Umesterungsverfahren
für Altspeise- und
Tierfette zu Methylestern entwickelt
bzw. optimiert. In einem zweiten
Schritt wurde versucht, die auf diese
Weise hergestellten Methylester mit
den Alkoholen Propanol, Butanol und
2-Ethylhexanol basisch katalysiert
umzuestern. Die besten Ergebnisse
wurden dabei mit 2-Ethylhexanol erreicht.
Die folgende Abbildung (Abb.
1) zeigt ein Verfahrensschema der
Umesterung von Fettsäuremethylestern
mit längerkettigen Alkoholen.
Die Fettsäuremethylester aus der
Umesterung der Altspeise- oder Tierfette
werden zur Enfternung von Farbund
Geruchsstoffen über Kopf destilliert.
Das Destillat wird durch fraktionierte
Kristallisation in eine Olein-
und Stearinfraktion aufgetrennt.
Die Oleinfraktion kann nun ohne
weitere Behandlung als kältestabiler
Biokraftstoff verwendet werden. Die
verbleibende Stearinfraktion weist
durch ihren hohen Sättigungsgrad
eine wesentlich bessere Oxidationsstabilität
als das Ausgangsprodukt
auf. Sie muss allerdings, um die für
die Verwendung als Kühlschmierstoff
nötigen Eigenschaften, wie z.B. höhere
Viskosität und niedriger Pourpoint,
zu erlangen, noch einmal mit längerkettigen
Alkoholen umgeestert werden.
Diese Umesterung findet basisch
katalysiert unter Abtrennung des freiwerdenden
Methanols statt. Im Anschluss
finden noch Waschprozesse
zur Entfernung von Katalysatorresten
und eine Destillation zur Entfernung
von Restalkohol und -wasser statt.
Der auf diese Weise erhaltene Fettsäurealkylester
kann nach Additivierung
als biologisch schnell abbaubarer
Kühlschmierstoff eingesetzt werden.
Enzymatische
Altfettalkoholyse
In der Bundesanstalt für Materialforschung
und –prüfung (BAM) wurde
ein innovativer Lösungsansatz gefunden,
der es möglich macht, mit hohen
Umsatzraten aus (Alt)fetten und
höhermolekularen Alkoholen in einem
einstufigen enzymatischen Prozess
(Alkoholyse) Fettsäureester herzustellen
[1,2,3]. Bei der Alkoholyse
wird die Glycerol-Komponente (dreiwertiger
Alkohol) der Triglyceride
durch einwertige Alkohole substituiert:
Fett + Alkohol ➞ Ester(öl)+Glycerol
Auf Grund der in Laboruntersuchungen
(100 ml- und 1,5 l- Reaktor)
gewonnenen Erkenntnisse wurde
eine kleintechnische Anlage mit 15
l- und 100 l-Rührreaktoren installiert,
in der größere Mengen an Esterölen
hergestellt werden können.
Die Umsetzungen erfolgen im
batch- Betrieb bei Temperaturen um
60°C unter Einsatz von Novozym 868
L (Candida antarctica) der Fa. Novozymes
A/S (Bagsværd, Dänemark).
Dieses Enzym hatte sich unter mehreren
getesteten als das geeignetste erwiesen.
Als sinnvoll hat sich ein Enzymanteil
von 0,5% bis 1% bezogen auf die
eingesetzte Fettmenge herausgestellt.
Entsprechend der Reaktionsgleichung
entsteht neben dem „Ester“ (Gemisch
unterschiedlicher Fettsäureester entsprechend
dem Fettsäurespektrum
des eingesetzten Fetts) als zweite Kom-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
25
ponente Glycerol. Dieses findet sich
als Gemisch mit dem eingesetzten
Wasser, das sich für eine Aktivierung
des Enzyms und als dessen „Trägerphase“
als notwendig erwiesen hat
und dem Enzym nach Reaktionsende
und einer gewissen „Abstehzeit“ in der
unteren Phase im Reaktor wieder. Die
obere Phase enthält den Ester und
Reste des im molaren Überschuss zugesetzten
Alkohols bzw. bestimmte
Anteile an freien Fettsäuren, die durch
eine allerdings sehr langsam ablaufende
Parallelreaktion (Hydrolyse) bedingt
sind. Nach Beendigung der Separierung
dieser beiden Phasen voneinander
wird die „Esterphase“ abgezogen;
die untere wässrige Phase verbleibt
für den nächsten Ansatz im Reaktor.
Damit aber in dieser Phase der
Glycerolgehalt nicht übermäßig ansteigt
und somit die Aktivität der Enzyme
sinkt, muss nach jedem Ansatz
ein Teil des Glycerolwassers abgezogen
werden. Zwangsläufig wird mit
te, Viskosität, Flammpunkt, Pourpoint,
....) als auch spezielle anwendungsspezifische
Eigenschaften der
Ester beim Einsatz als Kühlschmierstoff
(Schleif- und Zerspanverhalten,
...) von den veresterten Fett- und Alkoholkomponenten
abhängig sind.
Weiterhin ist bekannt, dass Lipasen bei
der enzymatischen Modifikation von
Triglyceriden bestimmte Selektivitäten
aufweisen können [4]. Zur Aufklärung
möglicher Zusammenhänge wurden
deshalb systematische Untersuchungen
zur enzymatischen Alkoholyse
unter Kombination unterschiedlicher
Modellfette mit unterschiedlichen
Alkoholen (linear, verzweigt, zyklisch)
durchgeführt.
Bestimmung von
Umsatzraten
Das Zusammensetzungsspektrum der
im Gastronomiebereich eingesammelten
Altfette ergibt sich naturgemäß aus
Abb. 2: Alkoholyse von Erdnussfett (Umsatzraten mit verzweigten Alkoholen).
dem Glycerol auch ein bestimmter
Anteil des Enzyms und des Wassers
entfernt. Diese Verluste müssen dem
neuen Ansatz ergänzend hinzugefügt
werden.
Bevor jedoch in dieser Anlage die
für die Anwendungstests erforderlichen
Mengen an Esteröl hergestellt
werden, gilt es eine für den speziellen
Einsatz als Kühlschmierstoff optimale
Esterzusammensetzung zu ermitteln.
Es ist nämlich zu erwarten, dass sowohl
allgemeine physikalische (Dich-
der Bandbreite der ausgelieferten
Speisefette. Um ein breites Spektrum
möglicher Zusammensetzungen einzuschließen,
wurden als Modellfette
Erdnussfett und Olivenöl sowie
Schweineschmalz (partiell) ausgewählt:
a) Erdnussfett (= gehärtetes Erdnussöl;
hoher Anteil gesättigter bzw. trans-
Fettsäuren und geringer Anteil mehrfach
ungesättigter Fettsäuren im Fettsäurespektrum;
wird als Frittier- und
Bratfett eingesetzt).
Folgende Alkohole wurden getestet:
a) linear (lin.A) b) verzweigt c) zyklisch
1-Pentanol 2-Methyl-1-Butanol (2Me1Bu) Cyclohexanol (Cy)
1-Hexanol 3-Methyl-1-Butanol (3Me1Bu) Methylcyclohexanol
1-Heptanol 4-Methyl-2-Pentanol (4Me2Pe) (Me.Cy)
1-Octanol 2-Octanol (2Oc)
2-Ethyl-1-Hexanol (2Et1He)

26 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
b)Olivenöl (geringer Anteil gesättigter
Fettsäuren; Einsatz als Salatöl bzw.
Bratfett in mediterraner Küche).
c)Schweineschmalz (etwa gleicher
Anteil gesättigter und ungesättigter
Fettsäuren).
Um diese im 1,5 l- Reaktor durchgeführten
Untersuchungen vergleichbar
zu machen, wurden sie jeweils
bei gleichen Temperaturen (60°C),
gleichen Mengenverhältnissen der
Einsatzkomponenten (molares Verhältnis
Fett : Alkohol = 1 : 3, Fett +
Alkohol = 750 g, Wasser = 750 g,
Enzym = 1% bezogen auf Fettmenge)
und damit auch gleicher Reaktorfüllhöhe
durchgeführt. Bei den
Versuchsreihen wurde nicht mit der
Abb. 3: Alkoholyse von Schweineschmalz (Umsatzraten mit verzweigten
Alkoholen).
Abb. 4: Alkoholyse von Olivenöl (Umsatzraten mit verzweigten Alkoholen).
Abb. 5: Alkoholyse von Erdnussfett und Olivenöl (Umsatzraten mit linearen
Alkoholen).
optimalen, sondern mit einer geringeren
Rührerdrehzahl (500 U/min)
gearbeitet. Damit sind zwar die Umsatzraten
jeweils niedriger, die Ergebnisse
aber übersichtlicher und untereinander
besser vergleichbar.
Zur Ermittlung der Umsatzraten
wurden nach bestimmten Zeiten (0,5
h, 1 h, 2 h, 3 h und 4 h) Proben gezogen
und mittels HPLC analytisch ausgewertet.
Die den speziellen Ansprüchen
angepasste HPLC ist mit einer für
die Detektion von Tri-, Di- und Monoglyceriden
sowie Fettsäuren und
Monoestern empfindlichen Lichtstreudetektion
ausgerüstet.
Die Retentionszeiten der entstehenden
Ester sind vom Molekulargewicht
der eingesetzten Alkohole abhängig
und liegen in einigen Fällen teilweise
im Bereich der Retentionszeiten der
als Zwischenprodukte auftretenden
Monoglyceride, so dass eine genaue
Zuordnung nicht immer möglich ist.
Deshalb wurde als Bezugsgröße der
Restgehalt an Triglyceriden gewählt,
der sich direkt aus den prozentualen
Flächenanteilen bei den entsprechenden
Retentionszeiten ermitteln lässt.
In den Abbildungen 2 bis 6 sind die
Resultate der Untersuchungen dargestellt.
Es zeigt sich, dass offensichtlich sowohl
die Alkohol- als auch die Fettkomponenten
Einfluss auf die Geschwindigkeit
der Fettmodifikation
(Alkoholyse) haben.
Die vier getesteten linearen Alkohole
zeigen etwa gleiche Umsatzraten
und sind deshalb jeweils in einer Kurve
zusammengefasst (Abb. 5). Deutlich
höhere Umsatzraten sind mit den
verzweigten Alkoholen zu erzielen.
Hier ist insbesondere 2-Ethyl-1-Hexanol
hervorzuheben (Abb. 2 bis 4). Von
den eingesetzten zyklischen Alkoholen
weist Methylcyclohexanol (zusätz-
lich verzweigt) bessere Werte auf
(Abb. 6).
Weiterhin kann man aus den Untersuchungen
eine gewisse Spezifität
des eingesetzten Enzyms gegenüber
den in den Triglyceriden gebundenen
„Fettsäuren“ ableiten, denn die Umsetzung
von Erdnussfett läuft schneller
ab als die von Schweineschmalz
und wesentlich schneller als die von
Olivenöl.
Die Kurven der Umsatzraten von Altfetten,
die teilweise mitbestimmt wurden,
lagen jeweils zwischen denen des
Ernussfettes und des Olivenöls im Bereich
der Kurven des Schweineschmalzes.
Genauer lässt sich die Enzymspezifität
aus den aufgenommenen Spektren
(HPLC) ermitteln.
In Abbildung 7 sind beispielhaft die
aus den jeweiligen Spektren der Umsetzung
von Schweineschmalz mit 2-
Ethyl-1-Hexanol nach 0,5 sowie nach
1, 2 und 3 h Reaktionszeit ermittelten
Flächenanteile des entstandenen Stearinsäureesters,
Palmitinsäureesters,
Ölsäureesters und Linolsäureesters
(Summe auf 100% hochgerechnet)
wiedergegeben und dem mittels GC
bestimmten Fettsäurespektrum des
Ausgangsfetts (Schweineschmalz) gegenübergestellt
(Summe von Stearin-,
Palmitin-, Öl- und Linolsäure auf
100% hochgerechnet). Aus der Abbildung
wird deutlich, dass die Modifizierung
der gesättigten Stearin- und
Palmitinsäure gegenüber der einfach
bzw. zweifach ungesättigten Öl- bzw.
Linolsäure bevorzugt abläuft.
Bestimmung
physikalischer
Eigenschaften der Ester
Nach der Entnahme der letzten Probe
für die Bestimmung der Umsatz-
Abb. 6: Alkoholyse von Erdnussfett und Olivenöl (Umsatzraten mit zyklischen
Alkoholen).

aten nach 4 h wurde die Rührwerksgeschwindigkeit
erhöht, um schneller
einen vollständigen Umsatz zu erreichen.
Wenn in den HPLC-Spektren
keine Tri-, Di- und Monoglyceride
mehr nachweisbar waren, wurde das
Rührwerk abgeschaltet. Ist die Separierung
der Esterphase (oben) von
der wässrigen Glycerolphase (unten)
erfolgt, kann der Ester abgezogen und
gereinigt werden (Abdestillation von
geringen Mengen überschüssigen Alkohols,
Waschen mit Ethanolamin zur
Senkung der Säurezahl auf unter 0,3).
Nach der Aufbereitung der Ester
wurden an den klaren bis gelblichhellen
öligen Flüssigkeiten (Abb. 8)
die Flammpunkte, Dichten, kinematischen
Viskositäten (20°C und 40°C)
und die Pourpoints bestimmt.
Die Flammpunkte der hergestellten
Esteröle liegen mit jeweils über
240°C generell über denen von Mineralölen.
Deren Dauereinsatz ist auf
90 bis 120°C begrenzt, der kurzfristige
Einsatz auf 130 bis 150°C.
Die Unterschiede in den Dichten
und Viskositäten der Esteröle sind
nicht so gravierend, als das sie einen
Einfluss auf die Auswahl eines Fetts
oder Alkohols zur Herstellung
esterölbasierter Kühlschmierstoffe
hätten. Große Unterschiede gibt es
dagegen in den Pourpoints, durch die
das Kälteverhalten der Esteröle charakterisiert
wird. Sowohl Art des Alkohols
als auch Zusammensetzung
des Fetts spielen hier eine große Rolle.
Weiterführung der
Arbeiten
Auf Grund der höchsten Umsatzraten
und des niedrigsten Preises der hier
getesteten Alkohole sowie des guten
Kälteverhaltens der resultierenden
Ester wurde für die weiteren Arbeiten
2-Ethyl-1-Hexanol als Alkoholkomponente
ausgewählt.
Als Fettkomponenten für die weiteren
Untersuchungen wurden Erdnussfett
und Rindertalg mit hohen Anteilen
an gesättigten Fettsäuren sowie
Altfett festgelegt.
Aus diesen Ausgangsstoffen wurden
in der kleintechnischen Anlage der
BAM über den Prozess einer enzymatisch
katalysierten Alkoholyse größere
Mengen (jeweils ca. 45 l) der entsprechenden
Esteröle hergestellt. Die
Reaktionszeiten bis zu einer vollständigen
Umsetzung lagen bei 2h.
An den hergestellten Esterölen werden
momentan im IWF anwendungsspezifische
Parameter bei der span-
Abb. 7: Auswertung der Untersuchung zur Enzymspezifität.
Umweltwirkungsanalyse
von Kühlschmierstoffen
Inwiefern ein Produkt umweltverträglicher
ist als ein anderes, kann mittels
Umweltwirkungsanalysen untersucht
werden. Für den jeweils vollständigen
Produktlebenszyklus werden möglichst
umfassend die Umweltwirkungen, z.B.
Ressourcenverbrauch (Energieträger,
Mineralien) und auch Versauerung,
Eutrophierung, Sommersmogbildung
Abb. 8: Altfett
(links), ungereinigtes
Esteröl (Mitte)
und gereinigtes
Esteröl (rechts).
oder Treibhauseffekt, ermittelt. Aus
dem Vergleich mit den Ergebnissen zu
Alternativprodukten lässt sich dann
eine Bewertung ableiten.
Mineralölbasierte Kühlschmierstoffe
(KSS), die in der Metallverarbeitung
zur Herstellung von Werkstücken mit
hoher Oberflächenqualität bei verminderter
Werkzeugabnutzung und zur
enden Metallbearbeitung ermittelt. Abb. 9: Stoffstromnetz für Schlachtabfall- und Tierkörperverwertung.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
27
Erhöhung der Fertigungsgeschwindigkeit
eingesetzt werden, gelten gebraucht
als Sonderabfälle und sind
unter umwelt- und arbeitsphysiologischen
Aspekten kritisch zu bewerten.
Daher beschäftigen sich aktuell die
beiden zuvor beschriebenen Projekte
mit der Entwicklung von umwelt- und
arbeitsverträglicheren Alternativen auf
Basis von Tierfetten und Altfetten.
Für diese Forschungsprojekte analysiert
die LCE Consulting GmbH,
Braunschweig, in dem Vorhaben „Produktökobilanz
nichtwassermischbarer
Kühlschmierstoffe auf Basis von Mineralöl,
pflanzlichen Ölen sowie Altspeisefetten
und technischen tierischen
Fetten“ die Lebenswege von vier Kühlschmierstoffvarianten.
Einem konventionellen,
mineralölbasierten Produkt
werden auf klassische Weise kataly-
tisch erzeugte Ester auf Pflanzenöl- und
Tierfettbasis sowie ein enzymatisch hergestellter
Ester aus Altfetten gegenübergestellt.
Die Basisdaten für die tierfettbasierten
Ester liefert das Vorhaben
„Kühlschmierstoffe aus Altspeisefetten
und technischen tierischen Fetten“ und
für den enzymatisch veresterten KSS
aus Altfetten das Projekt „Enzymatische
Altfettalkoholyse zur Herstellung von
Wertstoffen“.
Die Ökobilanzierung als
Bewertungskonzept
Die Lebenswege der Kühlschmierstoffe
werden beginnend bei der Rohstoffgewinnung
über die Herstellung
des Grundöls, ggf. einer Additivierung,
dem Einsatz in der Fertigung bis
hin zur Verwertung bzw. endgültigen
Entsorgung untersucht. Neben den
zahlreichen Vorketten, d.h. den zur
weiteren Herstellung benötigten Vorprodukten
und Energieträgern finden
auch Praxisdaten aus einem Dauerversuch
bei der Volkswagen AG Berücksichtigung
in der Lebenswegbilanzierung.
Der Vergleich der Kühlschmierstoffe
erfolgt anhand der Umweltwirkungen,
die beim Schleifen
von 1000 Werkstücken entstehen.
Das Vorhaben soll durch den Vergleich
der Umweltwirkungen ermitteln,
ob Kühlschmierstoffe auf Tierfettbasis
als umweltverträglicher zu
bewerten sind als die mineralölbasierten
Alternativprodukte.
Literatur
[1] Brenneis, R., Köcher, P., Kley, G.,
Baeck, B., Schwilling, T., Müll und
Abfall 34 (2002), 244-248.
[2] Simon, F.G., Brenneis, R., Köcher, P.,
6th World Congress on Integrated
Ressources Management R‚02, 12.-
15.02.2002, Genf.
[3] Brenneis, R., Baeck, B., Köcher, P.,
Kley, G., Reger, C., Enzymes in Lipid
Modification, 26.-28.03.2003, Greifswald.
[4] Bornscheuer, U.T. (Hrsg.), Enzymes
in Lipid Modification, WILEY-VCH
(2000).
Korrespondenzadresse
Dr.-Ing. Ralf Bock
Institut für Werkzeugmaschinen und
Fertigungstechnik
TU Braunschweig
Langer Kamp 19b
D-38106 Braunschweig
Tel.: 0531-391 7611
Fax: 0531-391 5842
eMail: r.bock@tu-bs.de

28 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
KAUTSCHUKVERWERTUNG
Entwicklung eines
biotechnologischen Verfahrens
zur stofflichen Wiederverwertung
kautschukhaltiger Rest- und
Abfallstoffe
� Dipl.-Biol. Matthias Arenskötter1 , Dipl.-Biol. Dirk Baumeister1 , Dipl.-Biol. Daniel Bröker1 , Dr. Udo Hölker2 , M.Sc. Ebaid M. A. Ibrahim1 , Dr. Jürgen Lenz2 ,
Dipl.-Biol. Karsten Rose1 , und Prof. Dr. Alexander Steinbüchel1* 1 2 Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westfälische-Wilhelms-Universität Münster, bioreact GmbH, Bonn
Die Jahresproduktion von Kautschuk betrug im Jahr 2000 17,3 Mio. Tonnen. Zur Verwertung der daraus resultierenden Abfälle wird an der Entwicklung
eines biotechnologischen Verfahrens gearbeitet, um verschiedene Kautschuk-haltige Abfallstoffe wieder dem Stoffkreislauf zuzuführen. Neben der Akkumulation
technisch nutzbarer Polymere durch Kautschuk-abbauende Bakterien wird die Produktion chemisch interessanter Substanzen angestrebt, welche
als Rohstoffe für chemische Synthesen oder biotechnologische Produktionsprozesse Verwendung finden können. Da der mikrobiologische Kautschukabbau
bisher nur wenig verstanden wird, ist eine Analyse der Abbau- und Zwischenprodukte wichtig. Mittels GPC-Analysen konnten Zwischenprodukte
unterschiedlicher Molekulargewichte nachgewiesen werden, deren chemische Struktur in Zukunft aufgeklärt werden muss. Zudem besteht
Interesse daran, die bei der Vulkanisation von Kautschukprodukten entstehenden Schwefelbrücken, welche die Materialeigenschaften der Produkte dauerhaft
fixieren, durch den Einsatz von Mikroorganismen zumindest teilweise rückgängig zu machen, um einen größeren Anteil an Altreifengranulat rezyklisieren
zu können. Ziel ist eine effiziente Umsetzung der Substrate in Feststoffbioreaktoren. Außerdem wurden thermophile Mikroorganismen isoliert
und charakterisiert, welche in der Lage sind, Kautschuk als alleinige Kohlenstoffquelle zu verwerten, da diese gegenüber mesophilen Bakterien Vorteile
bieten können.
Keywords: Kautschukabbau; Feststofffermentation; cis-1,4-Polyisopren; Thermophile, GPC.
Einleitung
Naturkautschuk (natural rubber, NR)
ist Bestandteil des Milchsafts vieler
Dikotyledonen, von denen der Kautschukbaum
(Hevea brasiliensis) der
ökonomisch bedeutendste Vertreter
ist. Aber auch viele einheimische
Pflanzen wie Löwenzahn oder Feldsalat
synthetisieren Kautschuk in einem
nicht zu vernachlässigenden Umfang.
NR ist das cis-Isomer des Polyisoprens
(cis-1,4-Polyisopren) und findet Verwendung
bei der Herstellung von über
40.000 Produkten, darunter auch
mehr als 400 aus dem medizinischen
Bereich. Seit Mitte des vorherigen
Jahrhunderts wird der stetig steigende
Bedarf an Kautschuk zudem durch
die chemische Synthese von Isoprenkautschuk
(IR) gedeckt. Neben diesen
stehen je nach Produktanforderung
auch andere chemisch synthetisierte
Kautschuke zur Verfügung, wie
z.B. Styren-Butadienkautschuk. Weltweit
betrug die Produktion im Jahr
2000 6,4 Mio. Tonnen Naturkautschuk
und 10,9 Mio. Tonnen Synthesekautschuk
[1].
Zwangsläufig fallen große Menge an
kautschukhaltigen Abfällen an. Diese
werden bislang großteils der thermischen
Verwertung zugeführt oder auf
Deponien endgelagert. Den Hauptanteil
an diesen Abfällen machen Autoreifen
aus; in den USA werden derzeit
2-3 Mrd. Autoreifen deponiert [2], in
Deutschland fallen jährlich 600.000
Tonnen Altreifen an.
Obwohl der mikrobiologische Abbau
von Kautschuk bereits lange untersucht
wird, ist bislang praktisch
nichts über die biochemischen und
molekularbiologischen Grundlagen
bekannt. Bereits zu Beginn des vorherigen
Jahrhunderts gelang die Isolierung
von Mikroorganismen, welche
in der Lage waren, NR als Kohlenstoffquelle
zu verwerten [3]. Heute werden
Mikroorganismen anhand ihres
Abbauverhaltens von Kautschuk in
zwei Gruppen eingeteilt [4]: Die er-
ste Gruppe hat die Eigenschaft, auf
latexhaltigen Festmedien Kautschuk
angreifende Enzyme auszuscheiden
und Klärhöfe auszubilden. Es handelt
sich dabei um Mycel-bildende Actinomyceten
der Gattungen Actinoplanes,
Micromonospora und Streptomyces
[5]. Vertreter der zweiten Gruppe hingegen
benötigen den direkten Kontakt
zum Substrat. Sie bilden keine Klärhöfe,
sondern wachsen adhäsiv auf
dem kautschukhaltigen Substrat und
bilden dort einen Biofilm. Zu dieser
Gruppe zählen Vertreter der Gattungen
Gordonia, Mycobacterium und
Nocardia [6]. Die adhäsiv wachsenden
Bakterien sind in der Regel die
potenteren Kautschukabbauer.
Ergebnisse
Isolierung thermophiler
Kautschuk-abbauender
Bakterien
Thermophile Bakterien können für
den Einsatz biotechnologischer Ver-
fahren Vorteile gegenüber mesophilen
bieten. Diese liegen besonders in einer
geringeren Gefahr der Kontamination,
sodass oft ein geringerer Aufwand
für die Kultivierung betrieben
werden muss. Dieser Umstand wirkt
sich gerade auf Fermentationen über
größere Zeiträume aus, wie sie derzeit
für die Umsetzung von Kautschukmaterialien
noch benötigt werden.
Des Weiteren muss davon ausgegangen
werden, dass Enzyme aus Thermophilen,
welche in den Abbau von
Kautschuk involviert sind, vergleichsweise
thermostabiler sind und auch
für in vitro Umsetzungen in einem
breiteren Temperaturbereich einsetzbar
sind. In der Vergangenheit wurden
nur mesophile Bakterien mit der
Fähigkeit zum Kautschukabbau beschrieben,
sodass auf keine bereits
untersuchten thermophilen Vertreter
zurückgegriffen werden konnte. Für
die Anreicherung moderat thermophiler
Bakterien wurden dementsprechend
Habitate gewählt, in denen die-

se zu erwarten waren. Für die Anreicherung
wurden unterschiedliche
Umweltproben mit Saline (0,9 %
NaCl-Lösung) versetzt und damit Erlenmeyerkolben
mit Mineralsalzmedium
[7] inokuliert. Anschließend wurden
diese Anreicherungskulturen bei
55 °C inkubiert. Nachdem durch Trübung
der Medien makroskopisch
Wachstum erkannt werden konnte,
wurden mit den Kulturen sukzessiv
frische Medien beimpft und so die
Kautschuk-verwertenden Bakterien
angereichert. Da viele dieser Bakterien
nicht auf Festmedien mit Latex zu
wachsen vermögen, wurde eine große
Anzahl der Bakterien aus den Anreicherungen
auf Komplexmedium
(Standard I, Merck, Darmstadt) in
Reinkultur gebracht. Unter diesen
Reinkulturen konnten bisher insgesamt
fünf unterschiedliche Isolate
(E1-E5) als thermophile, Kautschukabbauende
Bakterien identifiziert werden
(Tab. 1). Vier der fünf Stämme
wurden aus unterschiedlichen Erdproben
bzw. aus viehwirtschaftlichen
Futterresten aus Ägypten isoliert; ein
Isolat entstammt einer Kompostierungsanlage
in Deutschland. Bei allen
handelt es sich um Gram-positive Mycel-bildende
Actinomyceten, welche
sich jedoch hinsichtlich ihres Abbauverhaltens
deutlich unterscheiden.
Zwei Isolate, E4 und E5, bilden auf
Latex-haltigen Festmedium Klärhöfe,
was auf eine Sekretion von Enzymen,
welche den Kautschuk spalten kön-
Abb. 1: Zeitlicher Verlauf der Mineralisation. Entstehendes CO 2 wurde mit
0,25 M Ba(OH) 2 als BaCO 3 ausgefällt und quantitativ bestimmt.
dauer bis Klärhöfe gebildet werden.
Die Isolate E1, E2 und E3 folgen einem
Abbauverhalten von Kautschuk
wie es bisher von verschiedenen
Gordonia-Spezies bekannt war. Es
werden keine Klärhöfe auf Latex-haltigem
Festmedium ausgebildet, und
Wachstum auf IR als alleiniger Kohlenstoffquelle
lässt sich am besten in
Flüssigkultur beobachten; die Zellen
besiedeln die Kautschukoberfläche.
Basierend auf der Sequenzanalyse der
16S rDNA wurden diese ebenfalls taxonomisch
Eingeordnet. Höchste Similaritäten
von bis zu 99,87 % wurden
zu Nocardia farcinica erhalten
(E1, E2). Isolat E3 konnte bisher nur
bis hin zur Gattung bestimmt werden;
es gehört ebenfalls zum Taxon Nocardia.
Weiterführende Untersuchungen
Tab. 1: Neu isolierte, thermophile Mikroorganismen und deren Charakterisierung.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
29
Quantitative Bestimmung
der Abbauleistungen
verschiedener Bakterien
Quantitativ kann die Abbauleistung
Kautschuk-verwertender Bakterien
anhand der Emission von Kohlendioxid
bestimmt werden. Dazu wird das
durch Mineralisation von Kautschuk
freisetzte CO 2 mit Bariumhydroxid
[Ba(OH) 2 ] in Form von Bariumcarbonat
(BaCO 3 ) ausgefällt. Zur Bestimmung
der Mineralisation wurde die
respiratorische CO 2 -Produktion während
der Kultivierung erfasst. Zu diesem
Zwecke wurden gasdichte Erlenmeyer-Kolben
verwendet, die jeweils
mit 50 ml MSM und 0,1 g Kautschuksubstrat
(Latex bzw. IR) versetzt wurden.
In den Kolben wurden außerdem
Isolat Isolationsort Wachstumsverhalten optimale 16S rDNA Analyse
Wachstumstemperatur
E1 Mutterboden ( E ) adhäsiv 50 °C 99,8% Identität zu
Nocardia farcinica
E2 Sandboden ( E ) adhäsiv 50 °C
E3 Erdprobe Tankstelle ( E ) adhäsiv 50 °C
E4 Abfälle aus Tierhaltung ( E ) bildet Klärhöfe 50 °C 99,0% Identität zu
Thermomonospora curvata
E5 Kompost ( Münster ) bildet Klärhöfe 50 °C
(E); Ägypten; (-), negativ; (+), positiv
nen, hinweist. Für die taxonomische
Klassifizierung dieser Isolate wurde
die Sequenz der 16S rDNA vollständig
(E4) bzw. partiell (E5) ermittelt und
mit in Datenbanken hinterlegten 16S
rDNA Sequenzen bekannter Spezies
verglichen. Basierend auf diesen Ergebnissen
konnten für das Isolat E4
höchste Similaritäten zur Spezies
Thermomonospora curvata
(99,04 %) erhalten werden. Die partielle
16S rDNA Sequenz von Isolat E5
deutet ebenfalls auf diese Spezies hin,
jedoch unterscheiden sich beide
Stämme aufgrund der Inkubations-
zur polyphasischen taxonomischen
Klassifizierung wie Bestimmung des
Zellwandtyps, der Zellwandbestandteile
und Zusammensetzung der zellulären
Lipide müssen die Sequenzanalysen
noch bestätigen. Mit den hier beschriebenen
Bakterienstämmen stehen
nun erstmals thermophile Spezies
zur Verfügung, welche in der Lage
sind, natürlichen und synthetischen
Isoprenkautschuk zu verwerten, und
welche unter Umständen als eine
Quelle für thermostabile, Kautschukspaltende
Enzyme genutzt werden
können.
Glasröhrchen (Reagenzgläser) mit
15 ml einer 0,25 M Ba(OH) 2 -Lösung
gegeben. Die Gefäße wurden anschließend
entsprechend inokuliert, luftdicht
verschlossen und parallel zu einer
nicht-inokulierten Kontrolle unter
entsprechenden Temperaturbedingungen
inkubiert. Alle 5-6 Tage wurden
die Kolben belüftet, die Reagenzgläser
durch neue ersetzt und die jedesmal
entnommene Ba(OH) 2 -Lösung
nach Zugabe von Phenolphtalein
(20 µl aus 1 % (w/v) in Isopropanol)
mit 0,25 N HCl bis zum Farbumschlag
titriert. Die Differenz der dabei ver-
brauchten Menge HCl gegenüber einer
nicht-inokulierten Kontrolle gab
Aufschluss über die während der Kultivierung
gebildete CO 2 -Menge, welche
durch Mineralisation des Kautschuksubstrats
entstand und als BaCO 3 ausfiel.
Die entstandene Menge an CO 2
gibt dann Aufschluss über die von den
Zellen umgesetzte Menge der Kohlenstoffquelle,
wobei der Anteil, welcher
in die Synthese von Biomasse eingeflossen
ist, nicht berücksichtigt werden
kann. Erfahrungsgemäß unterscheiden
sich Klärhof-bildende und
Abb. 2: Nachweis der Spaltung von
IR durch G. westfalica mittels
GPC-Elutionsprofilen nach (B),
24h; (C), 48h; (D), 72h; (E), 120h; (F),
144h Inkubationsdauer; (A), Kontrolle.

30 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
adhäsiv wachsende Kautschuk-abbauende
Bakterien deutlich hinsichtlich
ihrer Mineralisationsraten. Während
bei Spezies der Gattung Gordonia
Mineralisationsraten von bis zu 50 %
mit Latex und ca. 20 % mit IR als alleinige
Kohlenstoffquelle zu beobachten
sind, erreichen Klärhof-bildende
Vertreter wesentlich geringere Raten
von ca. 5 % (IR) bzw. 8 % (Latex).
Die neu isolierten, thermophilen Bakterien-Stämme
weisen nach einer Inkubation
von 50 Tagen bei 55°C Mineralisationsraten
von ca. 10 % mit IR
und ca. 15 % mit Latex auf (Abb. 1).
Diese sind höher als sie von mesophilen
Klärhof-bildenden Stämmen wie
Actinoplanes missouriensis und
Streptomyces sp. erhalten werden,
erreichen jedoch nur etwa ein Drittel
der Mineralisationsraten, welche bei
gleichen Experimenten mit Gordonia-
Spezies erzielt werden können.
GPC-Analysen zum
Nachweis der Spaltung des
Kautschuk-Rückgrads
Ein sehr wichtiges Verfahren in der
Polymerchemie ist die Analyse polymerer
Verbindungen mittels Gel-Permeations-Chromatographie
(GPC).
Dieses Analyseverfahren erlaubt die
Ermittlung der Molekularmassen von
Polymeren und fand auch Einsatz zum
Nachweis der Spaltung von IR. GPC-
Analysen basieren auf der Auftrennung
polymerer Stoffe aufgrund ihres Molekulargewichts.
Hochmolekulare Verbindungen
haben bei dieser Methode
eine geringere Retentionszeit als niedrigmolekulare.
Synthetischer Kautschuk,
wie er für diese Untersuchungen
eingesetzt wurde, hat ein Molekulargewicht
von ca. 6 x 10 6 Dalton.
Wird dieses Substrat von Kautschukverwertenden
Bakterien gespalten, so
muss man das Auftreten von Abbaubzw.
Zwischenprodukten geringerer
Molekulargewichte erwarten. Für Klärhof-bildende
Bakterien wurden solche
Analysen bereits früher durchgeführt,
und es konnten niedermolekulare
Substanzen identifiziert werden [8].
Da adhäsiv wachsende Stämme jedoch
IR erheblich schneller verwerten,
kann erwartet werden, dass sich die
Abbaustrategien auch biochemisch
unterscheiden. Als Modellorganismus
für vergleichende Studien wurde
G. westfalica gewählt [9]. In sterile
trockene Erlenmeyer-Kolben wurden
2ml einer 2 % (w/v) IR-Lösung in
Chloroform gegeben und das Lösungsmittel
abgedampft. Anschließend wurden
auf die am Boden des Gefäßes
entstandene und haftende Kautschuk-
Abb. 3: bioreact ® -Fungtrix-Festphasenbioreaktor. Dargestellt sind ein Verfahrensschema
(oben) und der experimentelle Aufbau einer Laboranlage
(unten).
schicht 50 ml MSM geben und die
Kolben mit 100 µl einer gut gewachsenen
Vorkultur inokuliert. Nach unterschiedlichen
Inkubationsperioden
wurde jeweils eine vollständige Kultur
für die GPC-Messung vorbereitet.
Die Kulturbrühe wurde verworfen und
der Erlenmeyerkolben mit der am
Boden befindlichen Kautschukschicht
wurde bei 70°C getrocknet. Anschließend
wurden 50 ml Chloroform hinzugegeben
und so die Kautschukschicht
darin gelöst. Die erhaltene IR-
Lösung wurde in frische Glasgefäße
überführt und das Chloroform evaporiert.
Dieser Vorgang wurde einmal
wiederholt. Der vereinte Rückstand
wurde erneut in einer geeigneten
Menge Chloroform aufgenommen und
konnte direkt chromatographisch
analysiert werden. Dazu wurden die
Proben mit einem Waters-GPC-System
aufgetrennt und detektiert [Water 515
HPLC Pump, 410 Differential Refractometer,
717plus Autosampler, Verwendung
fanden vier hintereinander
geschaltete Styragel-Säulen (HR3,
HR4, HR5, HR6) mit einer Porengröße
von 10 3 , 10 4 , 10 5 bzw. 10 6 Å]. Abbildung
2 zeigt die Elutionsprofile
nach einer Inkubation von 1-7 Tagen
in Gegenwart von Zellen von
G. westfalica (B-F) und einer nichtinokulierten
Kontrolle nach 7 Tagen
(A). Bereits nach 24 Stunden (B) ließ
sich eine leichte aber deutliche Veränderung
des Elutionsprofils erkennen;
der zuvor distinkte Peak lief langsamer
aus, sodass bereits nach dieser
verhältnismäßig kurzen Inkubationszeit
das Substrat modifiziert worden
war. Nach 48 Stunden (C) trat ein
zusätzlicher Peak mit einer geringeren
Molekularmasse auf, während der
vom einsetzten IR resultierende Peak
an Fläche abnahm, und nach 72 Stunden
(D) konnte ein weiterer niedermolekularer
Peak identifiziert werden.
Im weiteren Verlauf nahmen die Peakflächen
kontinuierlich ab (E, F). Anhand
dieser GPC-Analysen konnte die
Spaltung des IRs durch G. westfalica
deutlich demonstriert werden. Auch
können die Elutionprofile einen gewissen
Aufschluss über die Art der Spaltung
des Polymerrückgrads geben. Da
zusätzliche Peaks geringerer Molekularmasse
entstehen, muss es sich bei
der primären Spaltung von IR um eine
Endospaltung handeln. Im Falle eines
Exoabbaus würde nur die ursprüngliche
Peakfläche kontinuierlich abnehmen
und sich hin zu längeren Retentionszeiten
verschieben. Auch kann
die Spaltung des Polymerrückgrads
nicht zufällig von statten gehen, da
dann nicht mit distinkt auftretenden
Peaks gerechnet werden kann. Fraglich
ist, ob die/das Kautschukspaltende(n)
Enzym(e) eine Präferenz
für bestimmte Bereiche innerhalb
der Polymerkette haben, oder ob
die Polymerketten so angeordnet sind,
dass an der Oberfläche bestimmte
Bereiche besonders exponiert sind. In
Zukunft sollen Analysen der Zwischenprodukte
des Kautschukabbaus Aufschluss
geben über die genauen mechanistischen
Vorgänge. Besonders
die Analyse der chemischen Struktur
der auftretenden niedermolekularen
Verbindungen soll klären, um welche
Gruppe von chemischen Substanzen
es sich dabei handelt und inwiefern
diese für chemische Synthesen interessanter
Chemikalien einsetzbar sind.
Die hier beschriebenen GPC-Analysen
unterscheiden sich von solchen, wie
sie mit Klärhof-bildenden Organismen
durchgeführt wurden. Dort traten keine
zusätzlichen Peaks auf, sondern das
durchschnittliche Molekulargewicht
nahm mit zunehmender Inkubationsdauer
ab [10]
Feststofffermentation von
Kautschukmaterialien
Feststoffbioreaktoren bieten gegenüber
standardisierten Submersverfahren
eine Reihe an Vorteilen. Durch die

Art und Weise der Prozessführung mit
geringen Wasseraktivitäten werden die
natürlichen Lebensbedingungen der
Mikroorganismen nachempfunden.
Darüberhinaus sind wegen der höheren
volumetrischen Produktivität in
der Regel die Arbeitsvolumina kleiner
und die Abwasserbelastung sowie der
Energieverbrauch geringer [11]. Diesen
Vorteilen steht jedoch ein erhöhter
Regelbedarf gegenüber [12,13].
Als Substrate für die Feststofffermentationen
fanden Latexhandschuhe
(Fa. Kimberly-Clark, Belgien), Latexmatratzen
(bestehend aus NR und
Styrenbutadienkautschuk 85:15) sowie
Autoreifengranulat (Fa. RTW,
Bayreuth) Verwendung. Für die ersten
Test-Fermentationen im Labormaßstab
wurden zwei Bautypen der
bioreact GmbH ausgewählt: Der bioreact
® -Fungtrix-Festphasenbioreaktor
mit 1,5 Litern Arbeitsvolumen und
der bioreact ® -Airmix-Festphasenbioreaktor
mit 3 Litern Arbeitsvolumen.
Hierbei wurden die hydrophoben
und sonstigen physikalischen und
strukturellen Eigenschaften der verwendeten
Subtrate berücksichtigt.
Der bioreact ® -Fungtrix ist als Rieselfilmreaktor
ausgelegt. Der verwendete
Prototyp besitzt einen konischen
Reaktorkörper zur Optimierung der
Feuchteverteilung, einen kreisförmigen
Grundriß, eine Siebauflage für
das Substrat-Festbett sowie eine Einrichtung
zur Belüftung unterhalb des
Festbetts. Die Messung und Regulation
des pH-Werts erfolgt außerhalb
des Reaktors kontinuierlich in einem
Konditionierungsgefäß, in dem ein
Residualvolumen ständig verbleibt.
Der bioreact ® -Airmix hat einen
rechteckigen Grundriß und besitzt
ein im Reaktordeckel montiertes Belüftungssystem
aus auswechselbaren
Lanzettdüsen. Diese erlauben eine
besonders feinverteilte und gleichmäßige
Belüftung des Festbetts sowie
- bei immersen Ansätzen - eine schonende,
scherkraftarme und dennoch
effektive pneumatische Agitation. Der
Airmix ist deshalb insbesondere für
aerobe Fermentationen und Materialien
geeignet, die durchmischt werden
sollen, jedoch in konventionellen
Rührfermentern nicht oder nur
schwer behandelt werden können.
Der für die Versuche verwendete Prototyp
ist wie der bioreact ® -Fungtrix
mit einer Siebauflage für das Festbett
ausgestattet. Entsprechend wurden in
beiden Reaktortypen zunächst Rieselfilmverfahren
durchgeführt, also das
statische Substrat-Festbett mit dem
Kulturmedium kontinuierlich oder
periodisch berieselt.
Um die Umsetzung der einzelnen
Substrate durch die Mikroorganismen
zu testen, wurden zuerst Versuchsreihen
in Schüttelkolben mit 50
ml Mineralsalzmedium [7] sowie
0,5 % Kautschukmaterial als Kohlenstoffquelle
durchgeführt (Kultivierungen
erfolgten bei 30°C und 140 rpm).
Es stellte sich heraus, dass keiner der
bekannten Kautschuk-abbauenden
Organismen in der Lage war, Latexmatratzenmaterial
sowie Autoreifengranulat
zu verwerten. Wurden diese
Kautschukmaterialien einer Chloroformextraktion
unterzogen, ließen
sich Substanzen extrahieren, die eine
deutlich inhibierende Wirkung auf
das Wachstum der Mikroorganismen
zeigten. Weitergehende Versuche zielen
in die Richtung, kautschukabbauende
Mikroorganismen mit höherer
Toleranz gegenüber diesen extrahierbaren
Substanzen zu isolieren.
Um den Schwefelanteil im Altreifengranulat
zu verringern und somit
durch die teilweise Revidierung der
Vulkanisation einen höheren Anteil
an Altreifengranulat wieder in die
Produktion neuer Reifen einfliessen
lassen zu können, wurden Kulturen
von Gordonia desulfuricans in einem
Volumen von 50 ml mit schwefelfreiem
Mineralsalzmedium, 0,5 %
(v/v) Glycerin als Kohlenstoffquelle
sowie 0,25 % (w/v) Autoreifengranulat
als Schwefelquelle kultiviert. Dabei
zeigte sich ein deutliches Wachstum,
welches aber in Fermentationsversuchen
mit dem bioreact ® -Fungtrix
unter sonst gleichen Bedingun-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
31
Abb. 4: Wachstumsverlauf von Gordonia polyisoprenivorans Y2K auf Latexhandschuhmaterial.
gen nicht reproduziert werden konnte.
Im Gegensatz zum Kolben wurde
im bioreact ® -Fungtrix aber ein weitaus
höherer Feststoffgehalt eingesetzt
(40 % w/v). Der Grund für das feh-
Abb. 5: bioreact ® -Airmix -Festphasenbioreaktor.
Gezeigt sind eine
Gesamtansicht (oben), der Reaktorinnenraum
mit dem Misch-/
Düsensystem (mitte) und das einseitige
Lager mit Handantrieb und
Druckluftanschluss (unten).
lende Wachstum könnte eine mangelnde
Versorgung des statischen
Festbetts mit Nährstoffen, bedingt
durch eine partielle Verblockung infolge
des hohen Substratanteils, sein.
Zur Vermeidung dieses Effekts wurde
inzwischen ein fortgeschrittenes
Reaktormodell entwickelt (siehe
Abb. 3), dass als wesentliche Neuerung
die Möglichkeit einer Quasi-Wirbelbettprozessführung
vorsieht. Diese
Art der Verfahrensführung kann
zum Beispiel während der Anwachsphase
der Kultur zur Gewährleistung
einer gleichmäßigen und homogenen
Inokulation und später während des
Prozesses zur Auflockerung und Auffrischung
des Festbetts durchgeführt
werden. Dadurch wird die Gefahr einer
dauerhaften Unterversorgung der
Mikroorganismen mit Nährstoffen
durch Verblockung oder auch Kanalbildung
vermieden. Dafür ist der Bioreaktor
mit einer zusätzlichen Siebplatte
oberhalb des Festbetts ausgestattet,
die der Zurückhaltung der
Festbettbestandteile für den Fall
dient, dass die Festbettbestandteile
eine höhere Dichte als Wasser besitzen.
Dann wird das Kulturmedium im
Quasi-Wirbelschichtmodus antiparallel
zum Rieselfilmmodus geführt. Im
Falle von spezifisch leichteren Substraten
kann der Medienstrom parallel
zum Rieselfilmmodus orientiert
sein. Auch kann die Flußrichtung
geändert werden, falls sich das spezifische
Gewicht der Substrate infolge
des Biomassewachstums entsprechend
ändern sollte. Als weitere

32 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Neuerung wird das Festbett auch bei
diesem Reaktortyp künftig durch
Lanzettdüsen, die im Reaktordeckel
montiert sind, belüftet. Der neue bioreact
® -Fungtrix ist damit für Substrate
beliebiger Dichte sowie solche
Substrate geeignet, die dichte Schüttungen
mit geringen Porositäten bilden
(wie etwa Reststoffe aus Latexhandschuhen).
Entsprechende Versuche
mit den ausgewählten kautschukhaltigen
Zielsubstraten sind
geplant.
Erste erfolgreiche Fermentationen
wurden mit Latexhandschuhen als
Substrat im bioreact ® -Airmix durchgeführt.
Sie demonstrieren die prinzipielle
Möglichkeit der Umsetzung
von Kautschukmaterial in Feststoffermentern.
Gordonia polyisoprenivorans
Y2K wurde in einem Volumen
von 1,5 l Mineralsalzmedium
sowie 10 % (w/v) Handschumaterial
kultiviert (Durchflussrate 30 ml/
min, 30°C). In Abbildung 4 ist die
Entwicklung der optischen Dichte
über einen Zeitraum von 65 Tagen
dargestellt. Nach Kultivierung wurde
eine Abnahme des Substratgewichts
um 3,8 % festgestellt.
Der bioreact ® -Airmix wurde im
Verlauf des Projekts ebenfalls weiterentwickelt.
Das aktuelle Entwicklungsmodell
zeigt Abbildung 5. Neu
im Vergleich zu dem vorhergehenden
Prototypen ist ein optionales horizontales
Misch-/Düsensystem sowie ein
ebenfalls optionaler zylindrischer
Siebeinsatz am Reaktorboden, der
die bisherige Siebauflage ersetzt. Das
Misch-/Düsensystem erlaubt die
gleichzeitige Belüftung und Agitation
des Festbetts. Seine Gestalt und die
Geometrie des Reaktorinnenraums
wurden wechselseitig aneinander angepasst.
Das Misch-/Düsensystem besteht
aus einer Hohlwelle, die aus
Gründen der Handhabbarkeit einseitig
gelagert ist, sowie dort eingeschraubten,
auswechselbaren, perforierten,
seitlichen Düsenfortsätzen.
Zur Versorgung des Systems mit
Druckluft ist das Lager mit einem
ensprechenden Anschluss ausgestat-
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tet. Der optionale Siebeinsatz am Reaktorboden
ist so konstruiert, dass
während des Betriebs des Misch-/Düsensystems
ein Zu- oder Ablauf von
Flüssigkeit möglich ist, d. h. der Reaktorinnenraum
kann sporadisch
oder rhythmisch geflutet und entleert
werden.
Diese genannten, optionalen und
variablen Elemente, das Lanzettdüsen-System,
das Misch-/Düsensystem
und der Siebeinsatz, ermöglichen
eine hohe Flexibilität des Airmix-Festphasenbioreaktors
und damit eine
optimale Anpassung der Prozessbedingungen
an die variierenden Eigenschaften
der verwendeten Substrate
sowie verschiedene Verfahrensoptionen.
Hinsichtlich der konkreten Anwendung
der Umwandlung kautschukhaltiger
Reststoffe sind künftig
Verfahrensweisen mit und ohne
Agitation sowie mit und ohne freies
Wasser in jeder zeitlichen Kombination
möglich. Dadurch lässt sich die
Wasseraktivität, zumindest im Mittel,
definiert einstellen und die Eigenschaften
der Grenzschicht zwischen
hydrophobem Substrat und bakteriellem
Biofilm geeignet modulieren.
Über eine periodische transiente Immersion
des Festbetts können Nährstoffe
zugeführt und/oder produzierte
Metabolite während des Prozesses
extrahiert und dennoch überwiegend
die Vorteile hoher Sauerstofftransferraten
durch die großflächige Grenzschicht
zwischen Gasphase und Oberfläche
des Biofilms genutzt werden.
Auch mit dem neuen Prototypen des
bioreact ® -Airmix sind Testversuche
geplant.
Steriltechnisch wurden beide Reaktortypen,
der bioreact ® -Fungtrix
und der bioreact ® -Airmix durch die
Optimierung der Anschlüsse für die
Lanzettdüsen und die Vermeidung
von Toträumen optimiert. Durch die
generelle Verwendung von Lanzettdüsen
mit einer optimierten Perforierung
sind die Reaktoren auch in situ
sterilisierbar.
Versuche zur Temperatur-, Feuchte-
und Sauerstoffregulation im Falle
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des Fehlens von freiem Wasser zur
späteren Anwendung in großen Arbeitsvolumina
wurden im Airmix-
Bioreaktor im Labormaßstab an einem
mikrobiellen Modellsystem
durchgeführt, dass wegen der hohen
auftretenden metabolischen Raten
und der Quellfähigkeit des Substrats
hierfür besonders gut geeignet ist:
der Fermentation von Brot mit Aspergillus
niger. Für die kautschukabbauenden
Prozesse sind wesentlich
geringere metabolische Raten und
folglich günstigere Ausgangsbedingungen
hinsichtlich der Prozesssteuerung
zu erwarten. Zudem sind
hier die Substrate nicht quellbar, sodass
eine einfachere Wasserbilanz
vorliegt. Dadurch wird aber auch die
Wasseraktivität des Systems fast ausschließlich
durch die Eigenschaften
des sich entwickelnden Biofilms bestimmt.
Kompensatorische (puffernde)
Vorgänge durch den Transport
von Wasser zwischen Biofilm und
Substrat fehlen.
Bei den durchgeführten Experimenten
ließ sich eine effektive Kühlung
des Fermenterinhalts durch
Durchströmen mit trockener Luft erzielen.
Zur Regulation der Wasseraktivität
wurde die relative Feuchte der
Abluft gemessen. Die mit der Abluft
ausgetragene Feuchte wurde nachfolgend
kondensiert und in den Reaktor
zurückgeführt. Eine homogene
Verteilung wurde durch das Misch-/
Düsensystem erreicht. Dadurch war
nur eine geringe Nachregelung durch
Zugabe von zusätzlichem destillierten
Wasser notwendig.
Als alternative Methode der Regulation
der Wasseraktivität wurde auf
Reaktortemperatur erwärmte Luft definierter
Feuchte (durch Mischen
temperierter feuchter und trockener
Luft) in das beschriebene System eingeblasen.
Dem Vorteil einer sehr genauen
und gleichmäßigen Regulation
der Wasseraktivität – insbesondere
auch in stationären Festbetten –
steht hierbei die fehlende Möglichkeit
einer gleichzeitigen evaporativen
Temperaturregelung nachteilig ge-
genüber. Deshalb wird zurzeit ein
völlig neuartiges Verfahren zur simultanen
Temperatur- und Feuchteregulation
entwickelt.
Literatur
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Rubber Producers (1996), Worldwide
Rubber Statistics 1996, Huston.
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[13] Roussos, S., Lonsane, B.K., Raimbault,
M. (Eds), (1995) Kluwer Academic
Publischers, Dordrecht.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Alexander Steinbüchel
Institut für Molekulare Mikrobiologie
und Biotechnologie, Westfälische-
Wilhelms-Universität Münster
Correnstrasse 3
D-48149 Münster
Tel.: 0251-8339 821
Fax: 0251-8338 388
eMail: steinbu@uni-muenster.de

BIOPOLYMERWERKSTOFFE
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
33
Umweltgerechte biotechnologische
Herstellung von biokompatiblen
Polymerwerkstoffen für die
Medizintechnik
� Dr. Frank Thunecke 1 , Dr. Karin-Dagmar Wendlandt 1 , Dr. Roland A. Müller 1 , Dipl.-Chem. Gabriele Mirschel 1 , Dipl.-Ing. Carmen Kunze 2 , Dipl.-Ing. Hans-
Frieder Listewnik 3
1 Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH, 2 Universität Rostock, Kompetenzzentrum für Biomaterialien, 3 Bio-Ingenieurtechnik GmbH, Leipzig
Mikrobiell herstellbares PHB (Poly-β-hydroxybuttersäure) ist ein bioabbaubarer und biokompatibler Polyester mit Eigenschaften, die etwa vergleichbar
mit denen des auf petrochemischer Basis erzeugten Massenpolymers Polypropylen sind. Im Rahmen des von der DBU geförderten Projekts wird eine am
Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH entwickelte und patentierte umweltfreundliche Methode, die einen methanverwertenden Stamm zur Biosynthese
und eine wässrige chemisch-enzymatische Aufarbeitung nutzt, in den kleintechnischen Maßstab überführt. Das Scale-up wird von einem Industriepartner
begleitet, der daraus Daten für die Überführung in eine Pilotanlage gewinnt. Gleichzeitig werden aus der so produzierten PHB von einem
weiteren Projektpartner beispielhaft medizintechnische Produkte hergestellt und getestet. Im Mittelpunkt des Projekts steht damit ein integrierter Ansatz,
bei dem Biosynthese, Downstream Processing, verfahrenstechnische Überführung und marktfähiges Produkt gleichzeitig und in Wechselwirkung
betrachtet werden.
Keywords: Biopolymer, PHB, PHA, Methylocystis, Medizintechnik, Implantat.
Einleitung
Auf meist petrochemischer Basis hergestellte
Polymere sind aufgrund ihrer
vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten
aus dem täglichen Leben nicht
mehr wegzudenken, stellen aber andererseits
wegen ihrer Unverrottbarkeit
ein zunehmendes Abfallproblem
dar. Daher gibt es neben dem Ausbau
von Recyclingsystemen seit längerer
Zeit Bemühungen, zumindest
einen Teil dieser Kunststoffe durch
bioabbaubare Polymere zu ersetzen.
Neben Polylactiden (PLA) und Polyglycoliden
(PGA) hat dabei die Gruppe
der Polyhydroxyalkansäure (PHA)
besonderes Interesse gefunden. PHA
sind hydrophobe aliphatische Polyester,
die von einer ganzen Reihe von
Bakterien unter bestimmten Mangelbedingungen
bei gleichzeitigem Kohlenstoffüberschuss
als Kohlenstoffspeicher
in Form von intrazellulären
Granula akkumuliert werden. Die
Forschung konzentriert sich besonders
auf Poly-β-hydroxybuttersäure
(PHB), die am längsten bekannte und
am besten untersuchte PHA [1].
PHB ist thermoplastisch verformbar,
kann daher durch Standardme-
thoden wie Spritzgießen und Extrusion
verarbeitet werden und hat ähnliche
Polymereigenschaften wie Polypropylen.
Dabei verfügt PHB über
eine wesentlich bessere UV-Resistenz
sowie eine geringere Wasserdampfund
Sauerstoffdurchlässigkeit und
stellt eine gute Aromabarriere dar.
Nachteilig ist die relativ hohe Sprödigkeit
und geringe Reißfestigkeit. In
früheren Jahren war die Markteinführung
von PHB/PHA auf deren Eigenschaft
der Bioabbaubarkeit ausgerichtet.
Die Unternehmen ICI/Zeneca/
Monsanto fokussierten auf eine Massenanwendung
im Verpackungsbereich,
konnten aber aufgrund des höheren
Preises traditionelle petrochemisch
hergestellte Kunststoffe nicht
vom Markt verdrängen. Dies führte
dazu, dass zwar die Forschung intensiv
weitergeführt, eine kommerzielle
Nutzung von PHB aber nicht vorangetrieben
wurde.
Das Augenmerk des hier vorgestellten
Projekts liegt deshalb produktseitig
auf einer anderen Qualität die
PHB, ihrer Biokompatibilität. Diese
Eigenschaft eröffnet den Einsatz in der
Medizintechnik. Für diese High-valuelow-volume-Produkte
spielt der Her-
stellungspreis des Polymers nicht
mehr die entscheidende Rolle. Durch
das Scale-up eines am UFZ entwickelten
und patentierten umweltfreundlichen
Verfahrens zur Biosynthese und
Aufarbeitung sollen die verfahrenstechnischen
Grundlagen geschaffen
werden, die auch zur schnelleren Etablierung
als bioabbaubares Polymer
für Massenanwendungen beitragen
können.
Biosynthese
Genauso groß wie das Spektrum der
PHA-bildenden Bakterien [2] ist die
Auswahl der möglichen Kohlenstoffquellen
[3]. In den meisten Fällen
Abb. 1: Der Metabolismus von methanothrophen Bakterien (modfiziert
nach [7]).

34 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
werden verschiedene Zucker als Rohstoff
eingesetzt, jedoch sollte Methan
ein bevorzugtes Substrat für die PHA/
PHB-Synthese sein, weil es hohe Ausbeuten
gewährleistet, in großen Mengen
in Form von Erdgas vorhanden
und eine relativ billige Rohstoffquelle
ist. Außerdem bietet Methan den Vorteil,
dass das Substrat so selektiv ist,
dass die Fermentation unsteril durchgeführt
werden kann. Perspektivisch
kann das Methan bzw. Erdgas auch
durch Biogas ersetzt werden, wodurch
die Nutzung nachwachsender Rohstoffe
und die Realisierung von Stoff- und
Energiekreisläufen denkbar ist. Die
Verwendung von Methan als Rohstoff-
Methans: Methanol ➝ Formaldehyd
➝ Ameisensäure ➝ Kohlendioxid.
Auf der Stufe des Formaldehyds kann
der benötigte Kohlenstoff entweder
über den Serinweg oder über den Ribulose-Monophosphatweg
(RuMP-
Weg) assimiliert werden. Bakterien,
die das Methan via Serinweg verwerten,
sind in der PHB-Synthese beson-
A B
ders effizient und weisen eine höhere
Ausbeute der PHB-Akkumulation auf
[6]. Dazu gehört die Hauptkomponente
der von uns genutzten methanverwertenden
Mischkultur, Methylocystis
sp. GB 25 (DSM 7674), die sich
durch hohe Wachstumsgeschwindigkeit
(0,29 h -1 ) und PHB-Ausbeute aus-
te Methylocystis sp. GB 25 an der
Mischkultur beträgt ≥ 90 %. Die restlichen
10 % entfallen auf Begleitflora,
die etwa zur Hälfte aus zwei methanolverwertenden
Bakterienstämmen,
von denen einer als Methylophilus
methylotrophus identifiziert wurde,
und zur anderen Hälfte aus anderen
Heterotrophen besteht. Erste Versuche
Abb. 2: A) Zellen von Methylocystis sp. GB 25 im Differential-Interferenzkontrast, 1200 fach. B) PHB-Granula in
Zellen von Methylocystis sp. GB 25 nach Nilrotfärbung, Fluoreszenzanregung (Filter B2), 1200 fach.
Abb. 3: Prinzipieller Prozessverlauf der Akkumulation von PHB über 24 h
unter Phosphatmangel.
basis für die PHB-Synthese im technischen
Maßstab ist ein Novum. Am UFZ
wurden die Grundlagen für ein solches
nicht wachstumsassoziiertes,
zweistufiges Verfahren entwickelt und
patentiert [4,5].
Methanotrophe Bakterien sind unter
verschiedensten Mangelbedingungen
in der Lage, intrazellulär PHB zu akkumulieren.
Der Stoffwechselweg verläuft
dabei wie in Abbildung 1 dargestellt
über die Oxidationsprodukte des
zeichnet. Wie der Stoffwechselweg verdeutlicht,
können bei der Oxidation
von Methan Stoffwechselprodukte gebildet
werden, die inhibierend wirken.
Daher ist es zwingend, nicht mit Reinkulturen,
sondern mit definierten
Mischkulturen zu arbeiten. Die Stabilität
der Mischkultur wurde über einen
Zeitraum von 4 Jahren mittels mikrobiologischer
und molekularbiologischer
Methoden nachgewiesen. Der
Volumenanteil der Hauptkomponen-
zu deren Verwertungsspektren zeigten,
dass diese Ameisensäure und
Formaldehyd als Kohlenstoffquelle
nutzen können.
Zellen von Methylocystis sp. GB 25
sind in Abbildung 2a in einer Differential-Interferenzkontrast-Aufnahme
dargestellt. Die eingelagerten PHB-
Granula lassen sich nach einer Nilrotfärbung
mittels Fluoreszenzanregung
gut abbilden, wie Abbildung 2b verdeutlicht.
Die Arbeiten zur Biosynthese erfolgen
in Druckfermentoren unter Phosphatmangel
als initiierender Faktor für
die PHB-Bildung. Dieser Mangel hat-
te sich bei der Prozessoptimierung als
günstigste Variante bezüglich PHB-Gehalt,
PHB-Bildungsgeschwindigkeit,
Ausbeute und Molekulargewicht erwiesen:
Weitere Auswahlkriterien, wie niedrige
Viskosität der Kulturflüssigkeit,
geringer Wert des chemischen Sauerstoffbedarfs
(CSB) des Prozesswassers
und gute Aufarbeitungseigenschaften
der Biomassesuspension, untermauerten
diese Wahl.
Nach grundlegender Optimierung
im 40 l-Fermenter, erfolgte das Scale-up
in den kleintechnischen Maßstab
in einem 400 l-Druckfermenter
(Druck ≤ 5 bar). Dieser ist mit zusätzlich
Regelkreisen ausgestattet, mit
denen die Gelöstsauerstoff- und Gelöstmethankonzentration
im Prozess
konstant und die Ammoniumstickstoff-
und Phosphatkonzentration im
optimalen Bereich gehalten werden
kann. Eine Anlage zur Gasreinigung
gestattet es, in zukünftigen Versuchen
das Prozessabgas von Kohlendioxid zu
reinigen und dem Prozess wieder zuzuführen,
was eine umweltschonendere
Prozessführung und eine höhere
Effizienz des Verfahrens erwarten lässt.
Die PHB-Synthese zeichnet sich
durch einen „Short time“-Prozess aus,
d. h. nach 24 h ist die Akkumulation
nahezu beendet. Im Verlauf der Akkumulation,
der in Abbildung 3 für
eine Serie von Versuchen unter Phosphatmangel
dargestellt ist, steigt der
PHB-Gehalt in den ersten 12 h auf
etwa 40 % der Biomasse an, was bereits
etwa 80-85 % des Gehalts nach
24 h entspricht. Die Zunahme des Molekulargewichts
der PHB verläuft zeit-
PHB-Gehalt 40 - 50 %
Ausbeute YCH4 PHB
Mittleres Molekulargewicht Mw 0,53 g PHB/g CH4 ≥ 2 x 106 (Hochtemperatur-GPC)
g/mol
Abb. 4: PHB-Gehalt, Restbiomassekonzentration und Phosphatkonzentration
während der PHB-Synthese im kleintechnischen Maßstab.

lich analog dazu und erlaubt daher,
schon in der Biosynthese so genannte
„Tailor-made“ PHB zu erzeugen.
Abbildung 4 zeigt beispielhaft den
Prozessverlauf unter Phosphatmangel
im kleintechnischen Maßstab. Mit
dem Absinken der Phosphatkonzentration
im Fermentationsmedium wird
die PHB-Bildung initiiert. Das weitere
Ansteigen der Restbiomassekonzentration
in den ersten drei Stunden resultiert
aus dem Wachstum, das durch
den Restphosphatgehalt noch ermöglicht
wird.
Die in diesen Prozessen synthetisierte
PHB ist ein Homopolymer mit
einem hohen Molekulargewicht von M
≥ 2 x 10 6 g/mol und einer engen Molekulargewichtsverteilung
M w /M n -1 <
5 (Hochtemperatur-GPC). Hohe Molekulargewichte
sind wichtig, da jede
Verarbeitung des Polymers mit einem
Abbau von Molekulargewicht einhergeht.
Abbildung 5 gibt einen Überblick
über die Molekulargewichte und Uneinheitlichkeiten
der akkumulierten
PHB nach 24 h in einer Serie von 9
Versuchen unter Phosphatmangel und
unterstreicht die Reproduzierbarkeit
des Molekulargewichts der gebildeten
PHB.
Zusammenfassend können folgende
Vorteile der Gewinnung von PHB
aus Methan abgeleitet werden:
– Kostengünstiges, gut verfügbares
Substrat;
– Unsterile Prozessführung durch
hohe Substratselektivität möglich;
– Hohe Biosyntheseausbeuten;
– Hohes mittleres Molekulargewicht
und enge Molekulargewichtsverteilung
des synthetisierten Polymers;
–„Tailor-made“ Produktion von PHB
durch Variation der Prozessbedingungen
möglich;
– Niedrige kinematische Viskosität
(0,96 bis 1,2 mm 2 /s) der Kulturflüssigkeit;
– Niedrige CSB-Werte (200-900 mg/
l) des anfallenden Prozesswassers;
– Rückführung oder energetische
Nutzung des Fermentationsgases möglich.
Aufarbeitung
Das Hauptproblem bei der PHA-Gewinnung
besteht in der Abtrennung
der Nicht-PHA-Zellbestandteile
(NPCM, Non-PHA-Cell-Matter).
Durch die sehr unterschiedlichen
chemischen und physikalischen Eigenschaften
der verschiedenen Zellbestandteile
lassen sich PHA und
NPCM weder durch Extraktion noch
durch Zell-Lyse in einem einzigen Aufarbeitungsschritt
ohne Kontaminatio-
Abb. 5: Durchschnittliches Molekulargewicht und Uneinheitlichkeit der
PHB nach 24 h Akkumulation aus mehreren Versuchen.
nen der Polyester trennen. Die daher
notwendigen mehreren Aufarbeitungs-
und Reinigungsschritte von
Biomasse und gewonnenem Polymer
führen in den meisten Fällen zu PHB-
Verlusten und einem Molekulargewichtsabbau,
was zu einer Verschlechterung
der Werkstoffeigenschaften
führt.
Die Gewinnung von PHA erfolgt in
den meisten Veröffentlichungen mittels
Extraktion aus der Biotrockenmasse
der PHA-Produzenten [8]. Dabei
liefern Verfahren, bei denen halogenierte
Kohlenwasserstoffe eingesetzt
werden bezüglich der Reinheit
und des Molekulargewichts der gewonnenen
Polymere, zumindest im
Labormaßstab, oft sehr gute Ergebnisse.
Da aber bereits bei geringem
Polymergehalt in der Lösung schwer
prozessierbare Gele gebildet werden,
sind hohe Lösungsmittelüberschüsse
erforderlich.
Dies führt jedoch bei biologisch
abbaubaren Werkstoffen, die mit
preiswerten, petrochemisch gewonnenen
Polymeren konkurrieren müssen,
zu Marketingproblemen. Deshalb
wurden auch extraktive Verfahren
beschrieben, welche ohne den
Einsatz von halogenhaltigen Lösungsmitteln
auskommen. Die Verminderung
der Folgen auf Umwelt und Gesundheit
geht jedoch oft zu Lasten der
Qualität der PHA.
Wegen der oben bereits erwähnten
geringen Löslichkeit von PHA mit
kurzen Seitenketten, insbesondere
von PHB, ist das Scale-up des Aufarbeitungsprozesses
vor allem aufgrund
der hohen Mengen an Lösungsmitteln
technisch relativ aufwendig und kostenintensiv.
Daher wurden weitere Aufarbeitungsvarianten,
wie die oxidative und
enzymatische PHA-Gewinnung, vorgestellt
[9], die auf wässriger Basis arbeiten
und auf eine möglichst vollständige
Auflösung der NPCM zielen.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
35
Hier sollten im Vergleich zu extraktiven
Verfahren die erzielbaren Ausbeuten
deutlich höher sein. Nachteilig ist
oft ein noch vorhandener geringer
Anteil an NPCM im PHA.
Am Umweltforschungszentrum
Leipzig-Halle GmbH wurde in den vergangenen
Jahren ein Aufarbeitungsverfahren
im Labormaßstab entwikkelt
und patentiert [10], das durch
eine reduktive chemische Vorbehandlung
den nachfolgenden enzymati-
Abb. 6: Prinzipschema des chemisch-enzymatischenAufschlussverfahrens
(CEA).
schen Aufschluss erheblich erleichtert.
Das Verfahren ist in Abbildung 6
schematisch dargestellt. Ziel des laufenden
Projekts ist die Weiterentwicklung
dieses “chemisch-enzymatischen
Aufschlussverfahrens” (CEA), das
Scale-up in den 400 l-Maßstab unter
Berücksichtigung der weiteren Überführung
des Verfahrens in den technischen
Maßstab sowie der Nachweis
ausreichender Produktqualität für
medizintechnische Anwendungen.
Eine gemeinsam mit dem Industriepartner
Messo-Chemietechnik
mittels des CEA vorgenommene Auf-
arbeitung bestätigte die prinzipielle
Eignung des Verfahrens. Eine weitergehende
Analyse der Teilschritte des
bis dahin nur im Labormaßstab verwendeten
Aufschlusses ergab allerdings
erheblichen Änderungsbedarf
im technologischen Ablauf des Verfahrens
beim Scale-up. So war es notwendig,
für die Entwässerungsschritte
Ersatz für die im Labormaßstab
benutzte Becherzentrifugation zu finden.
Deshalb wurden Versuche mittels
Tellerseparator und Mikrofiltration
unternommen, wobei sich insbesondere
die Cross-Flow-Mikrofiltration
als geeignete Alternative in allen
Aufarbeitungsstufen erwiesen hat. Die
erreichten mittleren Permeatflüsse
von 30-50 l/mh sind auch für die
Überführung in den technischen
Maßstab ausreichend. Für den Ernteschritt
wird der Einsatz eines Separators
favorisiert, da es dort gelingt,
einen Teil der Begleitflora abzutrennen.
Der Anstieg der PHB-Reinheit im
Verlauf der Aufarbeitung ist in Abbildung
7 exemplarisch dargestellt. Abbildung
8 illustriert Proben aus unterschiedlichen
Aufarbeitungsstufen.
Die Reinheit der so gewonnenen PHB
liegt bisher bei 95-97 %. Die für medizintechnische
Anwendungen notwendige
Reinheit wird momentan
durch Nachextraktion erreicht. Dies
führt zwar bereits zu einer deutlichen
Verringerung des Lösungsmitteleinsatzes
um mehr als die Hälfte, angestrebt
wird aber, eine ausreichende
Reinheit bereits im Aufschlussverfahren
zu erreichen. Dazu werden Anpassungen
in der chemischen Vorbehandlung
und dem enzymatischen
Aufschlussschritt vorgenommen.
Von den Industriepartnern Bio-Ingenieurtechnik
und Messo-Chemietechnik
wurde auf der Grundlage der
gesammelten Daten zur Biosynthese
und Aufarbeitung ein Verfahrensschema
für eine Pilotanlage einschließlich
der Stoff- und Energieströme erarbeitet.
Einsatz in der
Medizintechnik
PHB weist gegenüber den synthetisch
hergestellten biodegradierbaren Polyestern
den Vorteil auf, dass das Polymer
als chemisch reiner Stoff ohne
Katalysator- oder sonstige Synthesereste
vorliegt. Nachteilig ist die relativ
hohe Sprödigkeit und geringe Reißfestigkeit,
die auf die isotaktische
Struktur zurückzuführen ist. Durch
die Herstellung von Copolymeren oder
Polymerblends von PHB mit anderen

36 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 7: Anstieg der PHB-Reinheit während des chemisch-enzymatischen
Aufschlussverfahrens (CEA).
PHA, ataktischer PHB, aber auch anderen
bioabbaubaren Polymeren
oder die Zugabe von Weichmachern
können diese Nachteile umgangen
werden.
PHB ist vollständig biologisch abbaubar.
Das Degradationsprodukt der
PHB, die 3-Hydroxybuttersäure, ist
ein normales Stoffwechselprodukt im
Blut von Wirbeltieren, was auch als
Indiz für eine sehr gute Biokompatibilität
gilt. Die in vivo-Degradation von
PHB erfolgt sehr langsam [11]. Anwendungsmöglichkeiten
von PHB
sind deshalb dort zu erwarten, wo
eine längere Verweilzeit oder höhere
Stabilität gegenüber der physiologischen
Umgebung, aber letztlich doch
eine vollständige Resorption benötigt
wird. Beispiele sind Anwendungen
zur Behandlung komplizierter Knochenbrüche,
zur Nervenregeneration,
Implantate für das kardiovaskuläre
System oder den Gastrointestinaltrakt
sowie als Material für das Tissue Engineering
[12].
Ein für große Implantate aus PLA,
PGA und deren Copolymeren beschriebenes
heterogenes Degradationsverhalten
mit möglichen negativen
Effekten auf das Zellsystem durch Akkumulation
von Abbauprodukten
[13] wurde für PHB bisher nicht beobachtet,
weshalb eine bessere Biokompatibilität
und zunehmende bio-
medizinische Anwendung erwartet
werden kann.
Die prinzipielle Eignung von auf
der Basis von Methan gewonnener
PHB als resorbierbares Implantatmaterial
ist vom Kooperationspartner an
der Universität Rostock bereits nachgewiesen
worden. So belegen Lang-
Abb. 9: PHB-Patchmaterial.
zeituntersuchungen, dass PHB für den
klinischen Einsatz hervorragend geeignet
ist [14]. Versuche mit intraperitonealen
und subcutanen Implantaten
aus PHB in Ratten, Kaninchen
und Meerschweinchen, teilweise mit
Implantationszeiten von bis zu 2 Jah-
Abb. 8: Proben aus unterschiedlichenAufarbeitungssstufen:Fermenterablauf
(links),
nach chemischer Vorbehandlung
(mitte), nach
enzymatischem Aufschluss
(rechts).
ren, zeigten ausgezeichnete Ergebnisse
zur Biokompatibilität. Anhaltspunkte
für chronische entzündliche
Veränderungen oder metaplastische
Entartungen waren nicht zu verzeichnen.
Ebenfalls positive Erfahrungen
wurden mit PHB-Patchmaterialien
(Abb. 9) zum Verschließen von Defekten
im Gastrointestinalbereich gemacht
[15]. Hier werden spezielle
Anforderungen an das Material gestellt,
wie das Abdichten des Gewebedefekts
zur Vermeidung von Verwachsungen,
die Unterstützung der
Gewebeneubildung, Resistenz gegenüber
Darmenzymen aber auch Eigenschaften
wie Flexibilität und Nähbarkeit,
die insbesondere von PHB erfüllt
werden.
Ziel des laufenden Projekts ist es,
die Eignung von mittels CEA gewonnener
PHB als Biomaterial zu prüfen.
Neben einer gleichbleibenden Qualität
verschiedener Chargen sollte das
Molekulargewicht ausreichend hoch
sein, da Verarbeitung und Sterilisation
zu einem beträchtlichen Abbau
führen. Das Molekulargewicht ist darüber
hinaus entscheidend für die Kristallinität
und die Degradation der
PHB und damit auch für die mechanischen
Eigenschaften. Der medizinische
Einsatz macht zudem einen ausreichenden
Reinheitsgrad erforderlich,
wobei insbesondere der Reststickstoffgehalt,
der auf Verunreinigungen
mit Zellbestandteilen hinweist,
von Bedeutung ist.
Erste Ergebnisse bestätigen die prinzipielle
Eignung von PHB, die nach
dem umweltfreundlichen CEA aufgearbeitet
wurde, als Biomaterial hinsichtlich
des Molekulargewichts und
der mechanischen Eigenschaften. Die
notwendige Reinheit wird aber bisher
nur durch Nachreinigung erreicht.
Entsprechend der Ergebnisse der im
Moment laufenden in vitro-Zellverträglichkeitstests
erfolgt die in vivo-
Testung an einem favorisierten PHB-
Produktmuster aus der CEA-Aufarbeitung
im Vergleich zum herkömmlichen
Verfahren der Lösungsmittelextraktion.
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Saß, M., Schmitz, K.-P., Med. Biol. Eng.
Comp. 37 (1999), 1510-1511.
Korrespondenzadresse
Dr. Karin-Dagmar Wendlandt
Umweltforschungszentrum Leipzig-
Halle GmbH
Sektion Sanierungsforschung
Permoserstraße 15
D-04318 Leipzig
Tel.: 0341-235 2281
Fax: 0341-235 2492
eMail: wendland@san.ufz.de

BIOSENSORIK
Überwachung der
Einleitung
Eine schwere Organschädigung macht
häufig eine Transplantation zwingend
notwendig, wenn alle pharmakologischen
und interventionellen Therapien
ausgeschöpft sind. Seit der ersten
Nierentransplantation im Jahre 1963
sind in Deutschland bis Ende 2002
insgesamt 63.276 Transplantationen
durchgeführt worden; allein im Jahre
2002 wurden insgesamt
3.298 Transplantationen vorgenommen
[1].
Die großen Erfolge der Transplantationsmedizin
in den letzten zwei
Jahrzehnten sind nicht zuletzt der Existenz
immunsuppressiver Medikamente
zu verdanken. Zu einem Meilenstein
in der Transplantationsmedizin
wurde vor etwa 25 Jahren der Einsatz
des Medikamentes Cyclosporin A
(CsA). Mit Hilfe von immunsuppressiv
wirkenden Medikamenten wie dem
CsA konnten die Überlebenschancen
von Transplantaten erheblich verbessert
werden, da das Risiko einer Abstoßung
des fremden Organs durch
das körpereigene Immunsystem vermindert
wird. Trotz dieser Erfolge
bleibt das neue Organ ein Fremdorgan
und wird bisher durch keine
denkbare Therapie voll akzeptiert. Die
immunsuppressive Therapie muss
deshalb während der gesamten Überlebenszeit
des Transplantats fortgesetzt
werden. Der Einsatz von Immunsuppressiva
bedarf jedoch einer genauen
Kontrolle, da das therapeutische Fenster
der Dosierung relativ schmal ist.
Nach oben wird es durch das Auftreten
ernsthafter Nebenwirkungen begrenzt.
Eindeutig ist, dass die oft erheblichen
Nebenwirkungen durch
eine Verringerung der Medikamenten-
Dosis eingeschränkt werden können.
Dabei ist jedoch ein Verlassen des therapeutischen
Fensters nach unten mit
einem Verlust der immunsuppressiven
Wirkung zu vermeiden.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
37
Immunsuppressions-Therapie
nach Organtransplantation mit
Hilfe einer wirkungsbezogenen
Analysenmethode
� Dr. Bernfried Specht 1 , Dr. Manfred Fobker 2 , Dr. Beate Vollenbröker 3,1 , Dr. Michael Erren 2 , Dr. Ulrich Müller 2 , Dipl.-Ing. Jan Hendrik Koch 3 , PD Dr. Helge
Hohage 3 , Prof. Dr. Friedrich Spener 4 und Dr. Norbert Bartetzko 1 *
1 Inventus BioTec Gesellschaft für innovative Bioanalytik, Biosensoren und Diagnostika mbH & Co. KG, Nottulner Landweg 90, D-48161 Münster,
2 Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Universität Münster, D-48149 Münster
3 Medizinische Poliklinik D, Universität Münster, D-48149 Münster
4 Institut für Biochemie, Universität Münster, D-48149 Münster
Mit Hilfe eines Biosensors wurde ein Assay, bestehend aus Pharmakon und Rezeptormolekülen, entwickelt, der anstelle der Konzentration von Cyclosporin
A (CsA) die immunsuppressive Aktivität von CsA und seiner Metabolite bestimmt. Der Variationskoeffizient (CV) für den klinisch relevanten Bereich
(50-300 nM CsA) beträgt für den Rezeptorassay 7,2% (innerhalb der Serie) und 10,1% (von Tag zu Tag). Der Messbereich des Tests umfasst 10-500
nM mit einer analytischen Nachweisgrenze von 5 nM. Patientenproben wurden mit dem Rezeptorassay und zwei etablierten Routinemethoden vermessen
und statistisch ausgewertet. Die Korrelation zwischen Rezeptorassay und Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (r = 0,599, n = 193) sowie zwischen
Rezeptorassay und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie (r = 0,615, n = 150) wurde berechnet. Der Rezeptorassay zeigte im Vergleich zu
diesen Methoden eine bessere Übereinstimmung mit hämatologischen und klinisch-chemischen Parametern. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die
Komplexbildungsaktivität der vermessenen CsA-Analoga mit deren in Zellkulturexperimenten festgestellten immunsuppressiven Aktivität korreliert.
Keywords: Immunsuppressiva, Immunophiline, Transplantation, Immunsuppression, Rezeptorassay, Biosensor, Biacore.
Cyclosporin A
Cyclosporin A ist das am häufigsten
verwendete Medikament zur therapeutisch
induzierten Immunsuppression
in der Transplantationsmedizin.
CsA ist ein cyclisches Undecapeptid
mit einer Molekularmasse von
1202,6 Da, das neben einer Reihe
strukturverwandter Cyclosporine von
dem Pilz Tolypocladium inflatum
gams als Hauptprodukt produziert
wird [2]. Die Ausscheidung von CsA
erfolgt vorwiegend über die Leber, wo
eine ausgedehnte Metabolisierung
durch das Cytochrom P450 3A-System
stattfindet. Mehr als 30 Metabolite sind
bekannt. Während toxische Effekte
von CsA in in-vitro Modellen und klinischen
Studien ausreichend erforscht
wurden, wird der Einfluss von CsA-
Metaboliten auf die Toxizität noch
kontrovers diskutiert [3,4]. Die CsA-
Metabolite zeigen nach klinischen und
experimentellen Erfahrungen jedoch
ebenfalls eine immunsuppressive Wirkung
[4]. CsA bindet im Komplex mit
dem Immunophilin Cyclophilin A
(Cyp) an die Ca 2+ - und Calmodulinabhängige
Protein-Phosphatase Calcineurin
(Cn) und hemmt damit dessen
Phosphatase-Aktivität. In Folge
dieser Hemmung wird die cytoplasmatische
Untereinheit des Transkriptionsfaktors
NF-AT durch Cn nicht mehr
dephosphoryliert und kann damit
nicht in den Zellkern eindringen. Dieses
führt u.a. zu einer Inhibierung der
Interleukin-2 Bildung und somit zu
einem Ausbleiben der T-Zell-Immunantwort
[5].
Tacrolimus
Der Wirkstoff Tacrolimus (FK506)
wurde 1995, nachdem er bereits in
Japan, England und den USA positive
Wirksamkeit gezeigt hatte, auch in
Deutschland für die Prophylaxe der
Transplantatabstoßung zugelassen.

38 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Tacrolimus ist ein von dem Pilz Streptomyces
tsukubaensis sezerniertes
hydrophobes Makrolidlacton und wurde
1987 erstmals isoliert [6]. Vier Jahre
später fanden die ersten klinischen
Studien mit FK506 statt [7]. In weiteren
kontrollierten Studien wurde die
klinische Wirkungsweise bei Organtransplantationen
bestätigt [8,9]. Die
Metabolisierung erfolgt ebenso über
das Cytochrom P450 3A-System. Insgesamt
sind acht Metabolite mit unterschiedlicher
immunsuppressiver Aktivität
bekannt. Obwohl FK506 strukturell
nicht mit CsA verwandt ist, weisen
beide den gleichen Wirkmechanismus
auf. FK506 bindet zwar ein anderes
Immunophilin („Tacrolimus binding
protein 12 (FKBP12)“) als CsA (CsA
bindet an Cyclophilin), beide dimeren
Komplexe – Immunophilin/Immunsuppressivum
– binden jedoch an Calcineurin
und unterdrücken dessen
Phosphataseaktivität [5].
Die Bildung der ternären in-vivo
Wirkkomplexe lässt sich mit Hilfe des
BIACORE ® 2000-Gerätes, einem optischen
Biosensor der Firma
Biacore AB, nachweisen (Abb. 1).
Durch den Einsatz dieses Geräts ist es
möglich, Wechselwirkungen zwischen
unmarkierten Biomolekülen während
der Analyse in Echtzeit zu detektieren
[10]. Im Gegensatz zu einer Konzentrationsbestimmung,
wie sie bei den
bisher angewandten Methoden erfolgt,
wird mit diesem Rezeptorassay die
Aktivität einer Probe, nämlich die
„Komplexbildungsaktivität“ des Immunsuppressivums
unter Einbeziehung
der im Blut vorhandenen Metabolite,
ermittelt.
Ergebnisse
Ausbildung der ternären invivo
Wirkkomplexe auf der
Sensoroberfläche des
Biacore-Gerätes
Mit Hilfe des BIACORE-Gerätes konnten
die in-vivo Wirkkomplexe zwischen
Cyp, Cn und CsA sowie FKBP,
FK506 und Cn sehr erfolgreich auf der
Sensoroberfläche nachgebildet werden.
Abbildung 1 zeigt schematisch
den Aufbau der zur Bestimmung der
immunsuppressiven Aktivität von CsA
und FK506 verwendeten Assays. Cn
wird direkt auf der Oberfläche des
Sensorchips immobilisiert. Eine wäßrige
Pufferlösung des Medikaments
CsA bzw. FK506 fließt nach Zusatz der
Immunophiline Cyp bzw. FKBP kontinuierlich
über die Oberfläche des Sensorchips.
Bindet der in dieser Lösung
gebildete dimere Komplex aus Cyp und
CsA bzw. aus FKBP und FK506 an im-
Abb. 1: Ausbildung der ternären Komplexe aus Calcineurin, Immunsuppressivum
und Immunophilin (Cyp/CsA/Cn bzw. FKBP/FK506/Cn) auf der
Sensoroberfläche und das daraus resultierende Resonanzsignal.
mobilisiertes Cn, verändert sich der
refraktive Index in der Nähe der Sensoroberfläche.
Damit verschiebt sich
der Resonanzwinkel, wodurch die Anbindung
online detektiert werden
kann. Die dimeren Komplexe aus Cyp/
CsA und FKBP/FK506 zeigen ein recht
unterschiedliches Verhalten bzgl. ihrer
Anbindung an immobilisiertes Calcineurin
und dem Abdissoziieren von
Calcineurin (Abb. 2). Im Falle des dimeren
Komplexes aus Cyp/CsA zeigt die
Kurvenform mit k a = 1,08 x 10 5 M -1 xs -1
die sehr schnelle Ausbildung des
ternären Komplexes, das baldige
Erreichen des Gleichgewichtszustands
und die ebenso sehr schnelle Dissoziation
des ternären Komplexes mit
k d = 0,0191 s -1 . Im Falle des dimeren
Komplexes aus FKBP/FK506 zeigt die
Kurvenform mit k a =3,37 x 10 4 M -1 xs -1
eine langsamere Ausbildung des ternären
Komplexes im Vergleich zu Cyp/
CsA. Dahingehend dissoziiert der ternäre
Komplex aus FKBP/FK506/Cn mit
k d =2,43x10 -3 x s -1 um einen Faktor 10
langsamer als der ternäre Komplex aus
Cyp/CsA/Cn. Besonders der um den
Faktor 10 kleinerer k d -Wert im Falle
des ternären Komplexes FKBP/FK506/
Cn liefert den entscheidenden Beitrag
für die größere Stabilität dieses Komplexes.
Dieses Ergebnis steht im Einklang
mit der Tatsache, dass die notwendige
Konzentration an FK506 in der
Phase der Erhaltungstherapie ca. um
den Faktor 15 niedriger ist als die Konzentration
des CsA.
Tab. 1: Fähigkeit verschiedener CsA-Derivate zur Komplexbildung im Vergleich zu CsA.
Aufbau des Cyclosporin
A-Rezeptorassays am
Biacore
Im Falle des Medikaments CsA wurde
am Biacore ein Rezeptorassay aufgebaut.
Durch Auftragung der relativen
Signale im Gleichgewichtszustand gegen
die eingesetzte CsA-Konzentration
lässt sich eine Kalibrierkurve für CsA
erstellen. Es ergibt sich ein Messbereich
von 10 – 500 nM mit einer Nachweisgrenze
von 5 nM. Im klinisch relevanten
Bereich von 50 – 300 nM CsA
beträgt der Variationskoeffizient (CV)
in der Serie (intra-day) 7,2% und der
von Tag zu Tag (inter-day) 10,1%. Für
die HPLC-Methode, die zur Überwachung
von klinisch auffälligen Patienten
eingesetzt wird, ergibt sich ein Wert
von 5,1% (intra-day) und 6,9% (inter-day)
für einen Konzentrationsbereich
von 104 – 280 nM. Mit der in der
klinischen Routine zur Überwachung
von Transplantationspatienten benutzte
Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay-Methode
(FPIA) werden Variationskoeffizienten
für die „inter-day“-
Bestimmung von 5,5% bei 67 nM CsA,
5,1% bei 166 nM CsA und 4,9% bei
332 nM CsA erhalten.
Komplexbildung
verschiedener Cyclosporin
A-Derivate mit Calcineurin
und Cyclophilin A im
Vergleich zu Cyclosporin A
Die Untersuchung der Komplexbildung
von verschiedenen CsA-Derivaten -
Metaboliten, natürlichen Cyclosporinen
und künstlichen Derivaten - mit
dem BIACORE ergab sehr unterschiedliche
Fähigkeiten der verschiedenen
Substanzen, den ternären Komplex
auszubilden (Tab. 1). Es zeigte sich,
dass die mit dem BIACORE ermittelten
Komplexbildungsaktivitäten gut mit
den Ergebnissen von Zellkulturexperimenten
korrelieren. Interessant sind
die Ergebnisse der häufig untersuchten
primären Metabolite AM1 und
AM4N (Tab. 1). Da diese Metabolite als
erste Abbauprodukte von CsA häufig
in Patientenproben vorkommen, ist die
Cyclosporin-Analoga Komplexbildung in vitro im Vergleich Immunsuppressive Aktivität in Zellkultur
zu CsA (0 - 400 nM) (Biacore) im Vergleich zu CsA (0 – 400 nM) [2,11,12]
Cyclosporin A 100 % 100 %
Metabolit AM9 (18,0 ± 4,5) % (9,2 - 14,0) %
Metabolit AM4N (52,3 ± 7,3) % (3,5 - 8,2) %
Metabolit AM1 (81,4 ± 11,3)% (2,5 – 16)%
Metabolit AM1c (9,2 ± 1,9)% 3%
MeAla-6-CsA (2,1 ± 0,1) % schwache immunsuppressive Wirkung
Cyclosporin G (Nva-2-CsA) (85,6 ± 11,0) % starke immunsuppressive Wirkung
Cyclosporin D (15,7 ± 2,7) % schwache immunsuppressive Aktivität
Cyclosporin F (18,4 ± 2,0) % keine signifikante immunsuppressive Aktivität

Bestimmung ihrer Wirkung zur Bestimmung
der Gesamtwirkung wichtig.
AM1 und AM4N weisen eine recht hohe
Aktivität von 81,4 % bzw. von 52,3 %
im Vergleich zur Muttersubstanz auf.
Werden diese Ergebnisse jedoch mit
denen aus Zellkulturexperimenten verglichen,
so zeigen sich deutliche Unterschiede.
Copeland et al. [11] sowie
Murthy et al. [12] finden eine deutlich
schwächere immunsuppressive
Wirkung (bezogen auf CsA), während
der BIACORE-Test eine deutlich größere
Komplexbildungsaktivität zeigt.
Eine eindeutige Erklärung für dieses
Resultat fehlt bisher. Es ist jedoch gut
denkbar, dass die Metabolite AM1 und
AM4N durch die Zellen schlechter aufgenommen
werden als andere Cyclosporin-Analoga
und deshalb nur
mäßig immunsuppressiv wirken. Bei
der BIACORE-Messung steht dagegen
jeweils die ganze Menge zur Komplexbildung
zur Verfügung.
Bewertung des
Rezeptorassays durch
Vermessung von
Patientenproben
Die Möglichkeit der Bestimmung der
immunsuppressiven Aktivität in einer
Probe im Gegensatz zur Konzentrationsbestimmung
von CsA soll die Aussagekraft
des entwickelten Rezeptorassays
im Vergleich zu den etablierten
CsA-Analysenmethoden erheblich verbessern.
Die Ergebnisse der mit der
BIACORE-Methode analysierten Blutproben
wurden mit dem Statistikprogramm
EVAPAK nach einer Methode
von Passing-Bablock statistisch ausgewertet
und mit den Ergebnissen der
Analysensysteme – HPLC und FPIA -
verglichen. Dabei korrelieren die Ergebnisse
von BIACORE und FPIA mit
einem Korrelationskoeffizient von
0,599 (n = 193) und von BIACORE
und HPLC mit einem Korrelationskoeffizient
von 0,615 (n = 150). Die mit
Hilfe des BIACORE-Assays ermittelten
Werte sind um 15,5 % größer als die
Werte, die mit dem FPIA erhalten wurden,
und um 27,5 % größer als die
HPLC-Werte. Da mit der Methode der
HPLC die reine CsA-Konzentration bestimmt
wird, hat die Anwesenheit von
Metaboliten offensichtlich einen recht
großen Einfluss auf die BIACORE-Bestimmung.
Die bei der FPIA-Methode
zum Einsatz kommenden Antikörper
erkennen neben CsA die primären
Metabolite AM1 und AM9 [13]. AM1
zeigt eine recht hohe Komplexbildungsaktivität
(81,4 %, Tab. 1), AM9
hingegen nur eine Komplexbildungsaktivität
von 18 % (Tab. 1). Aufgrund
der Tatsache, dass AM1 und AM9 mit
den Analysensystemen FPIA und BIA-
CORE erfasst werden, kann die im Vergleich
zur HPLC geringere Abweichung
der FPIA-Werte von den BIACORE-
Werten gut erklärt werden. Der Metabolit
AM4N zeigt keine Kreuzreaktivität
mit den monoklonalen Antikörpern
[13], weist jedoch eine recht hohe
Komplexbildungsaktivität von 52,3 %
(Tab. 1) auf. Die Miterfassung solcher
Metabolite wie AM4N mit dem BIA-
CORE-Assay erklärt die Tatsache, dass
mit diesem Assay im Vergleich zum
FPIA größere CsA-Äquivalenzwerte gefunden
werden.
Die Ergebnisse der CsA-Bestimmung
mit den verschiedenen Analysensystemen
von 58 Transplantationspatienten
wurden weiterhin mit dem Statistikprogramm
SPSS nach einer Methode
von Spearman auf vorhandene
Korrelationen mit klinischen Daten hin
untersucht (Tab. 2). Bei der BIA-
CORE-Methode weisen in allen Fällen
die Korrelationen mindestens ein Signifikanzniveau
von kleiner 0,05 auf,
auch zeigt die BIACORE-Methode im
Schnitt wesentlich bessere Korrelationen
als die beiden anderen Methoden
FPIA und HPLC.
Die Korrelation der Ergebnisse ergab
eine gute negative Korrelation der
mit dem BIACORE gemessenen CsA-
Äquivalent-Werte und der absoluten
Zahl an Leukozyten, B-Lymphozyten
und cytotoxischen T-Zellen sowie eine
gute Korrelation der mit dem BIA-
CORE gemessenen CsA-Äquivalent-
Werte und dem prozentualen Wert der
Monozytenzahl, der Basophilenzahl
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
39
Abb. 2: Vergleich der dimeren Komplexe Cyp/CsA (schwarze Kurve) und FKBP/FK506 (rote Kurve) bzgl. Ihrer Anbindung
an immobilisiertes Calcineurin und dem Abdissoziieren von Calcineurin.
und der T-Lymphozytenzahl im Blut.
Eine signifikante Korrelation zwischen
den Ergebnissen der mit dem BIACO-
RE gemessenen CsA-Äquivalent-Werte
und der Konzentration der Zellen des
Immunsystems beweist folglich einen
direkten Zusammenhang zwischen
dem Messwert für die Aktivität von CsA
und seinen Metaboliten und der Immunsuppression
des Patienten.
Die Korrelation zwischen den BIA-
CORE-Ergebnissen und den Leberwerten
Bilirubin und alkalischer Phosphatase
sind deutlich besser als die
Korrelation zwischen den FPIA-Ergebnissen
und den Leberwerten. Im Falle
des Bilirubins weist die HPLC-Methode
im Vergleich zur BIACORE-Methode
eine stärkere Korrelation (0,593 vs.
0,343) auf, jedoch liegt hier das Signifikanzniveau
nur bei kleiner 0,05.
Eine positive Korrelation mit den CsA-
Werten weist daher auf einen Zusammenhang
zwischen der CsA-Konzentration
bzw. der Komplexbildungsaktivität
der Probe und der Toxizität von CsA
und seinen Metaboliten für die Leber
hin. Es ist bekannt, dass besonders
CsA-Metabolite für die toxische Wirkung
des Medikaments verantwortlich
sind [4]. Hohe Konzentrationen an CsA
und seiner Metabolite können zur
Schädigung der Leber und somit zu
einer Einschränkung der de novo-
Cholesterinsynthese führen, wodurch
die negative Korrelation mit dem Parameter
Cholesterin erklärt werden
kann. Die Verringerung des Cholesterinspiegels
bzw. der Blutfette führt zu
einer Herunterregulierung der Pankreasfunktion
mit einer verminderten Sekretion
von Amylase. Weiterhin wird
Tab. 2: Korrelationen zwischen CsA-Analysensystemen und Zellen des
Immunsystems sowie verschiedenen Markern.
Biacore FPIA HPLC
Leukozyten -0,242* -0,171 -0,309
Monozyten % 0,265* 0,040 0,041
Basophile % 0,372** 0,261 0,137
T-Lymphozyten % 0,464** 0,305* 0,253
B-Lymphozyten -0,305* -0,132 -0,301
cytotox. T-Zellen -0,260* -0,233 0,121
Cholesterin -0,290* -0,113 -0,346
Bilirubin 0,343** 0,176 0,593*
alkalische Phosphatase 0,304** 0,088 0,178
Amylase -0,384** -0,118 -0,112
Die Anzahl der Sternchen zeigt eine Unterscheidung zwischen zwei unterschiedlichen
Signifikanzniveaus; Korrelationskoeffizienten (Spearman):
**Signifikanzniveau: p < 0,01 * Signifikanzniveau: p < 0,05

40 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
die Amylase physiologischerweise fast
vollständig in den Gastrointestinaltrakt
abgesondert. Eine häufige Nebenwirkung
von CsA sind gastrointestinale
Beschwerden (Gastritis, Durchfälle,
Erbrechen), wodurch eine verstärkte
Elimination der Amylase aus dem Körper
resultiert.
Aussicht
Die Überwachung der Immunsuppression
und die Erstellung von Therapiebereichen
wird in den kommenden
Jahren durch die Kombination verschiedener
Immunsuppressiva aufgrund
zahlreicher Arzneimittelinteraktionen
zunehmend schwieriger. Insbesondere
für die Vielzahl von Metaboliten,
die in stark variierender und in
größerer Konzentration als die Muttersubstanz
im Blut vorkommen können,
ist die immunsuppressive Aktivität und
WIRKSTOFF-ENTWICKLUNG
Toxizität schwer abzuschätzen. Die
Möglichkeit der Bestimmung der Aktivität
von Immunsuppressiva in einer
Patienten-Probe (im Gegensatz zur
Konzentrationsbestimmung) verbessert
die Aussagekraft des Rezeptor-assays
im Vergleich zu den etablierten
Analysenmethoden erheblich und optimiert
die Steuerung der medikamentösen
Therapie nach Transplantation.
Weiterführende Studien sind notwendig,
um zu beweisen, dass die Verbesserung
der Analytik durch Einführung
dieses Rezeptorassays auch klinisch zu
einem Anstieg der Überlebensrate des
Transplantats führt.
Literaturliste
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www.transplant.org
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Korrespondenzadresse
Chemoenzymatische Synthese
von Oligosacchariden und
glykosylierten Naturstoffen
� Dr. Jürgen Seibel, Prof. Dr. Klaus Buchholz, Abteilung für Technologie der Kohlenhydrate, Technische Universität Braunschweig
Forschritte in den Biowissenschaften
führten in den letzten Jahren zur Identifizierung
von Kohlenhydraten, die als
Schlüsselelemente der molekularen
Erkennung, Signaltransduktion, Zelladhäsion
und Kommunikation dienen.
Neben Untersuchungen zur
Funktionen des Genoms und Proteoms
stellt die Untersuchung des Glykoms
eine besondere Herausforderung
dar. Die mannigfache Strukturdiversität
der Glykokonjugate (Oligosaccharide,
Oligopeptide, Oligoproteine)
begründet deren hohe Spezifität
bei der Erkennung anderer Moleküle
und somit den medizinischen Einsatz.
Diese Strukturvielfalt der Glykokonjugate
erschwert jedoch deren Zugang
und Analyse. Oft können diese
Strukturen nur totalsynthetisch in begrenzten
Mengen hergestellt werden.
Deshalb sind neue ökologische und
ökonomische Zugänge zum Scale-up
der Glykokonjugate von großer Bedeutung.
Der Einsatz von Biokatalysatoren
hat sich als Methode der Wahl erwiesen,
um Produkte aus Kohlenhydraten
als Rohstoffe selektiv und wirtschaftlich
herzustellen. Das Problem
der Selektivität stellt sich in besonderem
Maße bei Kohlenhydraten, da hier
sowohl Regioselektivität, bei meist 3
bis 5 Verknüpfungsmöglichkeiten der
Zucker als Bausteine, und Stereoselektivität
gleichzeitig zu gewährleisten
sind. Aus einer ungewöhnlich hohen
Zahl von Isomeren ist in der Regel nur
ein Produkt erwünscht und nutzbar.
Umweltaspekte
Die klassischen Synthesen von Oligosacchariden
erfolgen mit großem Aufwand
an Hilfschemikalien (Schutzgruppenchemie)
und in organischen
Lösungsmitteln, enzymatisch dagegen
umweltfreundlich im wässrigen Milieu.
Daraus ergibt sich eine drastische
Umweltentlastung sowie Resourcenschonung,
da mit Zuckern überwiegend
nachwachsende Rohstoffe
eingesetzt werden. Der Einsatz von
Kohlenhydraten und enzymatischen
Synthesewegen zur Vermeidung organischer
Lösungsmittel und Reduktion
chemischer Hilfsstoffe bedeutet einen
präventiven Charakter der Umweltentlastung.
Beim Einsatz von Glykosyltransferasen
werden sowohl Rohstoffe
(Edukte) als auch Energie eingespart,
gleichzeitig wird die anfallende
Schadstoffmenge (Schwermetalle,
Lösungsmittel) komplett eliminiert.
Darüber hinaus lässt sich aufgrund
der hohen Selektivität (Regio- und Stereoselektivität)
von Biokatalysatoren
die Bildung von Nebenprodukten weitgehend
vermeiden.
Dr. Norbert Bartetzko
Inventus BioTec, Gesellschaft für
innovative Bioanalytik, Biosensoren
und Diagnostika mbH & Co. KG
Nottulner Landweg 90
D-48161 Münster
Tel.: 02534-800 126
Fax: 02534-800 124
eMail: dr.bartetzko@inventusbiotec.com
Transglycosidierungen
Eine spezielle Gruppe von Enzymen,
Glukansucrasen (GTF) nutzt preiswerte,
industriell verfügbare Substrate,
wie Saccharose, Stärke oder Inulin,
zur Synthese verschiedener Oligo- und
Polysaccharide mit Glukose und Fruktose
als Bausteinen. Einige werden
technisch genutzt, um z. B. Gluko- und
Fruktooligosaccharide, Cyclodextrine,
Dextran u. a. für die Anwendung in Lebensmitteln,
Kosmetika und Pharmaka
herzustellen [1,2]. Die Vielfalt der
Produktpalette ist beträchtlich. Mittels
Glykosyltransferasen können in wässriger
Lösung Glykosylreste auf unterschiedliche
Akzeptoren übertragen
werden. Damit lässt sich ein weites
Spektrum von Strukturen – bisher
meist Saccharide und Derivate – glykosilieren,
ein interessantes Potenzial
für die Anwendung.

Mit der Dextransucrase lassen
sich eine Vielzahl von Oligosacchariden
synthetisieren, indem das Enzym
einen Glukoserest von Saccharose
als Substrat auf andere Monooder
Oligosaccharide überträgt,
meist mit einer α-1,6-Bindung
[1,2]. Als Beispiel sei die Synthese
des Disaccharids Leukrose, ein Saccharose-Isomer
mit anderer (1-5
statt 1-2-) glykosidischer Verknüpfung
genannt. Mittels kinetischer
Messungen sind die optimalen Bedingungen
für diese Reaktion ermittelt
worden [3]; sie ist bis zum Pilotmaßstab
weiterentwickelt worden,
da Leukrose als nicht-kariogenes
Süßungsmittel von Interesse ist.
Neben der Nutzung des präbiotischen
Effekts werden solche Produkte
für dermatologische und kosmetische
Zwecke angewandt (Cremes
u.a.) [1,2].
Die Funktionalisierung und Glykosylierung
von Sacchariden bietet weitergehende
Perspektiven, da gezeigt
werden konnte, dass auch Zuckerderivate,
wie Zuckeralkohole, Zukkersäuren
und sogar ungesättigte
Zucker, glycosyliert werden können
[4] (Abb. 1).
Projektziele
Gemäß der Gesundheitsorganisation
(WHO) sterben 6 Millionen Menschen
jährlich an Krebs. Die Krebsforschung
stellt somit eines der wichtigsten
Gebiete der Pharmaindustrie
dar. Der Markt wird auf circa 30 Milliarden
US $ beziffert.
Ein erfolgreich eingesetztes Chemotherapeutikum
ist Taxol ® . Dieses
wird ausgehend von 10-Desacetylbaccatin
III, das in Ausbeuten von einem
Kilogramm pro 3.000 kg Nadeln
der in Europa heimischen Gemeinen
Eibe (Taxus baccata) zugänglich ist,
in vier Schritten synthetisiert.
Die geringe Wasserlöslichkeit erschwert
die Aufnahme und Applikation
dieses Wirkstoffs. In dem Verbundprojekt
wird eine Glykosyltransferasegenbibliothekaufgebaut
und ein funktionelles Screening
durchgeführt auf Enzyme, die
Glyksoyleinheiten auf diesen Naturstoff
übertragen können, um die Löslichkeit
und Bioverfügbarkeit wesentlich
zu erhöhen und somit die
notwendige tägliche Dosis drastisch
zu reduzieren (Abb. 2). Dies gilt
ebenfalls für das in der klinischen
Phase befindliche Chemotherapeutikum
Epothilon.
In weiteren Projekten wird die enzymatische
Synthese von Oligosac-
Abb. 1: Typen von Bindungen, die durch Dextransucrase aus Leuconostoc
mesenteroides NRRL B-1299 gebildet werden [1].
chariden und Glycopeptiden bzw. -
lipiden verfolgt (Abb.3). Diese Moleküle
sind an einer Vielzahl von zellulären
Prozessen beteiligt. Ihnen
wird eine Schlüsselrolle bei der Regulation
des Immunsystems zugewie-
Abb. 2: Wirkungsmechanismus
der Glykopeptid-Hybrid-
Naturstoffe.
sen [5]. Sie bieten somit ideale Voraussetzungen,
um selektivere, schonende
Therapien mit geringerer systemischer
Toxizität durchführen zu
können.
Zur Änderung ihrer Spezifität werden
Transferasen der Zufallsmutagenese
unterworfen; so wird versucht,
maßgeschneiderte Enzyme für die
Synthese von Oligosachchariden und
den Einsatz in der Produktion zu optimieren.
Ausblick
Es ist zu erwarten, dass ein leistungsfähiger
Biokatalysator aus einem genetisch
veränderten Bakterienstamm
in einem optimierten Reaktor für
hohe Wirtschaftlichkeit sorgt. Zurzeit
entwickeln führende Firmen (BASF,
Fluka, Schering) eine große Zahl an
Biokatalysatoren für die organische
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
41
Synthese. Doch nicht nur der Produktions-
oder Verkaufswert der neu
entwickelten Glykosyltransferasen,
sondern die hohe Umweltrelevanz
und die um mehrere Größenordnungen
darüber hinausgehende Wert-
schöpfung der mit Katalysatoren erzeugten
Pharmaka bestimmt die
hohe ökonomische Bedeutung.
Danksagungen
Die Arbeiten zur Kinetik der Dextransucrase
wurden durch das EU-Projekt
„Structure-function relationships
of glycosyl-transferases“ gefördert.
Das beschriebene DBU-Projekt wird
in Kooperation mit der Combinature
Biopharm AG und der X-Zyme GmbH
durchgeführt.
Literatur
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(Hrsg.: Whitaker, J.R., Voragen,
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Danishefsky, S.J., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 99 (2002), 13699-13704.
Korrespondenzadresse
Dr. Jürgen Seibel
Technische Universität
Braunschweig
Technische Chemie-
Abteilung für Technologie
der Kohlenhydrate
Langer Kamp 5
D-38106 Braunschweig
Tel.: 0531-391 72 62
eMail: j.seibel@tu-bs.de
Abb. 3: Bei einer Vielzahl tumorassoziierter Antigene handelt es sich um
Glykoproteine.

42 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
WIRKSTOFFSCREENING
Hefezellen als Bioindikatoren
zur schnellen Identifizierung
hochselektiver
umweltfreundlicher Wirkstoffe
� Prof. Dr. K.-D. Entian1 , Dr. Dietmar Eschrich2 , Dr. Jürgen Recktenwald2 , Dr. Thomas Gassenmeier2 , Dr. Andrea Sättler2 , Dr. Jörg Hauf3 , Dr. Joachim Klein4 ,
Dr. Martina Rimmele4 1 2 3 Institut für Mirobiologie; J.W. Goethe-Universität Frankfurt, Phenion GmbH & Co KG; Frankfurt, SRD GmbH – Scientific Research Development
GmbH; Oberursel, 4 RiNA GmbH – Netzwerk RNA-Technologien GmbH; Berlin
Zahlreiche mikrobielle Schadorganismen werden aufgrund der stetig steigenden Resistenzbildungen gegen vorhandene Wirkstoffe zu einem akuten und
schwerwiegenden Zukunftsproblem. Zum Schutz von Mensch und Umwelt ergibt sich daher ein zunehmender Bedarf an Wirkstoffen mit hoher Spezifität,
der durch den heutigen Stand der Technik nur bedingt gedeckt wird. Diese brisante Situation macht die Suche nach neuen Antibiotika zu einem existenziellen
Problem von großem öffentlichen Interesse und hoher wirtschaftlicher Relevanz für die einschlägige Industrie. Des Weiteren sind viele gegenwärtig
eingesetzte Pestizide (Pflanzenschutzmittel und Biozide) aus Umweltaspekten bedenklich. Die Entwicklung selektiver, für Nicht-Schadorganismen
untoxischer Substanzen ist daher dringend erforderlich. In dem hier beschriebenen Projekt werden Hefezell-basierte targetorientierte Testverfahren zum
Einsatz kommen (TOP-Verfahren, Target-orientiertes Proteinscreening), mit deren Hilfe hochselektive umweltverträgliche Wirkstoffe für die chemische
und pharmazeutische Industrie identifizierbar sind. Diese TOP-Verfahren kombinieren die Vorteile eines Zielort-basierenden Verfahrens mit den Vorteilen
eines Ganzzell-Screenings.
Keywords: Screening-Systeme – Saccharomyces cerevisiae – Wirkstoffe – RNA-Aptamere – humanpathogene Pilze.
Problemstellung
Die meisten heute gebräuchlichen Antiinfektiva
sind Derivate von Substanzen,
die bereits länger als 30 Jahre verwendet
werden. Ein immer stärker
wachsendes Problem stellt dabei die
Fähigkeit der Mikroorganismen dar,
sich anzupassen und Resistenzen zu
entwickeln (Abb. 1).
Insbesondere sind Pilzinfektionen
problematisch, die nur durch eine
geringe Zahl spezifisch antimykotisch
wirksamer Substanzen bekämpft werden
können. Die Häufigkeit schwerer
und teilweise lebensbedrohlicher Pilzinfektionen
nimmt beim Menschen
stetig zu, da die Zahl immundefekter
Patienten bedingt durch vermehrte
intensivmedizinische Eingriffe (z. B.
Organtransplantationen, aggressive
Krebstherapien) und durch die expandierende
Zahl von HIV Patienten ansteigt.
Insbesondere Candida albicans
ist einer der wichtigsten opportunistischen
Krankheitserreger.
Zurzeit verfügbare Wirkstoffe gegen
Mykosen zeigen unerwünschte Nebenwirkungen
aufgrund Arzneimittel-bedingter
Toxizität und riskanter Arzneimittelinteraktionen.
Zudem zeigen die
genutzten Wirkstoffe oft eine schlechte
Pharmakokinetik oder sind gar
durch die Entwicklung von Resistenzen
unwirksam geworden. Für die klinische
Praxis stehen als Wirkstoffgruppen
lediglich vier Substanzklassen
zur Verfügung: Polyene, Azole, Allylamine/Thiocarbamate
und Fluoropyrimidine.
Derzeitiger Stand der
Forschung und Technik
Nahezu alle klassischen Antibiotika
wurden durch Optimierung von Substanzen
erhalten, die eine antimikrobielle
Wirkung im Ganzzellen-Screening
zeigten. Die Verfahren haben jedoch
den Nachteil, dass sie unemp-
Abb.1: Globale Entwicklung von Resistenzen gegen klinisch relevante Antibiotika (seit 1967).
findlich sind und der Wirkort gefundener
Substanzen meist unbekannt
ist. Hierbei ist nicht zu unterscheiden,
ob die Wirkung proteinspezifisch toxisch
oder allgemein zytotoxisch ist.
Deshalb hat sich die pharmazeutische
Forschung in den vergangenen Jahren
auf eine Zielort-gerichtete Technologie
konzentriert.

Der Vorteil Zielort-basierender in
vitro Ansätze, bei denen es sich um
zellfreie biochemische Testsysteme
handelt, ist, dass völlig neue Zielorte
für Antiinfektiva bestimmt werden
können. Ein Nachteil dieser Systeme
ist, dass eine große Menge falsch-positiver
Treffer detektiert wird. Die im
beschriebenen Projekt genutzten Testsysteme
greifen Vorteile der bisherigen
in vitro und in vivo Testverfahren
auf und nutzen sie zur Identifizierung
Target-spezifischer und intrazellulär
wirksamer Stoffe.
NOVEL BIOACTIVES
Problemlösung
In Vorarbeiten wurden Testsysteme auf
Basis des Modellorganismus Saccharomyces
cerevisiae entwickelt, die es
ermöglichen, interessante Target-spezifische
Wirkstoffe zur Pilzbekämpfung
zu identifizieren. Das „Targetorientierte
Proteinscreening“ (TOP-
Screening) erlaubt, im Ganzzellsystem
Substanzen zu identifizieren, die selektiv
die Funktion eines vorgegebenen
Enzyms oder Proteins inhibieren.
Die Inhibierung ist dabei an das
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
43
Wachstum der Zelle gekoppelt. Als
Zielproteine dienen Gene aus Schadmikroorganismen,
die in Saccharomyces
cerevisiae heterolog exprimiert
werden. In diesen Assays ist es
nicht nur möglich neue Target-spezifische
Substanzen, sondern auch bisher
unbekannte Wirkorte von Antiinfektiva
zu identifizieren.
Die Testsysteme sind so flexibel,
dass im Projekt Naturstoffe, Stoffe der
kombinatorischen Chemie und auch
RNA-Aptamere eingesetzt werden können.
Wirkstoffe aus extremophilen
Mikroorganismen
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Karl-Dieter Entian
Johann Wolfgang Goethe-Universität
Frankfurt
Institut für Mikrobiologie
Marie-Curie-Str. 9
D-60439 Frankfurt
Tel.: 069-7982 9525
Fax: 069-7982 9527
eMail: entian@em.uni-frankfurt.de
� Dr. Guido Meurer, BRAIN AG; Dr. Stephanie Grond, Universität Göttingen; HD Dr. Arnulf Kletzin, Technische Universität Darmstadt & ZEB e.V.; Dr. Ralf
Grote und Prof. Dr. Garabed Antranikian, Technische Universität Hamburg-Harburg
Neue, z.B. durch Viren verursachte, Krankheiten und die auch in Westeuropa zunehmende Bedrohung durch Infektionen mit Antibiotika-resistenten
Krankheitserregern machen die Entdeckung und Entwicklung neuartiger Wirkstoffgrundgerüste dringend notwendig. Bei der Suche nach neuen Wirkstoffquellen
gewinnt neben der in den letzten Jahren bevorzugt eingesetzten kombinatorischen Chemie zur Synthese bioaktiver Substanzen die Untersuchung
von Mikroorganismen aus natürlichen Habitaten wieder an Bedeutung. Ziel dieses Kooperationsprojekts ist es, unter Anwendung moderner molekularbiologischer,
genetischer und naturstoffchemischer Verfahren Mikroorganismen aus extremen Habitaten als Quelle von Wirkstoffen zu erschließen
und die kontinuierliche industrielle Produktion dieser Substanzen ohne schädigende Eingriffe in den Lebensraum zu sichern. Die diesen Biosyntheseleistungen
zugrunde liegende genetische Information wird in Form von Genbanken verfügbar gemacht. Zur nachhaltigen und ressourcenschonenden Produktion
neuartiger Wirkstoffe werden anschließend die für die Wirkstoffbiosynthese relevanten genetischen Komponenten in heterologen, für die Kultur
in Fermentationsanlagen kompatiblen Wirtssystemen exprimiert.
Keywords: Rekombinante Naturstoffe, extremophile Mikroorganismen, heterologe Expression, Biosynthesegencluster, nachhaltige Produktion.
Globale
Herausforderungen:
Neue Wirkstoffe
Trotz eines weltweit mit zweistelligen
Zuwachsraten expandierenden
Pharma-Markts für einzelne Produkte
(s. Tab. 1) sehen wir uns
durch die Verbreitung neuartiger
Krankheitserrreger (z.B. SARS) und
das Wiederauftreten von Antibiotikaresistenten,
pathogenen Bakterien
zunehmend einer globalen Gesundheitskrise
ausgesetzt. Die Branche
reagiert darauf unter enormem finanziellem
Aufwand mit dem Einsatz
ultrahochdurchsatzfähiger Screeningsysteme
und der Erstellung großer
chemisch-synthetischer Substanzbibliotheken,
ohne aber damit
bislang der sich abzeichnenden Situation
entscheidend begegnen zu
können.
Extremophile als
Ressource neuartiger
Wirkstoffe
In jüngster Zeit ist daher eine zaghafte
Rückbesinnung auf die zuletzt stark
vernachlässigten natürlichen Wirkstoffe
zu beobachten. In der Tat spielen
Naturstoffe und vor allem ihre Derivate
als Wirkstoffe für therapeutische
Anwendungen nach wie vor eine dominante
Rolle. So basieren etwa die
Hälfte der weltweit bedeutendsten
Medikamente auf Naturstoffen. Auch
bei den Neuzulassungen liegt der Anteil
der Naturstoffe und ihrer Derivate
heute bei über 30% [1,2]. Dabei stellt
die Gruppe der Actinomyceten den
Hauptteil der Wirkstoffproduzenten.
Um wirklich neuartige Grundgerüste
aufzufinden, muss aber vermehrt auf
andere, bislang unbeachtet gebliebene
Ressourcen zurückgegriffen werden.
Hier sind in letzter Zeit vor allem
marine Habitate in den Fokus der Naturstoffforschung
gerückt.
Extremophile Mikroorganismen,
insbesondere Archaea, wurden bisher
vor allem im Hinblick auf ihre biotechnologische
Nutzung untersucht. Faktisch
wird ihre Bedeutung bis heute
mit der Anwendung extrem (thermostabiler
Enzyme gleichgesetzt. Tatsächlich
sind alle bislang im Labor kultivierbaren
und charakterisierten Archaea
entweder extrem thermophile
Tab. 1: Aufstellung der weltweit meistverkauften Medikamente. Quelle: Drug Monitor, IMS HEALTH World Review
2001.
Produkt Indikation/Wirkprinzip Hersteller 2000 Umsatz Prozent Anteil am Prozent jährliches
(US$ Mrd.) globalen Umsatz Wachstum
Losec/Prilosec gastrointestinale Erkrankung AstraZeneca 6,1 1,9 + 9
Lipitor LDL Cholesterin-Senker Pfizer 5,4 1,7 + 44
Zocor Cholesterin-Senker Merck & Co 4,4 1,4 + 15
Norvasc Bluthochdruck Pfizer 3,3 1,1 + 15
Ogastro/Prevacid Protonenpumpen-Hemmer Abbott 3,1 1,0 + 33

44 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Organismen aus vulkanischen Quellen,
extrem halophile aus nahezu gesättigten
Salzlösungen oder es handelt sich
um strikt anaerobe Methanproduzenten
(Abb. 1). Nicht alle extremophilen
Mikroorganismen kommen jedoch
aus dem Reich der Archaea. Vielmehr
werden in zunehmender Anzahl auch
Bakterien in extremen Habitaten gefunden
[3].
Über die biosynthetischen Fähigkeiten
extremophiler Mikroorganismen hinsichtlich
der Produktion von Wirkstoffen
weiß man bislang nur wenig. Vor
allem Naturstoffe mit geringem Molekulargewicht
sind aufgrund bislang
unzureichender Analysen nur wenige
bekannt. Jüngste Fortschritte der Tiefsee-Biotechnologie
zeigen aber eine
unerwartet hohe, neuartige mikrobielle
Diversität. Genauere Untersuchungen
auf enzymatische Aktivitäten oder
Sekundärstoffe stehen zwar erst am Anfang
[4], belegen aber, dass auch bei
den extremophilen Vertretern der Bakterien
und Archaea niedermolekulare
bioaktive Substanzen eine wichtige
Rolle spielen. In Analogie zu bakteriellen
Wirkstoffen, die oftmals primär
gegen artverwandte Konkurrenten wirken,
konnten antibiotisch wirksame
Peptide (Halocine und Sulfolobicine)
aus Halobakterien und Sulfoloben (extrem
halophilen bzw. thermophilen Archaea)
beschrieben werden, die selektive
Wirksamkeit gegen hyperthermophile
Crenarcheota (Sulfolobus sp.)
zeigen [5,6,7].
Bioaktive Substanzen aus
Extremophilen
Als peptidogene Wirkstoffe stellen die
Halocine das haloarcheale Äquivalent
der sogenannten Bacteriocine dar. Deren
wohl bekannteste Vertreter sind die
Lantibiotika mit ungewöhnlichen Aminosäuren
wie Lanthionin, die von der
Gruppe der „lactic acid bacteria“
(LAB) produziert werden. Seit Jahrhunderten
werden LAB zur Fermentation
und Konservierung von Nahrungsmitteln
eingesetzt. So wundert es nicht,
dass bereits 1928 mit Nisin aus Lactococcus
lactis das erste Lantibiotikum
aufgrund seiner inhibitorischen
Eigenschaften gegenüber anderen LAB
isoliert wurde [8]. Bislang ist es aber
der einzige kommerziell genutzte Vertreter
der Bacteriocine.
Die Wirkungsweise der Halocine
wurde bisher nur für das Halocin H6
aufgeklärt. Es inhibiert einen halobakteriellen
Na + /H + Antiporter [9]. Beispiele
für das Potenzial der Archaea
als Quelle von Substanzen mit noch ungeklärtem
Wirkstoffpotential sind die
Abb. 1: Bioprospecting extremer Habitate: Probenentnahme am Lake
Bogoria, Kenia.
Cofaktoren der Methanogenese oder
thermoprotektive Substanzen wie das
zyklische Bisphosphoglycerat. Das aus
extrem halophilen Bakterien isolierte
Ectoin wird ebenfalls bereits kommerziell
angeboten. Aus Beobachtungen
der AG Kletzin ist bekannt, dass beispielsweise
die Kulturüberstände des
thermoacidophilen Archaeons Acidianus
ambivalens korrosive Siderophore
unbekannter Struktur enthalten.
Über diese Substanzen komplexieren
und absorbieren die Organismen Metalle
- eine Eigenschaft, die sie für die
biotechnologische Anwendung bei
„sanften“ Metalllaugungsprozessen
prädestiniert. Aber auch medizinisch
könnten sie von Interesse sein, etwa
zur günstigen Beeinflussung von
Krankheitsverläufen, bei denen z.B.
freie Eisen-Ionen als wesentlicher Faktor
zur Pathogenität von Mikroorganismen
beitragen.
Die meisten schwefelabhängigen
Archaea scheiden Substanzen aus, die
den normalerweise wasserunlöslichen
Schwefel auf noch ungeklärte Weise
hydrophiler und damit für die Mikroorganismen
zugänglich machen. So
produziert Thermococcus (Archaea)
niedermolekulare zyklische Polysulfide,
die antifungal wirken
[10,11]. Auch aus thermophilen Vertretern
des Genus Streptomyces wurden
neben Enzymen verschiedene Sekundärmetabolite
isoliert. So wurden
die Regulationsaktivitäten des Granaticin-Bildners
S. thermoviolaceus detailliert
untersucht [12] und Carotenoide
[13] sowie einige neuartige Antibiotikastrukturen
(u.a. Strepturidin,
Antibiotic S) zeigen, dass ein erhebliches
Wirkstoffpotential in extremophilen
Mikroorganismen ungenutzt
schlummert. Es besteht daher die begründete
Hoffnung, dass weitere, völ-
lig neuartige Metabolite extremophiler
Mikroorganismen gefunden werden,
die auch sekundär immunologische,
onkologische und cytotoxische
Aktivitäten zeigen.
Nachhaltige Herstellung
von Wirkstoff-Kandidaten
Extreme Habitate stellen meist äußerst
empfindliche Ökosysteme dar und sind
zudem für den Menschen oftmals nur
schwer zugänglich. Wegen der technischen
und ökologischen Probleme des
eigentlichen „bioprospecting“ ist die
wiederholte Entnahme von Mikroorganismen
zur Produktion von Naturstoffen
im Großmaßstab damit praktisch
unmöglich. Auch ihre Kultivierung
stellt eine erhebliche Herausforderung
dar, denn die spezifischen Gegebenheiten
ihres extremen Lebensraums lassen
sich, wenn überhaupt, selbst unter
großem technischen Aufwand nur
unzureichend nachstellen. Dies und
die Tatsache, dass „naturidentische“
Nährstoffangebote in der Regel nur
mangelhaft simuliert werden können,
ist oft ausschlaggebend für die geringe
„Ausbeute“ in Kultur. Isolierungsund
Kultivierungsmethoden müssen
daher insbesondere den extremen Le-
bensbedingungen Rechnung tragen.
Faktoren wie Nährstofflimitierungen,
Sauerstoffabschluss, pH-Wert oder
Temperatur sind bei der Kultivierungsoptimierung
zu beachten.
In einem durch die Deutsche Bundesstiftung
Umwelt (DBU) geförderten
Kooperationsvorhaben wird dieser
Problemkomplex erstmals durch konsequente
Anwendung moderner naturstoffchemischer,
biologischer und genetischer
Verfahren bearbeitet. Primärziel
des Projekts ist es, anhand neuer
bioaktiver Sekundärmetabolite den
Nachweis zu erbringen, dass extremophile
Mikroorganismen eine wertvolle
Quelle von Wirkstoffen darstellen.
Die Arbeitsgruppe Prof. Antranikian
trägt hierzu ihr erhebliches Know-how
bei der Etablierung und Bearbeitung
Abb. 2: Antimikrobieller Plattendiffusionstest
mit Extrakten extremophiler
Isolate. Aktivitiät gegen den
Indikatororganismus zeigt sich als
klarer Hof um die Auftragsstelle.
von Sammlungen extremophiler Mikroorganismen
bei. Das von BRAIN
und Arbeitsgruppen der TU Darmstadt
gegründete „Zentrum für molekulare
Evolution und Biodiversität e.V.“ (ZEB)
bearbeitet eine Sammlung thermoacidophiler
Archaea aus dem Bestand von
Prof. W. Zillig. Diese Ressourcen werden
im Rahmen des Projekts auf die
Biosynthese neuartiger Wirkstoffe untersucht.
In der ersten Phase werden
Kulturüberstände und -extrakte erzeugt
(TUHH, ZEB) und biologisch
Tab. 2: Panel mikrobieller Testkeime als Indikatororganismen in Plattendiffusionsassays.
Testkeim Ordnung Reich
Staphylococcus aureus Firmicutes (gram+; low GC) Bacteria
Bacillus subtilis Firmicutes (gram+; low GC) Bacteria
Escherichia coli Proteobacteria Bacteria
Pseudomonas stutzeri Proteobacteria Bacteria
Mycobacterium smegmatis Actinobacteria Bacteria
Micrococcus luteus Actinobacteria Bacteria
Sporidiobolus johnsonii Basidiomycetes Eukarya
Candida glabrata Ascomycetes Eukarya
Halobacterium sp. YC-819-9 Euryarchaeotes Archaea

(BRAIN, ZEB) charakterisiert. Die chemische
Analyse der neuen Substanzen
führt die AG Grond in Göttingen durch.
Relativ neu ist auch der Einsatz
molekulargenetischer Methoden in
der Wirkstofffindung. Er beruht auf der
Kenntnis der genetischen Information
zugrundeliegender Biosynthese-Gencluster
und nutzt Sequenzähnlichkeiten
innerhalb von Genfamilien zur
Detektion neuer Gene. Die Verfahren
sind somit selektiv für bestimmte Wirkstoffgruppen
(z.B. Polyketide) und
stellen, vor allem durch zunehmende
Automatisierung, eine leistungsstarke
Ergänzung traditioneller Screening-
Methoden (chemische bzw. Aktivitätsprofilierung)
dar. Für die moderne
Naturstoffchemie rückt somit die enge
Zusammenarbeit mit der Molekularbiologie
neben die traditionell bestehenden
Kooperationen mit Mikrobiologen.
Gene für Schlüsselenzyme und ganze
Gencluster für sekundärmetabolische
Stoffwechselwege priorisierter
Kandidaten werden in der zweiten Projektphase
in Form von Cosmid- und
BAC Klonen gesichert. Mittels rekombinanter
Biosynthese in leicht manipulierbaren
hochaktiven Wirkstoffproduzenten
wie Streptomyces oder
Pseudomonas werden anschließend
neue bzw. neuartige Aktivitäten zunächst
im Labormaßstab identifiziert
und nachfolgend Methoden und Verfahren
für eine effiziente wie nachhaltige
Produktion der Wirkstoffe etabliert.
Das Potenzial dieser Technologie
zur Expression von Wirkstoff-Biosyntheseclustern
wurde in den vergangenen
Jahren bereits eindrucksvoll
durch Versuche mit Polyketidsynthese-
und NRPS-Clustern unterstrichen
[14]. Einer der neuesten Erfolge ist die
heterologe Expression des Epothilon-
Biosyntheseclusters aus dem Myxobakterium
Sorangium cellulosum in
Streptomyces coelicolor [15].
Um Wirkstoffe aus Extremophilen
rekombinant darzustellen und zu charakterisieren,
wird von Expressionsklonen
oder -banken zunächst ein antimikrobiell
ausgerichtetes Aktivitätsprofil
aufgenommen sowie ein sequenzhomologes
Screening nach
Wirkstoffbiosynthese-Genclustern
durchgeführt. Aus positiven Klonen
werden dann die aktiven Substanzen
isoliert und einer weiteren Analyse unterzogen.
Biologische Testsysteme hierfür
umfassen sowohl so genannte Primärscreening-Assays
(z.B. Viabilitätsuntersuchungen
an unterschiedlichen
Zelllinien) als auch komplexere zelluläre
Screeningsysteme mit rekombinanten
Signaltransduktionsmodulen
(Rezeptoren, „Responsive Elements“
etc.). Diese rekombinanten zellbasierten
Testsysteme (cell-based Assays)
erlauben die frühzeitige Beantwortung
immunologisch wie onkologisch relevanter
Fragestellungen und ermöglichen
somit eine zielgerichtete Entwicklung
aussichtsreicher Kandidaten für
entsprechende Indikationen.
Primärhits
in Prozent
Prozentuale Verteilung von Primärhits
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Escherichia coli
Pseudomonas fluorescens
Mycobacterium smegmatis
Sporidiobolus johnsonii
Candida glabrata
Halobacterium sp. YC-819-9
Indikatororganismen
Abb. 3: Prozentuale Verteilung von Primärhits im Plattendiffusionsassay.
Primärscreening
extremophiler Neuisolate
und Stämme
Im Rahmen einer vorgeschalteten Pilotphase
haben die Kooperationspartner
bestehende Techniken und Assay-
Systeme zur Erschließung neuer und
neuartiger Sekundärmetabolite extremophilen
Ursprungs überprüft und,
wenn nötig, neue Methoden und Prozesse
etabliert. Beispielsweise wurde
die Extraktherstellung für die erste Projektphase
bei allen Verbundpartnern
evaluiert und standardisiert. Parallel
wurde eine geschützte Online-Daten-
Anteil der
Extrakte in
Prozent
Zytotoxische Aktivität von Rohextrakten
100
80
60
40
20
0
80-100
60-80
Viabilität in Prozent
40-60
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
45
bank entwickelt, um allen Projektpartnern
jederzeitig den Zugriff auf sämtliche
aktuellen Daten zu ermöglichen.
Die Analyse des Wirkstoffpotenzials
neuer Isolate erfolgt zunächst klassisch
über das biologische und chemische
Screening der Rohextrakte. In dieser
Phase wird vor allem die antimikrobielle
Aktivität der Extrakte gegen ein
Panel von bakteriellen, archealen und
fungalen Indikatorstämmen (Abb. 2,
Tab. 2) sowie ihre Zytotoxizität gegenüber
eukaryontischen Zelllinien (CHO-
K1 Zellen) getestet.
Screening antimikrobieller Aktivitäten.
Abbildung 3 zeigt die relative
Häufigkeit und Verteilung antimikrobieller
Aktivitäten einiger Rohextrakte
gegenüber verschiedenen Indikatorstämmen.
Da auch Bestandteile der
verschiedenen Extraktlösungen unter
Umständen hemmend auf das Wachstum
der Testkeime wirken können,
wurden Kontrollen durchgeführt und
die experimentellen Werte in der Gra-
< 20
Medienkontrollen
Kulturextrakte
Bereinigte Zytotoxizität
Abb. 4: Zytotoxische Aktivität von Rohextrakten gegen CHO-K1 Zellen.
fik entsprechend normiert. Auffällig,
wenn auch nicht unerwartet, ist die
hohe Rate von Extrakten, die das
Wachstum des extremophilen Indikatorstamms
Halobacterium sp. inhibieren.
Dagegen überrascht die relativ
hohe Zahl an antifungal wirkenden
Extrakten im Primärscreen. Gerade bei
den fungalen Indikatorstämmen konnten
neben einer direkten Wachstumshemmung
auch physiologische Veränderungen
im Wachstum beobachtet
werden. So ist eine Reihe von Extrakten
in der Lage, die Sporulationsfähigkeit
des Basidiomyzeten Sporidiobolus
johnsonii zu unterdrücken oder
drastisch zu verzögern, was sich ebenfalls
im Assay ablesen lässt.
Zytotoxizitätsbestimmung. Die Toxizität
eines Extrakts auf CHO-K1 Zellen
wird im Projekt standardisiert in
einer Verdünnung von 1:1.000 bestimmt
und in Prozent Überlebensrate,
verglichen mit der reinen Lösungsmittelkontrolle,
angegeben. In Abbildung
4 sind die bislang getesteten Extrakte
sowie die zugehörigen Medienkontrollen
gemäß ihrer Zytotoxizität
gruppiert. Der prozentuale Anteil der
einzelnen Gruppen ist als Balken wiedergegeben.
Auch hier sind die Ergebnisse
mit den Medienkontrollen abgeglichen
und entsprechend bereinigt.
Nach Abgleich zeigen demnach etwa
5% der getesteten Extrakte eine signifikante
Zytotoxizität.
Chemische Profilierung. Parallel
zum Aktivitätsscreening werden alle
Rohextrakte chemisch-analytisch charakterisiert.
Die effizienten Methoden
der TLC (Dünnschichtchromatographie)
mit ausgewählten Sprühfärbereagenzien
und die gekoppelte HPLC-UV
und HPLC-MS sind als Analyseverfahren
gut etabliert. Durch die kontinuierliche
Verbesserung der verfügbaren
Technologien (z.B. HPLC/MS-MS) und
die gezielte Verwendung von Datenbanken
zur Dereplikation führen sie immer
schneller zu aussagekräftigen Ergebnissen.
Primärhit-Rohextrakte aus Extremophilen
werden über HPLC fraktioniert
und ihre chemischen wie biologischen
Profile aufgestellt. Über den Abgleich
mit Datenbanken werden Wirkstoffkandidaten
mit neuen biologischen
und/oder chemischen Eigenschaften
identifiziert und Produzenten für die
Scale-up-Kultivierungen priorisiert, um
potenziell neuartige Wirkstoffe im präparativen
Maßstab zu isolieren.
Priorisierung
Priorisierte Kandidaten aus den verschiedenen
Primärscreening Assays

46 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
werden in der zweiten Projektphase
naturstoffchemisch weitergehend untersucht.
Für die Strukturaufklärung,
Charaktierisierung und biologische
Testung neuartiger Strukturen sind jedoch
ausreichende Substanzmengen
(5-20 mg) notwendig. In einer Reihe
von Fermentationen (10-50 l) wird
daher zunächst genügend Zellmaterial
für die Isolierung der aktiven Substanzen
und für die Konstruktion von
Genbanken angezogen. Zurzeit läuft
bereits die Strukturanalyse mehrer Verbindungen,
die auf diese Weise isoliert
wurden.
Für eine differenzierte Analyse und
Entwicklung strukturneuer Wirkstoffkandidaten
werden anschließend zelluläre
Assay-Systeme angewendet.
BRAIN hat hierzu eine Tool-Box entwickelt,
die es ermöglicht, funktionell
gekoppelte cell-based Assays modular
aufzubauen. Elemente dieses modularen
Baukastens sind neben verschiedensten
Säugerzellen auch Plasmidvektoren
für die Expression von Rezeptoren,
intrazellulären Signaltransduktionsproteinen
und spezifischen
Reportergenen. Je nach Fragestellung
können diese Elemente de novo zu einem
zellbasierten Testsystem aufgebaut
werden, das ein funktionell gekoppeltes
und quantitativ auslesbares Signal
erzeugt.
Mit Hilfe dieser cell-based Assays
können Agonisten und Antagonisten
von medizinisch relevanten zellulären
Zielstrukturen gescreent und identifiziert
werden. Zusätzlich ermöglichen
sie es aber auch, wichtige Informationen
über den Wirkmechanismus (Signaltransduktion)
der pharmakologisch
wirksamen neuen Naturstoffe zu
gewinnen. Im Fokus dieser Arbeiten
stehen Rezeptoren, die im Zusammenhang
mit neoplastischen oder immunologischen
Krankheitsbildern stehen.
Ein flexibles Vektorsystem
zur rekombinanten
Produktion neuartiger
Wirkstoffe im großen
Maßstab
Aufgrund der Tatsache, dass extremophile
Mikroorganismen nur unter erheblichem
technischen Aufwand kultiviert
und dabei in der Regel nur geringe
Substanzmengen gewonnen werden
können, besteht ein hohes Interesse
an der heterologen Expression
genetischer Information aus extremophilen
Quellen in leicht handhabaren,
(biosynthetisch) kompetenten Wirtsstämmen.
Für die Nutzung des genetischen
Potentials priorisierter Isolate
und die rekombinante Darstellung der
Abb. 5: Schematische Darstellung der Funktionsweise des pLIL ® EX Vektorsystems.
Wirkstoffe im großtechnischen Maßstab
sind zwei Kriterien von entscheidender
Bedeutung. Einerseits sollten
die Klone einer Genbank möglichst
große Genomfragmente tragen, damit
die für die Wirkstoffe verantwortlichen
Biosynthesegencluster vollständig kloniert
werden können. Andererseits
wäre es vorteilhaft, die klonierte genetische
Information in verschiedenen
Wirten exprimieren zu können, um
das geeignetste System für die Produktion
des jeweiligen Wirkstoffes zu finden.
Hierzu hat BRAIN ein BAC Vektorsystem
(pLIL ® EX) entwickelt, das
über die gewünschte Insertkapazität
von bis zu 300 kb verfügt. Außerdem
ermöglicht es, durch Konversion des
Vektors in verschiedene wirtsspezifische
Shuttle-Vektoren einzelne Hitklone
oder ganze Genbanken in ausgewählten
Expressionswirten zur Expression
zu bringen (Abb. 5). Die
Darstellung der Genbanken erfolgt bei
BRAIN bzw. durch die AG Kletzin und
ist eng mit dem Fortschreiten der chemischen
Aufarbeitungen korreliert.
Zusammenfassung
Bereits zum gegenwärtigen Zeitpunkt
des Primärscreenings, dessen erste
Phase vor kurzem mit der Erstellung
eines Sets priorisierter Kandidaten
abgeschlossen wurde, ist ersichtlich,
dass extremophile Mikroorganismen
eine attraktive Ressource für völlig
neuartige Wirkstoffe darstellen. Erste
chemische Analysen zeigen, dass Ex-
tremophile eine Reihe bioaktiver Substanzen
produzieren, die bisher unbekannt
waren bzw. therapeutisch
nicht genutzt werden. Jetzt kommt es
darauf an, mithilfe der neu entwickelten
genetischen Tools eine großtechnisch
realisierbare nachhaltige Produktion
der Wirkstoffe zu ermöglichen.
Parallel wird das Primärscreening
auch in den weiteren Projektphasen
fortgesetzt werden, um aus den zur
Verfügung stehenden Organismen ein
möglichst vollständiges und umfangreiches
Kandidatenset zu generieren.
Neben den schon genannten Ressourcen
werden zunehmend auch extremophile
Stämme aus den Sammlungen
der BRAIN AG sowie der Arbeitsgruppe
Grond eingebunden, um damit
die Diversität weiter zu erhöhen.
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287 (2000), 640-642.
Korrespondenzadresse
Dr. Guido Meurer
BRAIN Biotechnology Research And
Information Network AG
Darmstädter Str. 34
D-64673 Zwingenberg
Tel.: 06251-9331 29
Fax: 06251-9331 11
eMail: gm@brain-biotech.de

L-GLYCEROL-3-PHOSPHAT
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
47
Genetische Optimierung der
Bäckerhefe zur Produktion von
L-Glycerol-3-Phosphat
� Huyen Thi Thanh Nguyen M.S. 1 , Almut Dieterich2 , Prof. Dr. Ulf Stahl1 , Dr. Elke Nevoigt1 1 2 Institut für Biotechnologie, Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik, Technische Universität Berlin, Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berlin (VLB)
L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) ist ein Zwischenprodukt des Zellstoffwechsels, das den Zucker- mit dem Glycerolmetabolismus und der Biosynthese der
Glycerolipide verbindet. Als potenzieller Precursor für die enzymatische Synthese von Monosacchariden und Phospholipiden ist L-G3P von großem wirtschaftlichen
Interesse, insbesondere im Rahmen der Entwicklung neuartiger Pharmaka. Die Gewinnung dieser Substanz aus gentechnisch veränderter
Bäckerhefe erlaubt die Nutzung nachwachsender Rohstoffe, z. B. Melasse, und ermöglicht die preiswerte Bereitstellung großer Mengen an stereochemisch
reinem L-G3P. Die intrazelluläre L-G3P-Konzentration in der Hefe S. cerevisiae konnte bisher durch gezielte Veränderung des Metabolitflusses
bereits auf das 100fache gesteigert werden. Die entscheidenden Schritte zum Erfolg waren gezielte Modifikationen der Enzymaktivitäten in den zu- und
abführenden Stoffwechselwegen sowie die Erhöhung von verfügbarem NADH, welches für die Biosynthese von L-G3P essenziell ist.
Keywords: Hefe, Saccharomyces cerevisiae, L-G3P, Glycerol, NADH, Monosaccharide, Phospholipide.
L-G3P – ein vielseitiger
Ausgangsstoff für
enzymatische Synthesen
Das natürlich vorkommende L-Enantiomer
der Glycerophosphorsäure (L-
G3P) ist ein viel versprechender Ausgangsstoff
für die Synthese von Monosacchariden
und Glycerophospholipiden.
Diese Substanzklassen sind von
besonderem Interesse für die Entwicklung
neuartiger Medikamente und Impfstoffe
gegen Krebs und Infektionskrankheiten.
Erste Erfolge hat die Pharmakologie
damit bereits vorzuweisen [1,2].
Monosaccharide können aus L-G3P
über das Zwischenprodukt Dihydroxyacetonphosphat
(DHAP) mit Hilfe
von Aldolasen stereospezifisch synthetisiert
werden. Glycerophospholipide
werden derzeit großtechnisch mit Hilfe
von Phosphoroxychlorid hergestellt,
einer Substanz, die giftig und nur unter
Gefahr zu handhaben ist. Die Entwicklung
eines enzymatischen Verfahrens,
das in Anlehnung an den natürlichen
Biosyntheseweg von L-G3P ausgeht,
ist daher wünschenswert.
Vorteile der biotechnologischen
Produktion
von L-G3P gegenüber den
herkömmlichen
Herstellungsverfahren
Es existieren verschiedene Protokolle
für die chemische Synthese von L-
G3P (vgl. Merck-Index). Aufgrund des
hohen Arbeitsaufwands, entweder für
die Bereitstellung elaborierter Ausgangsstoffe
oder für die Aufreinigung
des L-Enantiomers aus komplexen
Produktgemischen, sind diese Me-
thoden aber für großtechnische Verfahren
unwirtschaftlich. Auch der
Einsatz von isolierten Enzymen führt
nicht zum Durchbruch, da entweder
die Kofaktorregeneration ein unge-
Abb. 1: Skizze der hier relevanten Stoffwechselwege, Enzyme und Gene
der Bäckerhefe. Abkürzungen: L-G3P, L-Glycerol-3-phosphat; DHAP, Dihydroxyacetonphosphat;
GAP, Glycerolaldehyd-3-phosphat; FBP, Fruktose-
1,6-biphosphat; TPI1, Triosephosphatisomerase; GPP1/2, cytosolische
Glycerol-3-phosphatase; GPD1/2, Glycerol-3-phosphatdehydrogenase;
GUT2, mitochondriale FAD-abhängige Glycerol-3-phosphatdehydrogenase;
PDC1/2/5, Pyruvatdecarboxylase; NDE1/2, externe mitochondriale
NADH-Dehydrogenase; ADH1, Alkoholdehydrogenase. Die zur Akkumulation
von L-G3P modifizierten Gene sind rot gekennzeichnet.
* Diese Enzyme übertragen Reduktionsäquivalente von NADH direkt bzw.
indirekt auf die Atmungskette und sind daher nur bei Kultivierung der Zellen
in Anwesenheit von Sauerstoff relevant.
löstes Problem bleibt (Einsatz von
Glycerolkinase und ATP als Phosphatdonor
[3]) oder das verwendete
Enzym nur Regio- aber keine Stereoselektivität
aufweist (Einsatz von
Phosphatase und Pyrophosphat als
Phosphatdonor [4,5]). Letzteres
führt dazu, dass das gewünschte L-
Enantiomer nur zu 50% gebildet
wird.
Eine bisher ungenutzte Möglichkeit
besteht darin, L-G3P auf biotechnologischem
Weg herzustellen, und
zwar mit Hilfe einer genetisch modifizierten
Bäckerhefe. Die Vorteile eines
solchen Verfahrens liegen auf der
Hand: Es entsteht nur das L-Enantiomer,
sämtliche Kofaktoren werden
durch den Zellstoffwechsel bereitgestellt
und billige und nachwachsende
Rohstoffe wie Melasse können
eingesetzt werden.
Die Position von L-G3P im
Hefestoffwechsel
S. cerevisiae bildet L-G3P aus Zukkern
im Rahmen der Glycerolbiosynthese
durch Reduktion des Glykolyseintermediats
DHAP (Abb. 1). Dieser
Schritt wird von der cytosolischen
NAD-abhängigen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase
(GPD) katalysiert.
Das entsprechende Enzym wird
von den beiden Isogenen GPD1 und
GPD2 kodiert. Die Dephosphorylierung
von L-G3P zu Glycerol erfolgt
durch die Glycerol-3-Phosphatase

48 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
(GPP), die ebenfalls durch zwei Isogene,
GPP1 und GPP2, kodiert wird.
Außerdem benötigt die Hefe L-G3P
zur Biosynthese von Glycerolipiden,
die wichtige Bestandteile der Biomembranen
sind. Ausgehend von L-
G3P wird der erste Schritt in Richtung
dieser Glycerolipide von der L-
G3P-Acyltransferase katalysiert.
Gezielte Beeinflussung der
Aktivität auf- und
abbauender Enzyme
Wenn L-G3P in der Hefe angestaut
werden soll, muss seine Biosynthese
verstärkt und die Weiterverstoffwechselung
unterbunden werden. Es wurde
bereits gezeigt, dass eine Erhöhung
der Aktivität des Enzyms GPD
den Kohlenstofffluss ausgehend von
der Glukose wirksam in Richtung
Glycerol lenken kann, die GPD somit
das geschwindigkeitsbestimmende
Enzym der Glycerolbildung bei S. cerevisiae
ist [6]. Eine etwa 20fache
Erhöhung der GPD-Aktivität wurde
erreicht, indem das Gen GPD1, eines
der beiden Isogene des Enzyms, in
hoher Kopiezahl in der Hefe exprimiert
wurde. Dazu wurde das entsprechende
Gen unter der Kontrolle
seines natürlichen Promotors in ein
Multicopy-Plasmid kloniert und in
die Hefe eingebracht. Um den Einfluss
der Überexpression von GPD1
zu untersuchen, wurde ein Vergleichsstamm
erstellt, indem ein leerer
Vektor in den Wildtypstamm
transferiert wurde.
Die deutliche Erhöhung der GPD-
Aktivität in der Multicopy-Transformante
wirkte sich allerdings nicht auf
den metabolischen Vorläufer von
Glycerol aus, so lange die Aktivität des
abbauenden Enzyms GPP nicht reduziert
war (Abb. 2, Ausgangsstamm).
Offenbar reicht die GPP-Aktivität im
Wildtyp aus, um das durch die erhöhte
GPD-Aktivität zusätzlich gebildete
L-G3P sofort und vollständig zu Glycerol
weiterzuverstofffwechseln.
Wenn jedoch die Dephoshorylierung
zu Glycerol unterbunden wurde
(Abb. 1), führte die GPD1-Überexpression
zu der erwünschten Akkumulation
von L-G3P. Bereits die
Ausschaltung eines der beiden Isoenzyme
(gpp1∆) erhöhte den intrazellulären
G3P-Gehalt sichtbar, wenn
gleichzeitig die Aktivität der GPD gesteigert
wurde (Abb. 2). Die zusätzliche
Deletion des zweiten Isogens
(gpp1∆ gpp2∆), gleichbedeutend
mit der vollständigen Aufhebung der
zellulären GPP-Aktivität, war im Hinblick
auf die erwünschte Akkumula-
Abb. 2. Intrazelluläre Akkumulation von L-G3P im Ausgangsstamm, der
gpp1∆ Einfach- und der gpp1∆ gpp2∆ Doppelmutante von S. cerevisiae
jeweils mit und ohne Überexpression des Gens GPD1. Für die Extraktion
wurden die Zellen in glukosehaltigem Mineralmedium im Schüttelkolben
kultiviert und in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase geerntet.
Die gezeigten Daten sind Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei
bzw. drei unabhängigen Experimenten.
tion der Zielsubstanz noch wirkungsvoller.
Kombiniert mit der GPD-Überproduktion
stieg der G3P-Spiegel im
Vergleich zum Ausgangsstamm auf
das 26fache an (Abb. 2).
Das Wachstumsverhalten der Hefe
wurde durch die Deletion von GPP1
und GPP2 nur geringfügig negativ beeinflusst.
Allerdings hatte die Überproduktion
von GPD1 in allen Stämmen
eine Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeit
zur Folge. Dies
kann durch den Netto-Verlust an ATP
und die Anstauung des cytotoxischen
Intermediats Acetaldehyd erklärt werden.
Beides sind Nebeneffekte der
Stoffwechselverschiebung in Richtung
L-G3P, die durch die stark erhöhte
GPD-Aktivität ausgelöst werden
[7]. Die Doppelmutante gpp1∆
gpp2∆ mit GPD1-Überexpression
weist eine im Vergleich mit dem Wildtypstamm
um etwa 30% reduzierte
Wachstumsgeschwindigkeit auf.
Einfluss von osmotischem
Stress auf die
Akkumulation von L-G3P in
den genetisch modifizierten
Hefestämmen
Es ist bekannt, dass hyperosmotischer
Stress in der Lage ist, den Hefemetabolismus
in Richtung Glycerol zu lenken.
Das verstärkt gebildete Glycerol
wirkt unter diesen Bedingungen dem
Wasserausstrom aus den Zellen entgegen.
Die Forcierung der Glycerolbiosynthese
wird bei osmotischem
Stress hauptsächlich durch die Induktion
der Transkription von GPD1 reguliert.
Außerdem gibt es eine Reihe
weiterer, weniger drastischer Enzymaktivitätsveränderungen,
die ebenfalls
zur beschriebenen Stoffwechselverschiebung
beitragen könnten [8,9].
Das Gen GPD1, welches in verschiedenen
Hefestämmen überexprimiert
wurde (siehe oben), steht unter der
Kontrolle seines natürlichen Promoters.
Daher wurde erwartet, dass die
bereits erhöhte Aktivität der GPD in
den entsprechenden Stämmen weiter
steigt, wenn die Zellen osmotischem
Stress ausgesetzt werden. Tatsächlich
führte die Zugabe von 0,5 M NaCl zu
einer etwa vierfach erhöhten GPD-
Enzymaktivität in dem Stamm gpp1∆
gpp2∆ mit GPD1-Überexpression
(Tab. 1). Eine wesentliche Erhöhung
des L-G3P-Spiegels blieb allerdings
aus – ein Hinweis darauf, dass es neben
der spezifischen GPD-Aktivität
andere Faktoren gibt, die in dem modifizierten
Hefestamm die L-G3P-Akkumulation
begrenzen. Mögliche limitierende
Faktoren sind die cytosolische
Verfügbarkeit von NADH, einem
wichtigen Kofaktor für die Synthese
von L-G3P (Abb. 1 und unten), oder
eine Produktinhibierung der GPD
durch L-G3P.
Die Verfügbarkeit von
cytosolischem NADH als
limitierender Faktor für die
Erhöhung des L-G3P-
Gehalts
Bei der Batch-Fermentation im Schüttelkolben,
in der die in Abb. 2 gezeigten
Daten erhoben wurden, stand den
Zellen Sauerstoff zur Verfügung. Es ist
möglich, dass unter diesen Bedingungen
ein Teil des cytosolischen NADH,
welches von der GPD als Kofaktor benötigt
wird, in respiratorische Prozesse
abfließt und damit nicht für die L-
G3P-Synthese zur Verfügung steht.
Sauerstofflimitierung schaltet diese
Prozesse aus. Weder die externe mitochondriale
NADH-Dehydrogenase
(NDE1/2) noch der so genannte
Glycerolphosphat-Shuttle (GUT2)
können Elektronen über die Atmungskette
auf den Endakzeptor Sauerstoff
überführen (Abb. 1) [10]. Deshalb
wurde die Fermentation mit dem
Stamm gpp1∆ gpp2∆ mit GPD1-Über-
Tab. 1: Auswirkungen von hyperosmotischem Stress und Sauerstofflimitierung auf die intrazelluläre Akkumulation
von L-G3P in der gpp1∆ gpp2∆ Doppelmutante mit Überexpression des Gens GPD1. Die Zellen wurden in glukosehaltigem
Mineralmedium im Schüttelkolben vorkultiviert. Anschließend wurden die Batch-Fermentationen in
dem angegebenen Medium mit einer OD 600 von etwa 1,5 beimpft und kultiviert, wie in der Tabelle ausgewiesen.
Nach 4 Stunden wurden die Zellen für die Messung der spezifischen GPD-Aktivität und die Extraktion von L-G3P
geerntet. Die gezeigten Daten sind jeweils Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei unabhängigen Experimenten.
Kultivierungs- Spezifische GPD-Aktivität Intrazelluläre L-G3P-Konzentration
bedingungen (U/mg protein) (mg/g Hefetrockenmasse)
Referenz 1) 2.3 ± 0.8 4.5± 0.5
Hyperosmotischer Stress 2) 9.0 ± 2.1 5.2 ± 0.7
Sauerstofflimitierung 3) 2.7 ± 0.3 7.2 ± 1.3
1) Aerobe Batch-Fermentation in Mineralmedium im Schüttelkolben.
2) Zugabe von 0,5 M NaCl zum Kultivierungsmedium.
3) Die Schüttelkolben wurden mit Gäraufsätzen versehen, so dass zwar die Freisetzung des entstehenden CO2 ermöglicht wurde, jedoch nicht die Zufuhr von O 2 .

expression auch unter Sauerstofflimitierung
durchgeführt. Bei nur minimaler
Aktivitätssteigerung der GPD, die
auf die Induktion des Isoenzyms
Gpd2p zurückzuführen ist [11], steigt
die intrazelluläre Konzentration von L-
G3P verglichen mit der aeroben
Batch-Fermentation um 60% (Tab. 1).
Dieses Ergebnis beweist, dass die Verfügbarkeit
von cytosolischem NADH
ein wichtiger limitierender Faktor für
die L-G3P-Akkumulation in dem modifizierten
Hefestamm ist. Als Alternative
zur Nutzung anaerober Fermentationsbedingungen
ist eine genetische
Optimierung der Hefestämme denkbar.
Das bedeutet eine simultane Ausschaltung
aller Gene, deren Produkte
an den genannten Prozessen beteiligt
sind, nämlich NDE1, NDE2 und GUT2.
Erhöhung der Verfügbarkeit
von NADH durch
Verminderung des
Metabolitflusses durch die
alkoholische Gärung
Auch wenn es gelungen ist, die Übertragung
der Elektronen von NADH auf
die Atmungskette vollständig zu unterbinden
(siehe oben), bleibt in der
Hefe der Hauptweg für die Reoxididation
des glykolytisch gebildeten
NADH die alkoholische Gärung. Die
GPD muss bei der Synthese von L-G3P
mit der Alkoholdehydrogenase (ADH)
um das Reduktionsäquivalent NADH
konkurrieren. Wird der Metabolitflux
durch die alkoholische Gärung reduziert,
steigt die Konkurrenzfähigkeit
der GPD um das NADH. Bereits 1918
konnte Carl Neuberg zeigen, dass Hefen
wesentlich mehr Glycerol produzieren,
wenn innerhalb der alkoholischen
Gärung der Akzeptor für NADH,
das Acetaldehyd, mit Hilfe von Sulfit
komplexiert und so aus dem Reaktionsgemisch
entfernt wird. Auch auf
gentechnischem Weg wurde der
NADH-Verbrauch während der alkoholischen
Gärung gedrosselt. Die Reduzierung
sowohl der Aktivität der
ADH [12] als auch der Pyruvatdecarboxylase
(PDC) [6] führte zu einer
Verschiebung des Stoffwechsels in
Richtung Glycerol auf Kosten der Ethanolbildung.
Im Rahmen der hier vorgestellten
genetischen Optimierung wurde das
Gen PDC2 deletiert, um den Flux
durch die alkoholische Gärung zu vermindern.
PDC2 kodiert einen positiven
Regulator der Transkription von
PDC1 und PDC5, den Strukturgenen
für die PDC in S. cerevisiae.
Das Gen PDC2 wurde mittels der
„one-step gene disruption method“
Abb. 3. Intrazelluläre Akkumulation von L-G3P in der gpp1∆ gpp2∆ Doppel-
und der gpp1∆ gpp2∆ pdc2∆ Dreifachmutante von S. cerevisiae jeweils
mit und ohne Überexpression des Gens GPD1. Die Zellen wurden
zunächst in Medium mit nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen im
Schüttelkolben vorkultiviert, um das Wachstum der Mutante mit der
PDC2-Deletion zu ermöglichen. Anschließend wurden die Batch-Fermentationen
in glukosehaltigem Medium mit einer OD 600 von etwa 1,5 beimpft.
Nach 6 Stunden Inkubation unter Sauerstoffabschluss wurden die Zellen
für die Extraktion von L-G3P geerntet. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte
mit Standardabweichungen aus zwei unabhängigen Experimenten.
zunächst in der gpp1∆-Einfachmutante
deletiert, was zu der Mutante
gpp1∆ pdc2∆ führte. Um die Dreifachmutante
gpp1∆ gpp2∆ pdc2∆ zu
erhalten, sollte die gpp1∆ gpp2∆-
Doppelmutante mit dem gleichen Verfahren
modifiziert werden. Dies war
jedoch nicht möglich, da vermutlich
ein Wachstumsdefekt der Dreifachmutante
eine direkte Selektion verhinderte.
Ein kleiner methodischer
Umweg führte jedoch zum Erfolg. Die
Stämme gpp1∆ gpp2∆ und gpp1∆
pdc2∆ wurden miteinander gekreuzt,
die Sporulation induziert und aus den
Sporen ein Stamm selektiert, der die
gewünschte Dreifachmutation gpp1∆
gpp2∆ pdc2∆ trug. Dieser Hefestamm
reicherte etwa 12,8 mg/g Hefetrockenmasse
L-G3P an. Dieses Niveau
konnte noch um über 30% gesteigert
werden, wenn zusätzlich das
Gen GPD1 überexprimiert und damit
der Metabolitfluss in Richtung L-G3P
verstärkt wurde. Der letztgenannte
Stamm akkumuliert 17 mg/g Hefetrockenmasse
L-G3P; diese Konzentration
beträgt das rund 100fache der
Ausgangssituation (Abb. 2). Allerdings
bildet die Dreifachmutante in
Glukose als Kohlenstoffquelle kaum
Biomasse. Die Ursache für den
Wachstumsdefekt, der bei pdc2∆
auch von anderen Autoren beobachtet
wurde [13,14], ist unbekannt. Bislang
schien plausibel, dass der Fluss
durch die Glykolyse aufgrund von
NAD-Mangel reduziert wird. Dies
konnte jedoch nicht bestätigt werden.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
49
Die erhöhte Kapazität zur NADH-Regeneration
im Rahmen der GPD-Reaktion
hätte sonst den Wachstumsdefekt
der pdc2∆-Mutante aufheben
müssen.
Ausblick
Die L-G3P Konzentration in S. cerevisiae
konnte bisher auf das 100fache
angehoben werden. Allerdings
zeigt gerade der Stamm, der hervorgerufen
durch die PDC2-Deletion die
höchste L-G3P-Akkumulation aufweist,
im zuckerhaltigen Medium das
geringste Wachstum. Um die Biomasseproduktion
während der großtechnischen
Fermentation zu beschleunigen,
ist daher eine zeitliche Entkoppelung
von der L-G3P-Bildung wünschenswert.
Dies könnte durch den
Einsatz von Ribozymen in Kombination
mit einem induzierbaren Promotor
erreicht werden. Eine andere
Herangehensweise besteht darin, die
molekularen Ursachen für den Wachstumsdefekt,
der durch die PDC2-Deletion
erzeugt wird, zu finden und
durch geeignete Modifikationen aufzuheben.
Die biotechnologische Gewinnung
eines Stoffwechselendprodukts endet
in der Regel mit der Aufreinigung aus
dem Medium. Das energiereiche
phosphorylierte Zwischenprodukt L-
G3P wird hingegen auch bei maximaler
intrazellulärer Anstauung nicht
ausgeschieden. Folglich wäre ein
Zellaufschluss nötig, um L-G3P zu ge-
winnen. Dies mindert jedoch die
Wirtschaftlichkeit des Verfahrens.
Daher werden sich zukünftige Arbeiten
darauf konzentrieren, die Hefestämme
so zu modifizieren, dass sie
die Zielsubstanz in das Medium entlassen.
Damit wird nicht nur die Aufarbeitung
vereinfacht, sondern auch
die Produkthemmung der GPD aufgehoben,
sodass eine weitere Steigerung
der Ausbeute möglich sein sollte.
Literatur
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Pronk, J. T., Biotechnol. Bioeng. 66
(1999), 42-50.
Korrespondenzadresse
Dr. Elke Nevoigt
Institut für Biotechnologie
Fachgebiet Mikrobiologie und
Genetik
Technische Universität Berlin
Gustav-Meyer-Allee 25
13355 Berlin
Tel.: 030-314 275 97
Fax: 030-314 275 92
eMail: e.nevoigt@lb.tu-berlin.de

50 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
WIRKSTOFFVORSTUFEN
Umweltverträgliche Synthese
chiraler 2-Oxazolidinone
� Dr. Martin Bertau 1 , Dr. Thomas Daußmann 2 , 1 Institut für Biochemie, TU Dresden, 2 JFC - Jülich Fine Chemicals GmbH
Die moderne Synthesevariante zur Herstellung der für viele moderne Wirkstoffe essenziellen chiralen 5- und 4,5-disubstituierten 2-Oxazolidinonen ausgehend
von β-Ketoestern umgeht klassische umweltgefährdende Verfahren durch einen hochstereoselektiven intramolekularen, cyclisierenden Curtius-
Abbau. Der für die Einführung der stereochemischen Information erforderliche biokatalytische Schlüsselschritt zur β-Hydroxyester-Zwischenstufe besitzt
bezüglich seiner Aufarbeitung noch erhebliches Entwicklungspotenzial. Ursache sind vom Biokatalysator Saccharomyces cerevisiae produzierte
Bioemulgatoren, welche bei extraktiver Aufarbeitung die Wertstoffgewinnung aus der wässrigen Phase infolge Bildung stabiler Gele und Schleime erheblich
beeinträchtigen. Die durch die Aufwändigkeit der Aufarbeitungssequenz bedingten Produktverluste von bis zu 20% werden durch biokatalytischen
Abbau der Bioemulgatoren vermieden, wodurch die Gesamtausbeute der 2-Oxazolidinonsynthese von ca. 75% auf ≥96% gesteigert werden kann.
Einleitung
Chirale 5- und 4,5-funktionalisierte
2-Oxazolidinone sind für die pharmakologische
Wirksamkeit vieler
moderner Wirkstoffe essenzielle
Strukturglieder [1,2]. Ihre Synthese
ist sehr aufwändig und verwendet
häufig hochaggressive Reagenzien,
wie z.B. Phosgen oder schwermetallkatalytisch
aktiviertes Kohlenmonoxid
[3]. Infolge der oft harschen
Reaktionsbedingungen geht
wertvolle Stereoinformation während
der Synthesesequenz verloren,
gleichzeitig steigen Materialaufwand
und Abfallmengen. Ein brauchbares
umweltverträgliches Synthesekonzept
muss daher weitgehend auf umweltgefährdende
Chemikalien verzichten
und gleichzeitig die Zielverbindung
mit hoher Atomökonomie
und Stereoisomerenausbeute liefern.
2-Oxazolidinonsynthese
Dieser hohe synthetische Anspruch
wird als Eintopfprozess über eine
hochselektive intramolekulare Sextettumlagerung
unter vollständiger
Retention der Stereokonfiguration
realisiert, welcher die stereoisomerenreinen
2-Oxazolidinone ausgehend
von kommerziell günstig
erhältlichen β-Ketoestern erzeugt
[4]. Das Einführen der Stereoinformation
über eine Ganzzellbiotransformation
ist alternativlos hinsichtlich
der Realisierbarkeit der contrathermodynamischenstereoselektiven
reduktiven Synthese cyclischer
β-Hydroxyester (Abb. 1).
Damit vereinigt dieses Verfahren
die Vorteile der Biokatalyse im Sin-
ne der Nachhaltigen Chemie mit den
Vorteilen der Eintopfsynthese unter
gänzlicher Umgehung umweltgefährdender
Reagenzien. Die Verfügbarkeit
der cyclischen β-Hydroxyester
in hoher Stereoisomerenreinheit ist
die zentrale Grundvoraussetzung für
die Oxazolidinonsynthese.
Downstream-Processing
Die zentrale Komplikation bei der
Aufarbeitung von Ganzzellbiotransformationen
ist erheblicher Produktverlust
durch Gel- und Schleimbildungsphänomene.Typischerweise
wird die Emulgationsproblematik
durch große Lösungsmittelmengen
oder im Labormaßstab durch die gefahrbelastete
Zentrifugation der
Ether/Wasser-Gemische gelöst [5].
Das neue Verfahren verfolgt die
enzymatische Spaltung der von der
Hefe ins Medium sezernierten
Bioemulgatoren (Abb. 2). Dieser
doppelt-biokatalytische Ansatz aus
mikrobieller Reduktion und enzymatischer
Spaltung der Bioemulgatoren
ist somit auch für konfigurativ
und thermisch labile β-Hydroxyester
geeignet. Finanzintensive Investitionen
in teure Alternativtechnologien
werden so vermieden, der
Zeitfaktor wird erheblich reduziert
und die für die Stereoisomerenverteilung
kritische Zeitspanne der Produktaufarbeitung
wird drastisch
minimiert.
Abb. 1: Oxazolidinonsynthese.
Nebenproduktproblematik
Während der Aufarbeitung reagieren
β-Hydroxyester unter thermischer Belastung
(destillative Reinigungsoperationen)
durch Wasserabspaltung zu
reaktiven Michael-Systemen. Verluste
entstehen auch durch Hydrolyse der
β-Ketoester-Substrate, die unter spontaner
Abspaltung von CO 2 zu reakti-
Abb. 2: Vergleich der Aufarbeitungsverfahren.
ven Ketonen führt. Diese unselektiven
Reaktionen beeinträchtigen Stereoselektivität
und Ausbeute. Sie bedingen
so Verluste in der Wertschöpfungskette
und stellen ein Entsorgungsproblem
dar. Vor allem aber ist die Anwesenheit
energiereicher instabiler Nebenprodukte
gerade bei thermischen Aufarbeitungsprozeduren
kritisch. Der
doppelt-biokatalytische Ansatz dient
dazu, thermisch belastende, neben-
produktbildende destillative Reinigungsschritte
zu umgehen.
Schlussbemerkung
Die Deemulgation der Kulturbrühe/
Lösungsmittel-Gemische und die Unterdrückung
kritischer Nebenreaktionen
kann die Gesamtausbeute der 2-
Oxazolidinonsynthese von ca. 76% auf
≥96% steigern. Die hohe Ausbeute,
erreicht durch die Kopplung zweier
biokatalytischer Teilschritte, belegt
den hohen innovativen Charakter dieses
umweltschonenden Verfahrens.
Referenzen
[1] Sugiyama, S., Watanabe, S., Inoue, T.,
Kurihara, R., Itou, T., Ishii, K., Tetrahedron
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D.L., Aristoff, P.A., Ford, C.W.,
Tarpley, W.G., Curr. Opin. Pharmacol.
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Chem. Rev. 96 (1996), 835-875.
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12 (2001), 2103-2107.
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F., Torre, G., Enzyme Microbiol. Technol.
25 (1999), 149-152.
Korrespondenzadresse
Dr. Martin Bertau
Technische Universität Dresden
Institut für Biochemie
D-01062 Dresden
Tel.: +49-(0)351-463-38355
Fax: +49-(0)351-463-35506
eMail: martin.bertau@chemie.tudresden.de
www.chm.tu-dresden.de/bc

PHOSPHOLIPASEN
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
51
Phospholipasen in der Biokatalyse
� Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann, Fachbereich Biochemie/Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Phospholipasen sind ubiquitär vorkommende hydrolytische Enzyme, die für die spezifische Spaltung der vier Esterbindungen in Glycerophospholipiden
verantwortlich sind. Entsprechend unterscheidet man Phospholipase A 1 , Phospholipase A 2 , Phospholipase C und Phospholipase D. Phospholipase D
nimmt eine Sonderstellung ein, da sie in Gegenwart von alkoholischen Komponenten ein hohes Transphosphatidylierungspotential besitzt, das seit langem
im chemischen Labor und in der Industrie zur Biotransformation von Phospholipiden genutzt wird. In dem vorliegenden Artikel werden die wichtigsten
Phospholipasen, die bisher biokatalytisch genutzt wurden, zusammengestellt. Es zeigt sich, dass die natürlichen Ressourcen bei weitem nicht ausgeschöpft
sind. Für Phospholipase D, die für die Gewinnung neuer Phospholipide und Phospholipidanaloga prädestiniert ist, werden einige aktuelle Forschungsergebnisse
aus der Hallenser Arbeitsgruppe unter dem Aspekt der biotechnologischen Anwendung dargelegt.
Keywords: Alkylphospholipide, Glycerophospholipide, Phospholipasen, Transphosphatidylierung.
Phospholipasen in der
Natur
Phospholipasen bilden eine Gruppe
von Enzymen, deren natürliche Funktion
in der spezifischen Hydrolyse von
Phospholipiden (genauer: Glycerophospholipiden)
zu sehen ist. Glycerophospholipide
stellen die Hauptbestandteile
biologischer Membranen
dar und besitzen hinsichtlich ihrer
chemischen Feinstruktur eine große
Variabilität. In größeren Mengen kommen
Phospholipide auch in Pflanzensamen
(z.B. von Soja, Raps und Sonnenblumen)
sowie in Hühnerei vor.
Das gemeinsame Merkmal aller Phospholipide
ist die Phosphorsäurediester-Struktur
mit einer apolaren und
einer polaren Ester-Komponente. In
Glycerophospholipiden (Abb. 1) wird
der apolare Molekülteil durch einen
Diacylglycerol-Rest gebildet, während
die polare Komponente durch eine
hydrophile (geladene oder ungeladene)
hydroxylgruppenhaltige Verbindung
wie Cholin, Ethanolamin (beide
mit positiver Ladung), Serin (zwitterionisch),
Glycerol oder Inositol (beide
ungeladen) beigesteuert wird. Die
Diacylreste stammen von Fettsäuren,
deren Zusammensetzung in natürlichen
Phospholipiden sehr heterogen
ist, sowohl was die Kettenlängen (im
Allgemeinen zwischen C 12 und C 22 ) als
auch was den Sättigungsgrad anbetrifft.
Das C2-Atom im Glycerolrest ist
ein chirales Zentrum, weshalb eine
stereospezifische Unterscheidung der
C- Reste erforderlich ist, die durch die
„stereospezifische Nummerierung
(sn)“ erfolgt. Die natürlich auftretenden
Phospholipide leiten sich vom
1,2-Diacyl-sn-glycerol ab.
Die Spezifität der in der Natur gefundenen
Phospholipasen ist primär
durch die zu spaltende Esterbindung
Abb. 1: Chemischer Aufbau eines Glycerophospholipids und Angriffsort
der Phospholipasen.
im Phospholipidmolekül (insgesamt
sind 4 Esterbindungen vorhanden)
charakterisiert. So ist Phospholipase
A 1 (PLA 1 ) spezifisch für die Abspaltung
der Fettsäure in der sn-1-Position
des Glycerolgerüsts und Phospholipase
A 2 (PLA 2 ) für die in der sn-2-
Position. Phospholipase C (PLC) katalysiert
die Hydrolyse der Phosphodiesterbindung
an der glycerolstän-
digen Seite und Phospholipase D
(PLD) an der Seite der polaren Kopfgruppe.
Darüber hinaus gibt es einige
spezielle Enzyme, die eine zusätzliche
Spezifität hinsichtlich der polaren
Alkoholkomponente besitzen, wie
die phosphatidylinositol-spezifische
PLC (PI-PLC) oder die glycosylphosphatidylinositol-spezifische
PLD (GPI-
PLD).
Tab. 1: Phospholipasen in der Biokatalyse. (Literaturangaben finden sich in [6], zu PLA 1 in [7]).
In der biochemischen Grundlagenforschung
haben Phospholipasen, insbesondere
PLA 2 , PLC und PLD viel
Aufmerksamkeit auf sich gezogen, seit
ihre Beteiligung in der Signalübertragung
bei Zellregulations- und Membrantransportprozessen
zunehmend
bekannt wurde.
Phospholipide als Träger-,
Zusatz- und Wirkstoffe
Die amphiphile Struktur der Phospholipide
(polar/unpolar) bedingt eine
besondere Eigenschaft, denen die Verbindungen
ihre große Bedeutung in
der Natur, aber auch in den verschiedensten
Praxisbereichen verdanken.
Oberhalb einer kritischen Konzentration
bilden Phospholipide definierte
supramolekulare Strukturen aus
(Abb. 2), deren Typ (Micellen, Doppelschichten,
Liposomen, hexagonale
Phasen u.a.) von der Ladung und
geometrischen Gestalt des Phospho-
Phospholipase Quelle Molekulare Masse pI pH-Optimum
(kDa)
PLA 1 Fusarium oxysporum 5,0
PLA 2 Schweinepankreas 13,9 7,4 7,9-8,4
Rinderpankreas 14,0 6,4; 7,6 8,5; 8,0
Schlangengift (Naja naja naja) 13,4 5,1 7-9
Bienengift (Apis mellifica) 19,0 10,5 8,0
PLC Bacillus cereus 23,0 6,6-8,0
Clostridium perfingens 43,0 5,4
PI-PLC Bacillus cereus 29,0 5,4 7,2-7,5
PLD Weißkohl 92 4,7 5,5
Streptomyces chromofuscus 50-57 5,1 8
Streptomyces hachijoensis 16 8,6 7,5
Streptomyces lydicus 56 7,4 6
Streptomyces sp. (Asai Kasai; Sigma) 46 4,2 5,5
Streptomyces antibioticus 64,0 6,5 5,5
Streptomyces PMF 53,864 9,1 4-6
Streptoverticillium cinnamoneum 18,2 8,44 8,5
53,879 6,0

52 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 2: Supramolekulare Strukturen der Phospholipide.
lipidmoleküls sowie dem Medium, in
dem sie sich befinden, abhängt. Andererseits
sind Phospholipide metabolisierbar
und darum sehr umweltfreundlich.
Als Strukturbildner, z.B.
in Form von Liposomen oder als
Mono- bzw. Doppelschichten auf Trägeroberflächen,
aber auch einfach als
Emulgatoren besitzen sie breite praktische
Bedeutung. In der pharmazeutischen
Industrie spielen Phospholipide
eine wichtige Rolle als Träger für
Arzneistoffe und als Füllstoffe. Auch
bei der Herstellung von Kosmetika
besitzen sie einen hohen Stellenwert
Abb. 3: Phospholipidabkömmlinge und -analoga.
als Emulgatoren und Liposomenmaterial.
Ein großer Bedarf für Phospholipide
besteht darüber hinaus in der
Lebensmittelindustrie. Als Zusatz zu
Margarine, Käse, Schokolade, Backwaren,
Teigwaren und Instantprodukten
(Milchpulver, Kakao, Backmischungen)
bewirken sie die Bildung
und Stabilisierung von Emulsionen,
binden Wasser oder verändern Kristallisationseigenschaften.
Auch in vielen
anderen Industriezweigen werden
Phospholipide als wichtige Zusatzstof-
fe benötigt, z. B. in der Druck- und
Fotoindustrie, in der Textil- und in der
Baustoffindustrie.
Aktuelle Forschungsergebnisse,
die für verschiedene Vertreter bzw.
Abkömmlinge der Phospholipide
eine entscheidende Rolle als sekundäre
Botenstoffe (second messenger)
in biologischen Signalwandlungsprozessen
nachweisen konnten [1], lieferten
einen neuen Zugang zum Verständnis
wichtiger Zellregulationsvorgänge,
wie sie für die Entstehung und
Therapie vieler bisher noch nicht
oder schwer zu beherrschender
Krankheiten (Tumoren, Immunkrankheiten,
Alzheimer, Diabetes)
von entscheidender Bedeutung sind.
Eng verknüpft mit der Bedeutung
von Phospholipiden für pathologische
Vorgänge in der Zelle ist die
Wirkung exogener Phospholipide
bzw. Phospholipidanaloga auf zelluläre
Prozesse, wie sie in der pharmakologischen
Forschung seit etlichen
Jahren untersucht wird [2]. Bei der
Aktivierung der körpereigenen Immunabwehr
gegenüber Infektionen
und Tumoren, aber auch bei Alzheimer-Erkrankungen
und Diabetes
konnten therapeutische Effekte von
Phospholipidstrukturen gefunden
werden. Seit vielen Jahren ist bekannt,
dass verschiedene Lysophosphatidylverbindungen
(Abb. 3a) diese
Funktion erfüllen, wobei sie allerdings
zu schnell metabolisiert werden,
um nachhaltig wirksam zu sein.
Dieser Nachteil führte zur Entwicklung
der strukturmodifizierten Alkyllysophospholipide
[3] (Abb. 3b).
Eine neue Generation von Phospholipidanaloga
mit Antitumorwirkung
stellen die Alkylphosphatester, auch
Alkylphospholipide genannt, dar
(Abb. 3c), die sich gegenüber den
Etherphospholipiden durch eine verbesserte
chemische und metabolische
Stabilität auszeichnen [4]. Ein
weiteres bedeutendes Forschungsgebiet
betrifft die Anwendung von Phospholipiden
als Transfektionsvektoren
für die Gentherapie [5].
Phospholipasen zur
Biotransformation von
Phospholipiden
Entsprechend den vielfältigen Einsatzbereichen
von Phospholipiden besteht
ein großes Interesse an verschiedenen
Varianten der natürlichen
Phospholipide. Dazu gehören partielle
Abbauprodukte der natürlichen
Phospholipide wie die Lysophospholipide,
Diacylglycerole oder Phosphatidsäuren,
die durch PLA 2 , PLC bzw.
PLD erzeugt werden können. Die Verwendung
dieser Enzyme zur Gewinnung
der genannten Produkt erlaubt
im Vergleich zur chemisch durchgeführten
Hydrolyse eine hohe Regiound
Stereoisomerenreinheit. Außerdem
ist eine Prozessführung unter
milden umweltfreundlichen Bedingungen
möglich, die weitere unerwünschte
Nebenreaktionen gering
hält.
Eine Sonderstellung unter den hydrolytisch
wirksamen Phospholipasen
nimmt die PLD ein. Neben ihrer
Fähigkeit, die Spaltung der Esterbindung
zwischen dem Phosphatrest und
dem polaren Alkohol zu katalysieren,
ist sie in der Lage, die Umesterung an
dieser Bindung zu katalysieren, wenn
ein geeigneter Alkohol angeboten
wird (Abb. 4). In der Labor- sowie
industriellen Praxis wird sie schon
seit längerer Zeit zur Synthese von
Phospholipiden mit modifizierten
polaren Kopfgruppen benutzt. Man
geht dann meist von Phosphatidylcholin
aus und tauscht das Cholin als
Kopfgruppenkomponente gegen die
in der Natur seltener auftretenden
Reste Serin, Glycerol o. a. aus, wodurch
die aufwändige Isolierung der
natürlich vorkommenden Produkte
umgangen wird. Vor allem aber interessiert
man sich auch für die Einführung
unnatürlicher Kopfgruppen,
die den resultierenden Phospholipiden
neue Eigenschaften verleihen.
Aliphatische primäre und sekundäre
Alkohole, cyclische nichtaromatische
und aromatische Alkohole, Nucleoside,
Saccharide und eine Vielzahl weiterer
hydroxylgruppenhaltiger Verbindungen
gehören zu den auf diese
Weise in Phospholipidstrukturen eingeführten
Komponenten (Zitate in
[6]).
Die molekularen Eigenschaften der
einzelnen Phospholipasen und damit
auch ihre spezifischen Eigenschaften
als Biokatalysatoren hängen – wie
dies allgemein bei Enzymen der Fall
ist – stark von dem Organismus ab,
aus dem sie gewonnen werden. Die
gebräuchlichsten Quellen für die einzelnen,
in der Biokatalyse angewandten
Phospholipasen sind in Tabelle 1
zusammengestellt. Man erkennt aus
dem relativ begrenzten Organismenspektrum,
das zur Gewinnung der
einzelnen Phospholipasen herangezogen
wurde, dass hier noch ein weites
Feld brach liegt. Oftmals wird die Isolierung
der Enzyme in ausreichenden
Mengen zum limitierenden Faktor für
ihre Anwendung. Gravierende Fortschritte
sind hier durch die Nutzung
rekombinanter Produktionsstrategien
zu erwarten. In der eigenen Arbeitsgruppe
gelang im Rahmen des Verbunds
“Biokatalyse” die Ausarbeitung
eines Verfahrens zur Gewinnung einer
rekombinanten PLA 2 , das zur Umsetzung
in den Industriemaßstab geeignet
sein sollte.
Phospholipase D – ein
prominenter Biokatalysator
mit vielen Unbekannten
Obwohl PLD-haltige Pflanzenextrakte
von Chemikern schon seit etwa 50
Jahren zur Modifizierung der Kopfgruppe
in Phospholipiden genutzt
werden und das Enzym mittlerweile
auch Einzug in die industrielle Phospholipidsynthese
gehalten hat, ist
über die Struktur der PLD und ihre
molekularen Eigenschaften bis vor
kurzem kaum etwas bekannt gewesen.
Diese Situation hat sich seit wenigen
Jahren geändert. Heute findet
man mehr als 500 Eintragungen zur
PLD in der NCBI GenBank, die von
der weiten Verbreitung des Enzyms
und der großen Strukturvielfalt zeu

gen. Trotzdem sind nach wie vor nur
wenige PLDs in isolierter reiner Form
gewonnen worden, und es existiert
bisher nur eine Raumstruktur, die der
PLD aus Streptomyces sp. strain PMF
[8].
In der eigenen Abteilung gelang die
Entwicklung einer Reinigungsmethode,
die auf einer durch Calciumionenvermittelten
hydrophoben Chromatographie
[9] beruht und sich als äußerst
effektiv für die Reinigung pflanzlicher
PLDs herausstellte. Obwohl
sich in jüngster Zeit nur einige ausgewählte
PLD-Typen in der industriellen
Praxis behauptet haben, scheint
das natürliche Reservoir bei weitem
nicht ausgeschöpft. Insbesondere
pflanzliche Materialien überraschen
immer wieder mit neuen Befunden.
So sind auf der Genebene allein in
Arabidopsis thaliana 12 verschiedene
PLD-Isoenzyme identifiziert worden,
die sich in 4 verschiedene Unterklassen
einordnen lassen. Da sich
aus den Gensequenzen bisher keinerlei
Informationen über das Transphosphatidylierungspotential
der Enzyme
ableiten lassen, ist jedoch über
ihre biotechnologische Nutzbarkeit
bisher schwer zu befinden. Zwei sehr
ungewöhnliche PLD-Typen wurden
kürzlich in Mohnkeimlingen [10]
entdeckt. Während eines der Enzyme
eine sehr große Transphosphatidylierungspotenz
besitzt, wirkt das andere
ausschließlich hydrolytisch. Beide
Enzyme sind im Gegensatz zu den bisher
bekannten pflanzlichen PLDs glykosyliert
und durch Zinkionen aktivierbar.
In der Hallenser Arbeitsgruppe gelang
vor kurzem auch die Identifizierung,
Klonierung und rekombinante
Expression von zwei homologen PLD-
Isoenzymen (PLD1 und PLD2) aus
Weißkohl, der traditionellen PLD-
Quelle [11]. Wie nahezu alle bisher
bekannten PLDs gehören PLD1 und
PLD2 der PLD-Superfamilie an, deren
Vertreter durch zwei konservierte katalytische
Motive mit der Sequenz
HXKX 4 DX 6 G(G/S) charakterisiert sind.
Mit allen pflanzlichen PLDs teilen
PLD1 und PLD2 das Vorkommen einer
C2-Domäne (bestehend aus 130
Aminosäuren), die für die Ca 2+ -vermittelte
Phospholipidbindung an die
Proteinstruktur verantwortlich ist.
Mittels massenspektrometrischer
Analysen konnte die aus der Pflanze
isolierte Form der PLD als N-terminal
acetylierte PLD2 identifiziert werden
[12]. Erste Informationen zur
Tertiärstruktur des Enzyms wurden
mittels limitierter Proteolyse und gerichteter
Mutagenese erhalten [13].
Abb. 4: Transphosphatidylierung durch PLD.
Sie sprechen für eine sehr flexible
Struktur des Enzyms, insbesondere
im N-terminalen Bereich des ersten
katalytischen Motivs.
Besonders wichtige Aspekte für die
Auswahl einer PLD zur Transphosphatidylierung
sind einerseits die Spezifität
hinsichtlich des Substrats und des
Akzeptoralkohols, andererseits die
erreichbaren Ausbeuten an Transphosphatidylierungsprodukt
in der
Konkurrenz mit der hydrolytischen
Reaktion (Abb. 4). Aufgrund der hohen
Transphosphatidylierungspotenz
der PLD ausgewählter Streptomyces-
Stämme sind pflanzliche PLDs in der
biotechnologischen Anwendung in
den letzten Jahren etwas in den Hintergrund
getreten. Unsere Erfahrungen
zeigen jedoch, dass pflanzliche
PLDs eine größere Variabilität in der
Substratstruktur zulassen. So versagt
die bewährte PLD aus Streptomyces
sp. (Sigma) in der Gewinnung von Alkylphosphatestern,
wie dem therapeutisch
interessanten Octadecylphospho-L-Serin,
während hier die
PLD aus Weißkohl akzeptable Umsätze
liefert [14].
Neben den Enzym-inhärenten Eigenschaften
spielt für den Erfolg der
Transphosphatidylierungsreaktion
die Strukturierung der Substratmoleküle,
die durch das Reaktionsmedium
beeinflußt ist, eine entscheidende
Rolle. Obwohl im Allgemeinen Reaktionssysteme,
die aus einem unpolaren
organischen Lösungsmittel und
einer wässrigen Phase bestehen, als
vorteilhaft angesehen werden, zeigten
Versuche mit immobilisierter PLD,
dass Transphosphatidylierungreaktionen
auch in rein wässrigen Reaktionsmedien
durchgeführt werden kön-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
53
nen, was besonders unter dem Aspekt
der Biokompabilität und Umweltfreundlichkeit
von Bedeutung ist
[15].
Ausblick
Wie exemplarisch für PLD ausgeführt,
ist das Anwendungspotential von
Phospholipasen für die Gewinnung
neuer Phospholipide und Phospholipidanaloga
bei weitem noch nicht erschöpft.
Der gegenwärtig stattfindende
rasante Fortschritt in der Genomaufklärung
mikrobieller, pflanzlicher
und tierischer Organismen liefert
neue Impulse für die Auffindung neuer
Phospholipasen. Vor allem aber
wird die Grundlage gelegt für kombinatorische
gentechnische Methoden
zur Konstruktion von Phospholipasen
mit Eigenschaften, die für die gewünschte
Reaktion maßgeschneidert
sind.
Literatur
[1] Divecha, N., Irvine, R. F., Cell 80
(1995), 269-278.
[2] Namba, Y, in: Phospholipids Handbook
(Cevc, G, Hrsg.), Marcel Dekker,
New York, (1993), 879-894.
[3] Zeisig, R., Arndt, D., Brachwitz, H.,
Pharmazie 45 (1990), 809-817.
[4] Hilgard, P., Klenner, T., Stekar, J.,
Unger, C., Cancer Chemother. Pharmacol.
32 (1993), 90-95.
[5] Yanagihara, I., Kaneda, Y., Inui, K.,
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Lipid Modification (Bornscheuer, U.T.,
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(2000), 655-667.
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Biophys. Acta 1631 (2003), 153-159.
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Sci. Technol. 104 (2002), 79-87.
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J. Protein Chem. 21 (2002), 407-411.
[13] Younus, H., Schöps, R., Lerchner, A.,
Rücknagel, K.-P., Schierhorn, A.,
Saleemuddin, M, Ulbrich-Hofmann,
R., J. Protein Chem. (2003), im Druck.
[14] Aurich, I., Dürrschmidt, P., Schierhorn,
A., Ulbrich-Hofmann, R., Biotechnol.
Lett. 24 (2002), 585-590.
[15] Dittrich, N., Ulbrich-Hofmann, R.,
Biotechnol. Appl. Biochem. 34 (2001),
189-194.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann
Martin-Luther-Universität Halle-
Wittenberg
Fachbereich Biochemie/
Biotechnologie
Kurt-Mothes-Str. 3
D-06120 Halle
Tel.: 0345-552 48 64
Fax: 0345-552 73 03 oder 552 70 13
eMail: ulbrich-hofmann@biochemtech.
uni-halle.de
Web: www.biochemtech.uni-halle.de/
biotech

54 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
AMIDASEN
Extremophile Amidasen für die
enantioselektive Synthese von
Amino- und Carbonsäuren
� Dipl.-Biol. Ksenia Egorova 1 , Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian 1 , Dr. Stefan Buchholz 2 , Dr. Stefan Verseck 2 , Dr. Harald Trauthwein 2 , Dr. Shukrallah
Na’amnieh 3 , 1 Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg, 2 DEGUSSA AG, 3 X-Zyme GmbH
Ziel des von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) geförderten Projekts „Extremophile Amidasen“ ist es, Amidasen aus extremophilen Mikroorganismen
für die enantioselektive Synthese von Amino- und Carbonsäuren nutzbar zu machen. Im Rahmen eines umfangreichen Screenings wurden
neue Amidase-produzierende Mikroorganismen identifiziert. Die korrespondierenden Enzyme wurden aufgereinigt und charakterisiert. Im Verlauf des
Projekts sollen ausgewählte Amidasen rekombinant in E. coli exprimiert und mit Hilfe optimierter Fermentationsverfahren für industrielle Anwendungstests
produziert werden.
Keywords: Amidasen, Psychrophile, Thermophile, Amino- und Carbonsäuren
Extremophile
Mikroorganismen als
Quelle neuartiger
Biokatalysatoren
Biokatalysatoren - Enzyme bzw. Mikroorganismen
- spielen eine Schlüsselrolle
bei der Herstellung wertvoller
Verbindungen für die chemische
und pharmazeutische Industrie. Mit
Hilfe von Enzymen können chemo-,
stereo- und regioselektive Transformationen
durchgeführt werden, wohingegen
chemische Syntheseverfahren
zu Racematen führen, die aufwändig
getrennt werden müssen. Obwohl
die Natur über eine Vielzahl stereoselektiver
Biokatalysatoren verfügt, werden
bislang nur wenige Enzyme in der
synthetischen Chemie eingesetzt.
Insgesamt ist der Einsatz von Enzymen
aus extremophiler Mikroorganismen
in der Fein- und Spezialchemie
zurzeit kaum ausgeprägt. Eine hohe
Toleranz gegenüber organischen Lösemitteln,
Detergenzien oder Salzen
sind für viele Enzyme aus mesophilen
Mikro-organismen oftmals nicht gegeben.
Auch die Toleranz gegenüber
hohen Substratkonzentrationen ist direkt
proportional zur Raum-Zeit-Ausbeute
und oftmals ein Knock-out-Kriterium
für die Realisierung biokatalytischer
Verfahren. Aber auch niedrige
Temperaturen sind bei einigen Prozessen
zur Stabilisierung des Substrats
oder zur Erhöhung der Selektivität
wünschenswert, wobei aber die Aktivität
des Biokatalysators trotzdem
möglichst hoch sein sollte. Hier könn-
ten Enzyme aus psychrophilen bzw.
psychrotoleranten Mikroorganismen
eine wichtige Rolle spielen. Für all
diese Problemstellungen bieten Enzyme
aus den entsprechenden extremen
Habitaten einen viel versprechenden
Lösungsansatz. Dies trifft insbesondere
für das Gebiet der Amid-hydrolysierenden
Enzyme zu.
Ziele des Projekts
Ziel des vorliegenden Vorhabens ist die
umweltfreundliche Gewinnung von
Amino- und Carbonsäuren aus Amiden
durch den Einsatz von neuentdeckten
Amidasen aus extremophilen Mikroorganismen.
Im Rahmen des Projekts
sollen die neuentdeckten Amidasen
zunächst weitergehend charakterisiert
und durch den Industriepartner
DEGUSSA AG auf ihre industrielle Relevanz
untersucht werden. Anschließend
erfolgt die Klonierung und Expression
priorisierter industrieller Amidasen
im industriellen Produktionsstamm
E. coli. Die Herstellung rekombinanter
Enzyme erfolgt unter optimierten
Fermentationsbedingungen im 300-
Liter Maßstab, um ausreichende Mengen
für anwendungstechnische Versuche
zur Verfügung stellen zu können.
Industrielle Bedeutung von
Amidasen
Amidasen (EC 3.5.1.4) katalysieren
die stereospezifische Hydrolyse von
Amiden zu freien Carbonsäuren und
Ammonium, sodass zu nahezu 100
Abb. 1. Detektion von Amidasen mittels PAGE. Das Gel wurde mit Hydroxylamin
und Eisen(III)chlorid behandelt. 1 – Aufgereinigte Amidase, 2 –
Zymogram des Enzyms.
Prozent die gewünschte chirale Amino-
bzw. Carbonsäure hergestellt wird.
In letzter Zeit wurde eine Reihe von
interessanten mikrobiellen Amidasen
detektiert [1]. Industriell eingesetzt
werden aber nur die Amidasen aus
den mesophilen Bakterien Pseudomonas
putida, Klebsiella sp., Ochrobactrum
antropi SV3 und Mycobacterium
neoaurum. Die übrigen
Amidasen weisen deutlich geringere
spezifische Aktivitäten auf und haben
aufgrund zu geringer Stabilität oder zu
hoher pH-Optima noch keinen Einzug
in industrielle Produktionsverfahren
gehalten. Der Einsatz thermoaktiver
Amidasen ist in vielen Fällen vorteilhaft,
da größere Umsatzraten erzielt
werden können und die Substrate bei
hohen Temperaturen besser löslich
sind.
Zum Thema Amidasen wurden an der
TUHH zahlreiche Vorarbeiten durchgeführt.
Diese umfassten u.a. die Entwicklung
einer neue Methode zur Detektion
von Amidasen in Polyacrylamid-Gelen
(Abb. 1), das Screening
nach Amidase-produzierenden Mikroorganismen
(Neuisolate und literaturbekannte
Stämme) sowie die Reinigung
und partielle Charakterisierung
von Amidasen aus ausgewählten Stämmen
(Tab. 1).
Amidasen aus
extremophilen
Mikroorganismen
Die in den Neuisolaten nachgewiesenen
Amidasen werden mit Hilfe

chromatographischer Methoden bis
zur Homogenität gereinigt und im
Detail charakterisiert. Zur weiteren
Charakterisierung der Enzyme werden
HPLC-Untersuchungen (Hydrolyseprodukte,
Enantioselektivität) erfolgen.
Als Substrate werden Aminosäuren
und aromatische Carbonsäuren
eingesetzt, mit dem Ziel, regioselektive
Umsetzungen zu identifizieren.
Diese relativ aufwändigen Arbeitsschritte
werden an der TUHH
und bei der DEGUSSA gemeinschaftlich
durchgeführt. Parallel dazu werden
pH- und Temperaturoptima, der
Einfluss verschiedener Metallionen,
Detergenzien und Inhibitoren auf die
ausgewählten Enzyme bestimmt.
Im Bereich der Klonierung und Expression
verfügt die Firma X-Zyme
über ein breites Spektrum von Vektoren
und Expressionsstämmen. Mit
Hilfe dieser Systeme wird es möglich
sein, die im beantragten Vorhaben zu
bearbeitenden Amidasen effizient in
BIOPROZESSENTWICKLUNG
Tab. 1: Aktivitätsoptima und Substratspezifität neudetektierter Amidasen.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
55
Mikroorganismus Wachstumstemp. Expression des Optimale Aktivität Substratdes
Stammes [°C] Wildtyp-Enzyms des Wildtyp-Enzyms spektrum
Pseudonocardia thermophila 50 konstitutiv 70°C, pH 7 Al, Ar, Zy, As
Thermocrispum municipale 50 induzierbar 70°C, pH 6 Al, Zy, As
Paenibacillus sp. 4K 50 induzierbar 70°C, pH 6 Al, Ar, Zy, As
Ralstonia sp. 4K 45 induzierbar 60°C, pH 6 Al
Bacillus sp. 4K 55 induzierbar 70°C, pH 7 Al
Arthrobacter sp. 34-1 20 induzierbar 50°C, pH 7 Al, Ar, Zy, As
Arthrobacter sp. 17-2 20 induzierbar 50°C, pH 7 Al, Ar, Zy, As
Arthrobacter sp. 19-3 15 induzierbar 50°C, pH 7 Al, Zy, As
Al - Aliphatische Amide, Ar - Aromatische Amide, Zy - Zyklische Amide, As – Aminosäureamide.
rekombinanter Form gewinnen zu
können. Die so in ausreichenden
Mengen vorliegenden rekombinanten
Amidasen werden abschließend
für anwendungstechnische Versuche
eingesetzt, mit dem Ziel, enantiomerenreine
Amino- und Carbonsäuren
herzustellen. Ziel der Versuche ist es,
die Leistungsfähigkeit der neuen
Amidasen bilanzierend unter Beweis
zu stellen und Aussagen zur Wirt-
Hochdurchsatz-
schaftlichkeit und Umweltfreundlichkeit
des Verfahrens zu machen.
Literatur
[1] Banerjee, A., Sharma, R., Banerjee,
U.C., Appl Microbiol Biotechnol 60
(2002), 33-44.
Bioprozessentwicklung
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed
Antranikian
TU Hamburg-Harburg
Technische Mikrobiologie
Kasernenstr. 12
21073 Hamburg
Tel.: 040-42878-3117
Fax: 040-42878-2582
eMail: antranikian@tuhh.de
� Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz1 , Dipl.-Biotech. Robert Puskeiler1 , Dr.-Ing. Klaus Kaufmann2 , Dr. Gernot John3 , Dr.-Ing. Matthias Arnold4 ,
1 2 3 Lehrstuhl für Bioverfahrenstechik, Technische Universität München, Garching, H+P Labortechnik AG, Oberschleissheim, Precision Sensing GmbH, Regensburg,
4DASGIP AG, Jülich
Die Fortschritte in der Biotechnologie erlauben es heute, Stoffwechselwege in Mikroorganismen gezielt so zu verändern, dass natürliche und nichtnatürliche
Produkte mit hohen Ausbeuten und Selektivitäten hergestellt werden könnten. Ein zentrales Problem ist gegenwärtig jedoch die zügige Umsetzung
dieser Potenziale in industrielle Produktionsverfahren. Hierzu werden oftmals bis zu 10 Jahre und mehr benötigt. Zielsetzung dieses Verbundvorhabens
ist daher die Bereitstellung der technologischen Grundlagen zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung: Hierzu wird ein Modul mit 48 Rührkesselreaktoren
im 5-10 ml-Maßstab entwickelt, mit paralleler nicht-invasiver Optosensorik zur online pH- und pO 2 -Messung ausgestattet und mit einem Labor-Roboter
automatisiert, um sowohl Stamm-, als auch Prozessentwicklung zeiteffektiv unter kontrollierten Reaktorbedingungen durchführen zu können.
Keywords: Parallele Rührkesselreaktoren, Miniaturisierung, Optosensorik, Automatisierung, Stammentwicklung, Bioprozessentwicklung.
Einleitung
Biotechnologische Verfahren konnten
bisher immer dann industriell etabliert
werden, wenn die marktfähigen
Produkte nicht oder nur mit größerem
Aufwand chemisch synthetisiert
werden können. Diese biotechnologischen
Verfahren zeichnen sich im
Vergleich zu chemischen Synthesen in
der Regel durch einen geringeren Energieverbrauch
aus, sind zielgerichteter
(weitgehende Vermeidung von
Neben- und Abfallprodukten) und res-
sourcenschonender, wenn nachwachsende
Rohstoffe eingesetzt werden.
Die Fortschritte in der biotechnologischen
Grundlagenforschung und
-anwendung, insbesondere der Genomforschung
und Molekularbiologie,
erlauben es, neben der (heterologen)
Überexpression von Proteinen
Stoffwechselwege gezielt so zu verändern,
dass natürliche (aber auch
nichtnatürliche) Produkte wie beispielsweise
Aminosäuren, Vitamine,
Nucleotide oder ‚chiral building
blocks’ zunehmend in wirtschaftlich
konkurrenzfähigen Ausbeuten hergestellt
werden könnten.
Das Kernproblem ist gegenwärtig
jedoch die zügige Umsetzung in technisch
realisierbare und wirtschaftliche
Verfahren. So vergehen heute oftmals
bis zu 10 Jahre bis zur industriellen
Realisierung eines biotechnologischen
Verfahrens. Eine Ursache für die langen
Entwicklungszeiträume ist die ungenügende
Integration der Arbeitsschritte
–Biokatalysatorentwicklung und
Screening,
– Bioprozessentwicklung im Labormaßstab
und
– Überführung in den Produktionsmaßstab.
Die bisherige sequentielle Vorgehensweise
mit qualitativ und quantitativ
sehr unterschiedlichen Techniken
führt teilweise zu der paradoxen
Situation, dass versucht wird, einen
„Schüttelkolben“ im m 3 -Maßstab zu
realisieren, was nur in seltenen Fällen
wirtschaftlich erfolgreich ist. Beispielsweise
produziert die amerikanische
Firma Amgen den Block-bu-

56 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
ster Erythropoetein (EPO) in ‚roller
bottles’, die in Hunderten von Einheiten
nebeneinander betrieben werden.
Auch die enormen quantitativen
Unterschiede beispielsweise bei der
Wirkstoffsuche im Hochdurchsatz-
Verfahren und der heutigen Bioprozessentwicklung
im sequentiell betriebenen
Labor-Bioreaktor lassen
eine zügige Umsetzung in neue Produktionsprozesse
bisher nicht zu.
Die heutige sequentielle Vorgehensweise
führt sogar dazu, dass viele
potentielle biotechnologische Produktionsverfahren
bereits in einer
sehr frühen Entwicklungsphase nicht
weiter verfolgt werden, wenn mit den
bestehenden Paralleltechniken das
Potential vieler Biokatalysatoren
prinzipiell nicht erkannt werden
kann oder aufgrund des enormen
Zeit- und Personalaufwands bei der
sequentiellen Vorgehensweise nur
wenige Biokatalysatoren intensiver
untersucht werden können.
Parallelreaktoren
Der klassische Parallelreaktor in der
Biotechnologie ist der Schüttelkolben,
mit dem seit dem letzten Jahrhundert
einfache Satzversuche im
Parallelansatz manuell durchgeführt
werden [1]. Wesentliche reaktionstechnische
Unterschiede zwischen
dem Reaktionsgefäß Schüttelkolben
und dem Reaktionsgefäß Rührkesselreaktor
- dem klassischen Produktionsreaktor
der Biotechnologie
- sind der geringere Sauerstoffeintrag,
das weitaus geringere Verhältnis
der maximalen lokalen Energiedissipation
zum mittleren Leistungseintrag
und die fehlende Kontrolle
wichtiger Prozessgrößen (wie beispielsweise
pH oder pO 2 ) beim
Schüttelkolben. Dies führt dazu,
dass Reaktionsverläufe in den meisten
Fällen nicht direkt vom Reaktionssystem
Schüttelkolben in das Reaktionssystem
Rührkesselreaktor
übertragen werden können und damit
in der Bioprozessentwicklung
zusätzliche personal- und zeitintensive
sequentielle Experimente in Laborbioreaktoren
erforderlich sind.
Technische Ansätze dieses Problem
zu lösen, sind die Bereitstellung
von parallelen Rührkesseleinheiten
oder parallelen Kleinreaktoren
in einem Inkubator mit intermittierender
Dosierung und paralleler
pH-Kontrolle [2]. Die Anzahl paralleler
Bioreaktoren ist jedoch beschränkt
(max. 16). Eine weitere
Parallelisierung ist auf Basis dieser
Abb. 1: Prinzipschema der apparativen Komponenten zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung.
Technologieplattform praktisch
nicht möglich.
Eine weitere einfache Möglichkeit,
noch weitaus mehr Reaktoren
parallel zu betreiben, ist die Verwendung
von Mikrotiterplatten zur Satz-
Kultivierung von Mikroorganismen.
Mikrotiterplatten weisen jedoch in
noch stärkerem Maße dieselben reaktionstechnischen
Restriktionen
wie Schüttelkolben auf [3].
Eine parallele online Messung von
pH und pO 2 ist mit den etablierten
Messtechniken (pH- und pO 2 -Elektroden)
bei hoher Parallelisierung
und geringen Reaktionsvolumina
nicht möglich. Eine Möglichkeit zur
Überwindung dieser Problematik
könnten Mikrosensoren darstellen,
wenn diese kostengünstig in jedes
der parallelen Reaktionsgefäße integriert
werden können. Erste Ansätze
hierzu sind vor kurzem in Mikrotiterplatten
zur Messung von pH
oder pO 2 realisiert worden [4].
Die parallele Regelung von Prozessgrößen
wie pH für 48 oder mehr
Parallelreaktoren ist prinzipiell
nicht durch Parallelisierung von
konventionellen Eingrößenreglern
zu realisieren, da ein Aktor (Pumpe,
Dosiereinheit) mehrere Parallelreaktoren
intermittierend mit Titrationsmittel
bedienen muss.
Lösungsansatz:
Hochdurchsatz-
Bioprozessentwicklung
Zielsetzung dieses Verbundvorhabens
ist daher die Bereitstellung der
technologischen Grundlagen zur
Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung.
Im Einzelnen sind dies (siehe
Abb. 1):
–Sterilisierbarer Bioreaktorblock
mit 48 parallelen Rührkesselreaktoren
im 5–10 ml-Maßstab (Leistungseintrag
mit ‚schwebendem
Magnetrührer’, Sauerstoffeintrag
nach dem ‚gas-inducing’-Prinzip,
Temperaturkontrolle, sterile Beund
Entgasung, sterile Probenahme).
– Parallele Optosensorik als ‚Sensorblock’
unterhalb des Reaktor-
blocks zur parallelen online Bestimmung
von pH und pO 2 in jedem Reaktionsgefäß
mit kurzer Totzeit und
hoher Abtastrate.
– Parallele rechnergeführte Prozesskontrolle
zur Automatisierung der
Parallelreaktoren mit Hilfe eines Labor-Roboters
als Aktor (8-fach parallele
intermittierende Dosierung
von Korrekturmittel und Substraten,
Probenahmen und at-line Analysen
von Zelldichte und Metabolitkonzentrationen).
Bioreaktorblock
Zentrales Element des Bioreaktorblocks
ist die Antriebseinheit für 48
parallele Rührkesselreaktoren.
Hierzu wurden verschleißfreie VA-
RIOMAG R -Vielfachantriebe in ihrem
Wirkungsgrad mit Hilfe von umfangreichen
Simulationsstudien optimiert,
sodass hohe Grenzdrehzahlen
von bis zu 2500 rpm mit neu entwickelten,
gas-induzierenden Rührorganen
erreicht und zuverlässig
aufrecht erhalten werden können
(siehe Abb. 2). Das von stationären
Magnetspulen zwischen den Reaktionsgefäßen
erzeugte magnetische
Drehfeld wird dabei so angeordnet,
dass die Rührorgane auf einer vorgegebenen
Reaktorhöhe frei schweben
können.
In den Bioreaktorblock wurden
neben dem magnetisch-induktiven
Vielfachantrieb zwei Wärmetauscher
installiert: Der erste zur Temperaturkontrolle
der parallelen Bioreaktoren
und der zweite zur Kühlung
der Reaktorköpfe, um die Verdunstungsverluste
beim Betrieb der Reaktoren
herabzusetzen.
Die sterile Gaszufuhr in die Kopfräume
und die Entgasung der einzelnen
Parallelreaktoren über individuelle
Leitrohre, die gleichzeitig als Sterilbarriere
für die Nadeln eines Pipettier-Roboters
dienen, befindet
sich zur Zeit in Entwicklung.
Abb. 2: Simulation der magnetischen Flussdichte (in Tesla)
eines magnetisch-induktiven Rührantriebs für einen
einzelnen Rührkesselreaktor im Bioreaktorblock: Resultierendes
Drehmoment auf den Rührkörper 0.0031 Nm bei
gleichzeitiger Tragkraft von 0.4 N (der diametral magnetisierte
Dauer-Ringmagnet befindet sich in einem Rührorgan
– Reaktor und Rührorgan sind nicht dargestellt - und
wird durch das induzierte Magnetfeld in Rotation versetzt.
Das Magnetfeld wird über 4 symmetrisch angeordnete
Kupferspulen mit Eisenkernen und –polschuhen induziert.
Die Kupferspulen sind hierbei über ein Eisen-
Rückschlussblech mit einander verbunden. Zur Simulation
wurde die Software COSMOS/DesignSTAR-EMS eingesetzt).

Gas-induzierende
Rührorgane
In Rührreaktoren wird der Sauerstoffeintrag
in das Reaktionsmedien bei Volumenbegasung
primär durch den
Leistungseintrag des Rührorgans und
sekundär durch die Gasleerrohrgeschwindigkeit
bestimmt. Eine Primärdispergierung
der Gasphase, wie sie
im klassischen Rührkesselreaktor
über einen Gasverteiler am Reaktorboden
erfolgt, ist in parallel angeordneten
‚ml-Bioreaktoren’ jedoch nur
sehr aufwändig zu realisieren: Die Reaktionsgefäße
müssten mit einem individuellen
Gasverteiler versehen werden.
Der Gasverteiler müsste sicherstellen,
dass in jedem der parallelen
Reaktionsgefäße exakt die gewünschte
Gasleerrohrgeschwindigkeit erzielt
wird.
Kleine Reaktionsgefäße haben jedoch
im Vergleich zu Labor-Rührkesselreaktoren
ein weitaus höheres
Oberfläche/Volumenverhältnis. Damit
besteht bei Verwendung eines geeigneten
Rührorgans prinzipiell die Möglichkeit,
auf eine Primärdispergierung
der Gasphase durch einen Gasverteiler
zu verzichten, wenn es gelingt, die
Gasphase, die sich über der Flüssigkeitsoberfläche
befindet, direkt im
‚ml-Bioreaktor’ zu dispergieren. Ein
geeignetes Rührorgan muss also zwei
Eigenschaften besitzen: Axiale Förderung
von der Flüssigkeitsoberfläche
zum Boden des Reaktionsgefäßes
(‚Einsaugen’ der Gasphase) und effektive
Dispergierung der Gasphase in
möglichst kleine Gasblasen mit hoher
Stoffaustauschfläche (hohe lokale Energiedissipation).
Hierzu wurde eine Reihe von unterschiedlichen,
frei schwebenden und
magnetisch-induktiv angetriebenen,
Gas induzierenden Rührorganen entwickelt
[5] (Beispiel siehe Abb. 3a,
3b).
Mit Hilfe dieser Rührorgane werden
bei Drehzahlen bis 2200 rpm Stoffübergangskoeffizienten
k L a von 0.15 -
0.2 s -1 möglich (die Messung erfolgte
mit der dynamischen Sulfitmethode).
Damit werden Sauerstoffeintragsleistungen
wie in technischen Rührkesselreaktoren
ermöglicht.
Bei solchen ‚gas-inducing reactors’
ohne Primärdispergierung der
Gasphase über einen Gasverteiler verbleibt
als einzige Steuergröße für den
Sauerstoffeintrag die Rotationsgeschwindigkeit
des Magnetrührorgans,
dass eine Doppelfunktion übernimmt:
Erzeugung des notwendigen Gasdurchsatzes(Gasleerohrgeschwindigkeit)
und Realisierung des erforderli-
a b
Abb. 3: a) Prinzipskizze eines miniaturisierten Rührkesselreaktors im Bioreaktorblock
mit einem Durchmesser von 15,5 mm. b) Prinzipskizze eines
frei schwebenden, Gas induzierenden Magnetrührorgans (Aufsicht und
Schnittbild, 1 Pumpkanäle, 2 Dauermagnete).
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
57
chen Leistungseintrags zur Dispergierung
der Gasphase.
Optosensorik
Die optische Messung von pH- und
Sauerstoffkonzentrationen mit Mikrosensoren
durch transparente Gefäßwände
ist mit ‚Sensor-Mikrotiterplatten’
mithilfe der konventionellen Lumineszenzintensitätsmessung
[4] bereits
heute technisch möglich. Zur
Nutzung der von Störungen der Probe
unabhängigen, zeitaufgelösten Lumineszenzmessung
durch Phasendetektion
[6] für ein paralleles Messsystem
wird zur Zeit eine parallele opto-elektronische
Detektionseinheit entwickelt.
Abb. 4: Modulkonzept der parallelen Optosensorik: Eine Zentraleinheit ist über ein Bus-Interface mit mehreren
Optik-Untersetzern verbunden. Die Zentraleinheit übernimmt dabei Steuerung, Phasendetektion und Stromversorgung.
Abb. 5: Systemarchitektur des online Prozessinformations- und Steuerungssystems:
Die zunächst bearbeiteten Teilsysteme sind durch schwarze
Schrift gekennzeichnet.
Die Hauptaufgabe besteht in einem
Neu-Design der Signalauswertung.
Nach dem modularen Konzept wird
die Phasendetektion von der Optik getrennt
sein (siehe Abb. 4). Zwischen
ihnen sind nur elektrische Verbindungen
notwendig, deren Abschirmung
vom Magnetfeld der Rührer gesichert
sein muss.
Es werden Optik-Untersetzer entwickelt,
die direkt unter dem Reaktionsgefäß
platziert werden. Dabei werden
Temperatureffekte aus der Nähe
zum beheizten Reaktionsraum durch
geeignete Referenzen im optischen
System unterbunden. Besondere Aufmerksamkeit
wird der Auswahl von
kostengünstigen Filtern gewidmet, um
Folienfilter einsetzen zu können.
Parallele Prozesskontrolle
Die bedingt durch die parallele Arbeitsweise
im Vergleich zu konventionellen
Systemen sehr große Anzahl

58 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
von Einzelinformationen erfordert
neue Wege sowohl bei Informationslogistik
als auch in der Benutzerinteraktion
in den Phasen Versuchsplanung,
-durchführung und –auswertung
sowie der Systemintegration:
Die parallele, intermittierende
Kontrolle von 48 oder mehr Parallelbioreaktoren
mit nur 8 parallelen
Aktoren (Dosierstrecken eines Laborroboters)
stellt eine neue Dimension
dar: Die massiv parallelen, konkurrierenden
Aufgaben müssen unter
Berücksichtigung sich individuell
dynamisch verändernder Bioprozesse
ausgeführt werden. Eine solche
‚Scheduling’- Strategie wird zur Zeit
auf der Basis der Theorie für Echtzeitsysteme
erarbeitet.
Die im Aufbau befindliche Systemarchitektur
ist in Abbildung 5 dargestellt.
Kultivierung von
Escherichia coli in
miniaturierten
Rührkesselreaktoren
Escherichia coli wurde in einem definierten
Mineralmedium mit 25 g L -1
Glucose als Kohlenstoffquelle und Vorlage
von Antischaum CLEROL 265 (0,1
mL L -1 ) in miniaturisierten Rührkesselreaktoren
kultiviert.
Das Zulaufmedium enthielt neben
Glukose (400 g L -1 ) noch folgende
Komponenten: MgSO 4 *7H 2 O (20 g L -
1 ), EDTA (13,0 mg L -1 ), CoCl2 *6H 2 O
(4,15 mg L -1 ), MnCl 2 *4H 2 O (24,9 mg
L -1 ), CuCl 2 *2H 2 O (2,5 mg L -1 ), H 3 BO 3
(5,0 mg L -1 ), Na 2 MoO 4 *2H 2 O (4,15
mg L -1 ), Zn(CH 3 COO) 2 *2H 2 O (21,7
mg L -1 ), Fe(III)-zitrat (47,6 mg L -1 ).
Die Satzkultivierung wurde in miniaturisierten
Rührkesselreaktoren
(15,5 mm Innendurchmesser) mit
einem Prototypen-Magnetantrieb sowohl
mit kommerziellen Standard-
Magnetrührer, als auch mit einem neu
entwickelten, Gas induzierenden Magnetrührsystem
durchgeführt. Die
Drehzahl wurde über die gesamte
Kultivierungsdauer von 16 h bei konstant
2200 rpm gehalten. Die Kultivierung
wurde ohne Sauerstoffpartialdruckmessung
und -kontrolle durchgeführt.
Mit Hilfe eines Laborroboters
(siehe Abb. 7) wurden mit einer Frequenz
von 1 h -1 automatisch Proben
entnommen. Die pH Kontrolle erfolgte
durch einen modellgestützten Proportionalregler
mit einem Stelleingriff
pro Stunde (pH-Sollwert 6,8). Als Titrationsmittel
wurde 4 M NaOH mit
Hilfe des Laborroboters zugegeben.
Nach Verbrauch der Ausgangsmenge
Glukose wurde ein linear steigen-
Abb. 6: Erste Parallelkultivierung von E. coli im Bioreaktorblock mit automatisierter at-line pH-Kontrolle, at-line
Biomasseanalytik und intermittierender Substratdosierung: Vergleich verschiedener Magnetrührersysteme (V = 5-
6 mL, n = 2200 rpm, T = 37 °C, pH = 6.3-7.0, c Korr = 4 M NaOH, Mineralsalzmedium, c S0 = 25 g L -1 Glucose, c F = 400
g L -1 Glucose, Dosierfreqenz = 15 h -1 ).
des Dosierprofil mit einem Ausgangsvolumenstrom
von 40 µL h -1 und einer
Steigung von 5 µL h -2 realisiert.
Die Zugabe des Zulaufmediums erfolgte
ebenfalls automatisiert durch
den Laborroboter mit einer Frequenz
von 15 h -1 .
In den vom Laborroboter entnommenen
Proben wurde automatisiert
die optische Dichte OD 650nm mit Hilfe
eines Mikrotiterplatten Photometers
bestimmt (siehe Abb. 7). Der KorrelationskoeffizientOD/Biotrockenmasse
(BTM) wurde gravimetrisch mit je
1 mL Probe nach Ende der Fermentation
bestimmt.
Die pH-Messung erfolgte mit einem
Intervall von 1 h -1 automatisiert in handelsüblichen
Mikrotiterplatten, welche
immobilisierte pH-sensitive Fluoreszenzfarbstoffe
enthalten (Hydroplate
HP96T, Presens, Regensburg).
Die Fluoreszenzfarbstoffe werden per
bottom-bottom Messtechnik ebenfalls
im Mikrotiterplatten Photometer ausgelesen.
Die Kalibrierung erfolgte mit
Phosphatpufferlösungen (150 mM)
bei pH 5, 6, 7, und 8.
Das Ergebnis der Kultivierung zeigt
Abbildung 6. Die Kultivierung mit dem
Abb. 7: Photo eines Pipettierroboters
mit einem
Prototypen des Bioreaktorblocks.
Gas-induzierendem Rührsystem ermöglichte
exponentielles Wachstum
von E. coli im anfänglichen Satzbetrieb
bis zu einer Zelldichte von 6,3 g L -1 .
Der Reaktor mit dem kommerziellen
Standard-Magnetrührer zeigte bereits
im Satzbetrieb geringeres Wachstum
der E. coli Zellen.
Nach Verbrauch der vorgelegten
Glukose in den parallelen Rührkesselreaktoren
wurde bei einer Prozesszeit
von 9 h das linear ansteigende Glucose-Dosierprofil
gestartet. Dabei wurde
im Reaktor mit dem Gas induzierenden
Magnetrührsystem innerhalb
von 7 h eine Zelldichte von über 20 g
L -1 Biotrockenmasse erreicht. Der
Standard-Magnetrührer ermöglichte
lediglich eine maximale Zelldichte von
5 g L -1 BTM.
Ausblick
Möglichkeiten und Grenzen dieser
neuen Technologien zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung
(siehe
Abb. 7) - Bioreaktorblock, parallele
Optosensorik und parallele Prozesskontrolle
- sollen simultan während
ihrer Entwicklung an verschiedenen
Beispielprozessen und biologischen
Beispielsystemen evaluiert werden.
Literatur
[1] Büchs, J., Biochem. Eng. J. 7 (2001),
91-98.
[2] Weuster-Botz, D., Chem. Ing. Tech.
74 (2002), 1762-1766.
[3] John, G.T., Dissertation, Universität
des Saarlandes (2001).
[4] Duetz, W.A., Ruedi, L., Hermann, R.,
O’Connor, K., Büchs, J., Witholt, B.,
Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000),
2641-2646.
[5] Puskeiler R., Zacher K.-H., Weuster-
Botz, D., Deutsche Patentanmeldung
DE 10260691.9 (2002).
[6] Klimant, I., Deutsche Patentanmeldung
DE 10101576.3 (2001).
Korrespondenz
Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechik,
Technische Universität München
Tel.: 089-289 157 12
Fax: 089-289 157 14
eMail: d.weuster-botz@lrz.tum.de
web: www.mw.tum.de/biovt/

MIKROTITERPLATTEN-REAKTOREN
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
59
Mikrotiterplatten-Reaktoren mit
integrierten pH-Sensoren und
Autodisplay in E. coli zur
evolutiven Enzymentwicklung
� Prof. Dr. Elmar Heinzle1 , staatl. gepr. LMChem. Svenja Weiß1 , Prof. Dr. Otto Wolfbeis2 , Dipl. Chem. Sarina Arain2 , Prof. Dr. Ingo Klimant3 , Dr. Gernot
John4 , Dr. Christian Krause4 , Dr. Thomas Räbiger5 , Günther Müller6 , Dr. Harald Waltenberger6 , Dr. Joachim Jose7 , Dipl.-Biol. Eva Schultheiss7 1 2 Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken, Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universität Regensburg
3 4 5 Institut für Analytische Chemie, Mikro- und Radiochemie, TU Graz, Presens GmbH, Regensburg, BMG Labtechnologies GmbH, Offenburg
6 7 MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken
Ein limitierender Schritt zur Ausschöpfung des enormen biokatalytischen Potenzials ist das quantitative Screening von Biokatalysatoren. In diesem Projekt
wurden parallel neue Methoden zum Autodisplay von Enzymen in E.coli und zum quantitativen Screening Säure-umsetzender Enzyme in Mikrotiterplatten
erarbeitet. Es wurden 96-Well-Mikrotiterplatten mit integrierten optischen Sensoren entwickelt, die über einen pH-unempfindlichen Referenzfarbstoff
verfügen, weitgehend kalibrierfrei sind, auch in Flüssigkeiten mit Eigenfluoreszenz einsetzbar sind und mit denen in konventionellen Readern gemessen
werden kann. Dazu mussten jeweils geeignete Beschichtungstechniken für Platten mit Rund- und Flachboden entwickelt werden. Mit diesen
Mikrotiterplatten-Reaktoren wurden zunächst Mischungsstudien durchgeführt, wobei festgestellt wurde, dass je nach den eingestellten Parametern
Mischzeiten von unterhalb einer Sekunde bis mehrere Minuten resultieren. Geeignete Bilanzierungsmethoden wurden entwickelt und implementiert. Damit
konnten bei geeigneter Pufferung die kinetischen Parameter von Esterasen bestimmt werden. Unter Einsatz eines Autodisplay-Systems in E. coli
wurde eine neue Esterase entwickelt, welche derzeit evolutiv verbessert wird.
Keywords: 96-Well-Mikrotiterplatten-Reaktoren, pH-Optosensor, Mischen, Autodisplay, evolutive Enzymentwicklung, Esterase.
Einleitung
In der pharmazeutischen und chemischen
Industrie ist das Screening nach
neuen und verbesserten Biokatalysatoren
von großer Bedeutung. Die Miniaturisierung
und Vereinfachung der
Screeningtests ist aus ökologischer
und ökonomischer Sicht sehr wichtig.
Durch solche Test sollten für neue
biokatalytische Prozesse möglichst
schon in sehr frühen Entwicklungsphasen
relevante, quantitative kinetische
Daten ermittelt werden [1]. Dadurch
können frühzeitig Potenziale
aber auch Limitierungen erkannt werden,
womit Möglichkeiten eröffnet
werden, die Fehler frühzeitig zu beheben
oder eine andere, mehr Erfolg
versprechende Richtung einzuschlagen.
Das Screening sollte möglichst
schon mit den industriell relevanten
Substraten, die oft keine Chromophore
besitzen, durchgeführt werden. Die
grundlegende Idee der hier beschriebenen
Arbeiten ist der Einsatz von
breit einsetzbaren Mikrotiterplatten-
Reaktoren, die in einer Vielzahl von
Reaktionen eingesetzt werden kön-
nen. Einer der Parameter, die sich
während Reaktionen am häufigsten
ändern, ist der pH-Wert. Durch Messung
des pH-Werts in Mikrotiterplatten
sollen Umsetzungen von Säuren
und Basen und damit die Fortschritte
entsprechender Reaktionen quantitativ
verfolgt werden.
Mikrotiterplatten mit
integrierten, optischen
pH-Sensoren
Eine schnelle und einfache Methode
zur Bestimmung der Aktivität neuer
Enzymvarianten ist das Screenen mit
Hilfe optischer Sensoren. Um die
Nachteile eines gelösten Indikators
wie Pipettierfehler, Kontamination der
Probe, Inhibitor- oder Akzeleratorwirkung
der Farbstoffe zu vermeiden,
wurden Sensorfilme in die Böden von
96er Rundboden-Mikrotiterplatten
integriert. Der Sensor enthält neben
dem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff
einen inerten Referenzfarbstoff.
Durch diese interne Referenzierung
werden Einflüsse auf das Signal wie
Schwankungen der Intensität der
Lichtquelle oder der Empfindlichkeit
des Detektors sowie ungleichmäßige
Dicke der Sensorspots minimiert, was
zu einer besseren Reproduzierbarkeit
Abb. 1: Prinzipielle Funktion des
pH-Fluoreszenzsensors. Sensorschicht
mit Indikator- und Referenz-Fluoreszenz-Farbstoff
ist am
Boden von jedem Well aufgebracht.
der Messwerte führt. Beide Farbstoffe
sind in ein protonenpermeables Polymer
eingebettet, welches in
90%igem Ethanol gelöst ist. Definierte
Volumina dieses Sensorcocktails
werden in die Wells der Mikrotiterplatte
pipettiert. Nach dem Verdunsten
des Lösungsmittels bleibt ein dünner
Sensorfilm am Boden zurück. Das
Auslesen der Fluoreszenzsignale im
Mikrotiterplatten-Reader erfolgt von
unten (Abbildung 1).
Es wurden zwei pH-Sensoren entwickelt.
Der Sensor HP96T enthält als
pH-Indikator Carboxyfluorescein (Anregung
bei 485 nm, Emission bei
538 nm) und als Referenzfarbstoff
Sulforhodamin (Anregung: 540 nm,
Emission: 590 nm). Beide Farbstoffe
sind kovalent an das lineare Hydrogel
Poly-HEMA (Polyhydroxyethylmetacrylat)
gebunden, um einerseits ein
Auswaschen der Farbstoffe durch die
Probe zu verhindern und andererseits
ein definiertes Verhältnis zwischen
Indikator und Referenz zu gewährleisten.
Der Indikator des zweiten pH-
Sensors HP96L ist ebenfalls Carboxyfluorescein,
der Referenzfarbstoff ein

60 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Rutheniumkomplex (Anregung:
485 nm, Emission: 620 nm). Da die
Fluoreszenz des Referenzfarbstoffs
durch Sauerstoff gelöscht wird, wurde
er in Sauerstoff-impermeable Partikel
eingebettet, während der Indikator
kovalent an diese Partikel gebunden
ist. Die Partikel wurden zusammen
mit Graphit in einem Hydrogel
dispergiert. Graphit dient als optische
Isolierung und schirmt den
Sensor vor den optischen Eigenschaften
der Probe wie Fluoreszenz oder
Trübung ab.
Speziell die Zusammensetzung der
Sensorcocktails HP96L stellt hohe
Ansprüche an die Beschichtungstechnik.
Die Sensoren werden mit Hilfe
eines neu entwickelten Verfahrens in
Form kleiner runder Spots in Mikrotiterplatten
eingebracht. Das Hauptaugenmerk
bei der Entwicklung der
Beschichtungstechnik lag auf den Eigenschaften
der Sensor-Cocktails, die
sich durch eine hohe Viskosität, eine
schnelle Sedimentation und ihre starke
Adhäsion an Oberflächen auszeichnen.
Als Basisgerät für die Beschichtung
dient ein Tecan Miniprep
60 mit einem gefederten 8-Kanal-
Kamm. Alle Geräteteile, die mit dem
Sensor-Cocktail in Kontakt kommen,
sind mit einer speziellen hydrophoben
Beschichtung versehen. Durch
den Einsatz kleinster Dispenser-Spritzen
können selbst Volumina unter
1 µl, wie sie bei dem Coating des
optisch isolierten Sensors Verwendung
finden, mit einer hohen Genauigkeit
reproduzierbar dispensiert
werden. Das Beschichten der Kavitäten
erfolgt im Kontakt, wobei definierte
Tropfen des Sensor-Cocktails
auf der Oberfläche abgesetzt werden.
Unebenheiten in den Mikrotiterplatten,
die zu einer abweichenden Spotcharakteristik
führen können, werden
durch einzeln gefederte Dispensernadeln
nivelliert. Mit der so etablierten
Beschichtungstechnik können
bis zu 400 Sensorplatten pro Tag
hergestellt werden.
Die Eigenschaften beider pH-Sensoren
sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Beide Sensoren weisen eine
schnelle Ansprechzeit auf, wobei die
des optisch nicht isolierten Sensors
HP96T kleiner ist als die des optisch
isolierten Sensors HP96L. Die Genauigkeit
beider Sensoren liegt unter
0.05 pH-Einheiten, die Auflösung
sogar unter 0.01 pH-Einheiten. Wie
bei allen optischen pH-Sensoren ließ
sich eine gewisse Querempfindlichkeit
gegenüber der Ionenstärke (IS)
nicht vermeiden. Während das Signal
des optisch nicht isolierten Sensors
Tab. 1: Eigenschaften der pH-Sensoren HP96T und HP96L.
HP96T HP96L
Messbereich pH 5-8 pH 5-8
Ansprechzeit (t 90 ) < 10 s < 60 s
Genauigkeit < 0,05 pH < 0,05 pH
Auflösung < 0,01 pH < 0,01 pH
Querempfindlichkeiten Ionenstärke; trübe und Ionenstärke
fluoreszierende Proben
durch trübe und fluoreszierende Proben
beeinflusst wird, zeigt der optisch
isolierte Sensor keinerlei Querempfindlichkeit
gegenüber diesen
Substanzen. Abbildung 2 zeigt die Kalibrationskurven
der beiden Sensoren
mit dem Nährmedium AC Broth
(A 3465, Sigma, Taufkirchen) sowie
mit einigen seiner Bestandteile. Die
Intensitäten des Sensors HP96T sind
bei Verwendung von Fleisch- und
Hefeextrakt sowie des Nährmediums
höher als bei Standardpuffer (Merck,
Darmstadt), wogegen die des optisch
isolierten Sensors HP96L keinen Unterschied
zu der Kalibrationskurve
Abb. 3: Mischverhalten in Mikrotiterplatten. Zugabe von Lauge mit einer
Piezo-Nanoliterpumpe. Schüttelfrequenz: 240 Upm, Reader: FLUOstar
Galaxy (BMG Labtechnologies GmbH, Offenburg). HPTS – 8-Hydroxypyren-1,
3, 6-trisulfonsäure, gelöster pH-Indikator.
des Standardpuffers aufweisen. Bei
trüben oder fluoreszierenden Proben
ist es also vorteilhaft, einen Sensor
mit optischer Isolierung zu verwenden,
da sonst für jede dieser Proben
eine eigene Kalibrationskurve notwendig
ist.
Mischen in
Mikrotiterplatten
Allgemein wird angenommen, dass
das Mischen in Gefäßen mit kleiner
werdenden Volumina immer leichter
wird. Wir konnten mit Hilfe von Farbstoffen
und mit Hilfe der neu entwikkelten
96er Mikrotiterplatten mit integriertem
pH-Sensor das Mischver-
Abb. 2: Kalibrationskurven der Miktrotiterplatten mit (HP96L) und ohne (HP96T) optischer Isolierung bei
Verwendung von AC-Nährlösung und einige ihrer Bestandteile sowie Standardpufferlösung als Vergleich. R –
Intensitätsverhältnis. pH-Indikator: Carboxyfluorescein (Anregung bei 485 nm, Emission bei 538 nm).
Referenzfarbstoff: HP96T - Sulforhodamin (Anregung: 540 nm, Emission: 590 nm), HP96L - Rutheniumkomplex
(Anregung: 485 nm, Emission: 620 nm).
halten bei Zugabe von Lauge studieren
[2]. Dabei stellte sich heraus,
dass das Mischen mit den in vielen
Mikrotiterplatten-Readern eingebauten
Dosier- und Schüttelfunktionen
meist nur Mischzeiten in der Größenordnung
von Minuten erlaubt. Dies
ist für viele kinetische Untersuchungen,
bei denen Substrate oder Laugen
bzw. Säuren zur pH-Regelung
zugegeben werden sollen, nicht akzeptabel.
Das Mischen in 96er Mikrotiterplatten
konnte auch mit mathematischen
Modellen beschrieben
werden (Abbildung 3). Für eine allfällige
pH-Regelung in Mikrotiterplatten
werden geeignete Zugabe- und
Schüttelprozeduren benötigt.
Quantitative Bestimmung
der Enzymkinetik in
Mikrotiterplatten
In den entwickelten Sensor-Mikrotiterplatten
können pH-Änderungen
sehr genau gemessen werden. Damit

ist ein Vergleich der Aktivität verschiedener
Enzyme direkt durch den
einfachen Vergleich der pH-Änderungen
möglich. Quantitative Analysen
von Umsatzkurven sind jedoch nur
durchführbar, wenn Bilanzen aller
die pH-Änderung beeinflussenden
Größen aufgestellt werden. Wir haben
solche Bilanzen für Substrate,
Produkte und für alle anderen pH-
Puffersysteme aufgestellt. Unter Berücksichtigung
der immer zu gewährleistenden
Ladungsneutralität in Ionenbilanzen
und unter Einbeziehung
der Dissoziationskonstanten konnte
so der Zusammenhang zwischen der
beobachteten pH-Änderung und dem
Reaktionsfortschritt quantitativ beschrieben
werden [3]. Damit konnten
sowohl die maximalen Raten als
auch die Michaelis-Menten Konstanten
für eine Penicillin Amidase bestimmt
werden. Diese neu entwickelte
Methode wurde auf verschiedene
Enzyme angewendet, unter anderem
auf die Esterase EsjA, die in diesem
Artikel noch genauer beschrieben
wird. In Abbildung 4 sind die Umsetzungen
von drei Naphthylestern
mit diesem Enzym gezeigt. Die eingesetzten
Säurekomponenten haben
einen sehr großen Einfluss auf die
Kinetik der Esterspaltung. α-Naphthylacetat
wurde deutlich am schnellsten
umgesetzt, während die Aktivität
für α-Naphthylcaproat kaum
messbar war.
Autodisplay
Abb. 4: Hydrolyse von
Naphthylestern durch die
Esterase EsjA in Mikrotiterplatten-Reaktoren
(HP96T, Presens, Regensburg).
2mM a-Naphthylacetat
(a-NA), -butyrat (a-
NB) und -caproat (a-NC),
5mM Phosphatpuffer mit
2.5% DMSO. Die Symbole
kennzeichnen die pH-
Messergebnisse, die Linien
die daraus berechneten
Substratverläufe.
riante in hoher Kopienzahl trägt. Das
hat den Vorteil, mit der selektionierten
Enzymvariante gleichzeitig das
dafür kodierende Gen zu isolieren
und somit Aufschluss über die Struktur
zu erhalten (Abbildung 5). Die
Verwendung eines Ganzzellbiokatalysators
birgt aber noch weitere Vorteile.
So entfällt eine zeit- und kostenaufwändige
Präparation des Enzyms
und es können auch nicht-membranpermeable
Substrate umgesetzt werden.
Bei dem hier verwendeten System
zur Oberflächenexpression,
dem Autodisplay System, bietet sich
darüber hinaus die Möglichkeit, die
neu erzeugte Variante schließlich in
Enzyme sind dank ihrer einzigartigen
Eigenschaften, wie z. B. Selektivität
und Spezifität, von großem Interesse
für einen Einsatz in der pharmazeutischen
Industrie, der Medizin
und im Umweltschutz. Um sie jedoch
technisch nutzen zu können, ist es
erforderlich, sie an die speziellen Reaktionsbedingungen,
wie sie in chemisch-technologischen
Prozessen
auftreten, anzupassen. Für eine solche
Optimierung hat sich die Methode
der gerichteten Evolution bewährt.
Der evolutive Ansatz besteht
darin, dass das Enzym in dem Bereich,
der für die Substratspezifität
verantwortlich ist, zufallsvariiert wird
(Variation) und anschließend aus
der Vielzahl an entstandenen Varianten
diejenigen identifiziert werden,
die ein vorgegebenes Substrat umzusetzen
in der Lage sind (Selektion).
Der innovative Ansatz in diesem Projekt
besteht darin, die Variation einer
Esterase an der Zelloberfläche
von Escherichia coli durchzuführen,
wobei jede Zelle eine definierte Va- Abb. 5: Enzym-Evolution mit dem Autodisplay-System.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
61
reiner Form in den Zellüberstand sekretieren
zu können.
Das Autodisplay System macht sich
den Sekretionsmechanismus der so
genannten Autotransporter-Proteine
[4] für die Oberflächenexpression
von Proteinen zu nutze. Bei der Familie
der Autotransporter-Proteine
handelt es sich um Ein-Komponenten-Transporter,
d. h. diese Proteine
werden von der Zelle als Vorläufermoleküle
synthetisiert, die alle Informationen
zur Sekretion enthalten. Es
sind also keine weiteren Proteine
oder Cofaktoren notwendig. Ein solches
Vorläufermolekül besitzt am Nterminalen
Ende ein Signalpeptid
zum Transport über die innere Membran,
gefolgt von der Passagierdomäne,
an die sich ein Verbindungsstück,
der so genannte Linker, anschließt
und schließlich am C-Terminus die
eigentliche Transportdomäne. Diese
faltet sich als Porin-ähnliche Struktur,
als so genanntes β-Fass, in die
äußere Membran ein und entlässt
dadurch den Passagier an die Oberfläche
(Abbildung 6). Wird anstelle
der kodierenden Region für den natürlichen
Passagier die für ein anderes
Protein eingesetzt, wird dieses
Protein über den gleichen Mechanismus
zur Oberfläche transportiert. Mit
dieser Methode wurden bereits eine
Reihe unterschiedlicher rekombinanter
Proteine an der Oberfläche
von E. coli Zellen exprimiert, u. a.
CTB [5], bovines Adrenodoxin
[6,7]oder Sorbit Dehydrogenase aus
Rhodobacter sphaeroides [8]. Ein
großer Vorteil des Autodisplay Systems
ist, dass die Lebensfähigkeit
der Bakterien nicht negativ beeinflusst
wird, d. h. die Überproduktion
der Passagier-Transportproteine
stört die Integrität der äußeren Membran
nicht. Ein weiterer Vorteil des
Autodisplays ist seine hohe Expressionsrate:
Bis zu 5 % des Gesamtproteingehalts
kann der Anteil rekombinanter
Proteine betragen [5]. Anhand
der Elektronen übertragenden
Aktivität des Adrenodoxins konnte

62 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
auf der Oberfläche eine Zahl von
1,8 x 10 5 Molekülen ermittelt werden
[6]. Darüber hinaus scheint die
Größe des Passagiers kaum einen
Einfluss auf die Expressionstärke zu
haben, was ein Vorteil des Autodisplays
gegenüber dem für ähnliche
Fragestellungen eingesetzten Phage-
Display sein kann.
Entwicklung einer
Esterase
In diesem Projekt wurde die für die
Esterase EstA aus Burkholderia gladioli
kodierende Region über PCR
mit den für das Autodisplay notwendigen
Genregionen verknüpft [9]. Anschließend
wurde die Expression des
dadurch kodierten Fusionsproteins in
der Außenmembran über eine Antikörper-Farbreaktion
nachgewiesen.
Um zu überprüfen, ob das Fusionsprotein
nach außen orientiert ist und
nicht etwa zum Periplasma hin, wurden
ganze Zellen mit Proteinase K behandelt,
anschließend die äußere
Membran präpariert und einer Westernblotanalyse
unterzogen. Proteinase
K ist zu groß, um über die äußere
Membran zu gelangen, d. h. sie
kann nur verdauen, was sich an der
Oberfläche einer Zelle befindet. In
der Tat konnte die Passagierdomäne
in der Außenmembran Proteinase-Kbehandelter
Zellen nicht mehr nachgewiesen
werden. Dies war ein eindeutiger
Hinweis darauf, dass sich
EstA an der Zelloberfläche befindet.
Anschließend konnte die Aktivität von
EstA an der Zelloberfläche mit mehreren
Methoden qualitativ nachgewiesen
werden. Die spezifische Aktivität
von EstA wurde über die Freisetzung
von p-Nitrophenol aus p-Nitrophe-
Tab. 2: Lage einzelner Mutationen in einem Teilbereich von EsjA.
EsjA EAVITAGLGA AAPPALKAAL DALAEGATPD FASRQQAIRK ALLAAAATVS
Klon1 G
Klon2
Klon3 G S T
Klon4 D
Klon5 G G
Klon6 G S T S
Klon7 G S T
nylacetat, die photometrisch bei 405
nm verfolgt wurde, als 1,7 mU/mg
Protein bestimmt.
Um eine Esterase mit höherer Aktivität
einsetzen zu können, wurde als
zweites Enzym die Esterase ApeE aus
Salmonella typhimurium mit Hilfe
des Autodisplay Systems an die Zelloberfläche
gebracht. Es wurde jedoch
nicht das komplette Enzym transportiert,
sondern lediglich die das aktive
Zentrum bestimmenden Domänen.
Unter Zuhilfenahme des multiplen Sequenzalignments
mit anderen Esterasen
auf Aminosäureebene konnten
die für die Aktivität verantwortlichen
konservierten Bereiche von ApeE
identifiziert werden. Nur der Teil von
ApeE mit diesen Aktivitätsdomänen
wurde mit den Autotransporterdomänen
verknüpft. Auf diese Weise entstand
eine neue, am Reißbrett konstruierte
Esterase, die EsjA genannt
wurde. Auch deren Oberflächenständigkeit
wurde über einen Proteinase-
K-Verdau ganzer Zellen nachgewiesen.
Bei den Aktivitätsbestimmungen
zeigte sich, dass EsjA etwa 15mal aktiver
war als EstA. Durch die so erhaltene,
stark gesteigerte Enzymaktivität
war es möglich, die Esteraseaktivität
ganzer Zellen innerhalb weniger
Minuten in pH-sensitiven Mikrotiterplatten
zu messen.
Screening
Abb. 6: Oberflächenexpression mit Hilfe des Autotransporter Sekretionsmechanismus.
Ausgehend von EsjA wurden über Error-prone
PCR zwei Bibliotheken mit
Zufallsvarianten dieser Esterase hergestellt
und mittels Autodisplay an
der Oberfläche von E. coli exprimiert.
Das Prinzip der Error-prone
PCR Reaktion besteht darin, dass die
Fehlerhäufigkeit der Taq-Polymerase
durch suboptimale Reaktionsbedingungen,
wie z. B. unterschiedliche
Konzentrationen der einzelnen Nukleotide,
Zugabe von unnatürlichen
Nukleotiden oder Zumischen von
Mangan, erhöht wird. Dadurch
kommt es zum fehlerhaften Einbau
von Nukleotiden. In diesem Projekt
hat sich ein Verhältnis von dGTP/
dATP von 5 und der Zusatz von 1 mM
Manganchlorid in den Error-prone
PCR-Ansatz bewährt. Die größere der
beiden Bibliotheken enthielt 8,25 x
10 3 Zellen mit einer durchschnittlichen
Mutationsrate von 11 Aminosäureaustauschen
pro Esterasemolekül
(Tabelle 2). Insgesamt wurden
8 Einzelzellklone einer kompletten
Sequenzanalyse im Esterasebereich
unterzogen. Dabei zeigte sich, dass
bestimmte Aminosäuren in mehreren
Klonen mutiert waren. Diese „Hot
Spots“ waren Asparagin an Position
71, das in fünf Klonen jeweils durch
Asparaginsäure ausgetauscht worden
war, Glutaminsäure an Position 175,
die in sechs Klonen durch Glycin ersetzt
wurde und Alanin an der Position
215, an der sich in fünf Klonen
Threonin befand. In jeweils vier Klonen
wurden die Aminosäuren Phenylalanin
an Position 205 bzw. Histidin
an Position 334 durch Serin bzw.
Leucin ersetzt. Von den acht sequenzierten
Klonen hatte keiner die gleiche
Aminosäuresequenz, wobei sich
die Klone 1 bis 5 und Klon 8 am ähnlichsten
sind. Dagegen weisen die
Klone 6 und 7 Mutationen auf, die in
sonst keinem der analysierten Klone
auftreten. Interessant ist auch, dass
im Bereich von Aminosäure 71 bis
175 nur in einem der analysierten
Klone Mutationen stattgefunden hatten.
Die Bibliothek von Esterasevarianten
wird nun unter Einsatz der
pH-sensitiven Mikrotiterplatten einem
Screening auf Hydrolyse von
seitens der Industrie zur Verfügung
gestellten, technisch interessanten
Substraten unterzogen.
Literatur
[1] Tholey, A., Heinzle, E., Adv. Biochem.
Eng. Biotechnol. 74 (2002), 1-19.
[2] Weiß, S., John, G.T., Klimant, I.,
Heinzle, E., Biotechnol. Prog. 18
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Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Elmar Heinzle
Technische Biochemie
Universität des Saarlandes
Gebäude 2
D-66123 Saarbrücken
Tel.: 0681-302 29 05
Fax: 0681-302 29 05
eMail: e.heinzle@mx.uni-saarland.de
Web: www.uni-saarland.de/fak8/
heinzle

DNA-CHIPS
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
63
Entwicklung einer innovativen DNA-
Chip-Technologie zur industriellen
Herstellung rekombinanter Proteine
und zur Identifizierung von
Mikroorganismen
� Dipl.-Biol. Daniel G. Weber2 , Dipl.-Phys. T. Injinaash3 , Dr. Tino Polen1 , Dipl.-Ing. K. Dembowski3 , Dipl.-Biol. Andrea Veit1 , Dipl.-Phys. U.Lehmann4 , Dr. Kerstin
Sahm2 , Dr. Volker F. Wendisch1 , Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian2 , Prof. Dr.-Ing Jörg Müller3 , Prof. Dr. Hermann Sahm1 1 2 3 Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich, Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg, Mikrosystemtechnik,
Technische Universität Hamburg-Harburg, 4SLS Micro-Technology GmbH
Ziel des Projekts ist die Etablierung und Optimierung der DNA-Chip-Technologie. Es wurden E. coli-DNA-Chips für die globale Genexpressionsanalyse
etabliert und validiert. In Anwesenheit des Überflussmetaboliten Acetat zeigten die Chemotaxis- und Flagellengene erhöhte Expression. Die Expression
von Genen, die für die Kohlenstoffquellen-Verwertung wichtig sind, waren verringert. Einige Gene der generellen Stressantwort wiesen eine erhöhte Expression
auf.
Für die Lebensmittelindustrie wird ein Oligonukleotid-Chip zum schnellen Nachweis von mikrobiellen Populationen als Kontaminationskontrolle entwikkelt.
Von entscheidender Bedeutung ist dabei, dass der Oligonukleotid-Chip in der Lage sein wird, lebende Mikroorganismen von abgestorbenen Mikroorganismen
(d. h. nicht teilungsfähigen) zu unterscheiden. Dies ist insbesondere in der bierbrauenden Industrie von Wichtigkeit.
Um ein schnelles und Rohstoffeinsatz verminderndes Druckverfahren für DNA-Chips zu entwickeln, wurde mit Hilfe der in der Mikrosystemtechnik etablierten
Methoden ein multifunktioneller Druckkopf und ein dazugehöriger Basis-Chip mit modifizierter Oberfläche hergestellt.
Keywords: E.coli-DNA-Chips, Genexpressionsanalyse, Oligonukleotid-Chip, Kontaminationskontrolle, Mikrosystemtechnik, Druckkopf, Basis-Chip.
Genomweite
Expressionsanalysen im
Modellorganismus
Escherichia coli
Escherichia coli ist der bakterielle
Modellorganismus und wird zudem in
biotechnologischen Prozessen zur
Produktion von Proteinen oder Aminosäuren,
z. B. Insulin oder L-Phenylalanin,
eingesetzt. Dabei kommt es
häufig zur unerwünschten Bildung von
Essigsäure, die das Wachstum hemmt
und die Produktbildung verringert.
Die aerobe, bei Überschuss von Kohlenstoff-
und Energiequelle stattfindende
Acetatbildung wird als Überflussmetabolismus
bezeichnet. Mithilfe
der DNA-Chip-Technik [1,2,3] kann
man den Expressionsstatus aller Gene
eines Organismus gleichzeitig bestimmen
[1,4]. Diese Technik ist damit geeignet,
die für einen physiologischen
Zustand, wie etwa den Überflussmetabolismus,
wesentlichen Gene mit
veränderter Expression zu identifizie-
ren. Die globalen Expressionsanalysen
gewähren neue Einblicke in globale
Regulationsvorgänge sowie neue Ansätze
zur Optimierung biotechnologischer
Prozesse. Daher wurden in der
Jülicher Arbeitsgruppe als erstes E.
coli-DNA-Chips mithilfe eines DNA-
Chip-Roboters nach dem an der Stanford
University entwickelten Verfahren
[5] hergestellt und validiert (siehe
Abbildung 1) [2,4].
Acetat verursacht globale
Expressionsveränderungen
in E. coli
In E. coli kann Acetat als Kohlenstoffund
Energiequelle für das Wachstum
Abb. 1: Hierarchische Clusteranalyse von Genen mit mindestens 2-fach
veränderter Expression. Bei Vergleich des Wachstums auf den C-Quellen
Glucose oder Glycerin mit dem auf Acetat, Propionat, Lactat oder Fruktose
wurden bekannte Regulationsphänomene zur Validierung der E. coli-
Genom DNA-Chips nachgewiesen.
dienen, während andererseits hohe
Acetatkonzentrationen das Wachstum
dieses Bakteriums hemmen. E. coli ist
aber auch in der Lage, Acetat selbst
zu bilden und zwar sowohl anaerob
in der Gärung als auch bei ausreichender
Sauerstoffversorgung im Überflussmetabolismus.
Zunächst wurden die globalen Expressionsmuster
bei Wachstum auf
Acetat bzw. auf Glucose als einziger
Kohlenstoff- und Energiequelle bestimmt.
Im Vergleich zum Wachstum
auf Glucose wiesen die Gene der Enzyme
zur Acetat-Aktivierung, des Tricarbonsäure-Zyklus
und des Glyoxylat-Wegs
sowie der Schlüsselenzyme
der Gluconeogenese, z. B. der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase,erhöhte
mRNA-Spiegel bei Wachstum
auf Acetat auf.
Für die Bestimmung der globalen
Expressionsmuster in Anwesenheit
von Acetat wurde E. coli auf Komplexmedium
unter pH-neutralen Bedingungen
mit bzw. ohne 20 mM Acetat

64 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
kultiviert. Bei dieser Acetatkonzentration
wird das Wachstum auf Komplexmedium
nur geringfügig gehemmt.
Unter diesen Bedingungen wurden
hauptsächlich drei Gruppen von Genen
mit veränderter Expression identifiziert
[4]. Die Gruppe der Chemotaxis-
und Flagellen-Gene sowie die
Gruppe der Gene der generellen
Stressantwort zeigten erhöhte mRNA-
Spiegel. Demgegenüber waren die
mRNA-Spiegel der Gruppe der Gene
zur Aufnahme und Verwertung anderer
C-Quellen als Glucose verringert.
Es wurde gezeigt, dass die erhöhte
Expression der Chemotaxis- und Flagellen-Gene
phänotypisch zu erhöhter
Mobilität von E. coli in Anwesenheit
von 20 mM Acetat führt [4]. Weiterhin
konnte durch Expressionsanalysen
gezeigt werden, dass die Zugabe
von 20 mM Natriumchlorid oder
von 40 µM Carbonyl-Cyanid-3-Chlorophenylhydrazon
(CCCP), einem
Entkoppler des transmembranen pH-
Gradienten, nicht zu den gleichen
Expressionsveränderungen wie die
Zugabe von Acetat führt. Die Genexpressionsveränderungen
durch Acetat
beruhen also nicht auf einer entkoppelnden
Wirkung oder einer Erhöhung
der Osmolarität des Mediums,
sondern sind für Acetat spezifisch
[4].
Bei den Genexpressionsanalysen
zur Bildung von Acetat im Überflussmetabolismus
wurden Genexpressionsveränderungen
bestimmt,
die bei steigender Acetatbildung auftreten.
Anhand aerober kontinuierlicher
Kulturen von E. coli wurde gezeigt,
dass steigende Acetatbildung
nur in einem sehr engen Bereich mit
steigendem Glucoseangebot korreliert.
DNA-Chip-Analysen dieser Kulturen
ergaben eine verringerte Expression
von Genen des Tricarbonsäure-Zyklus,
des Glyoxylat-Wegs und
der Atmungskette. Daher wird vorgeschlagen,
dass die sich daraus ergebende
verringerte Kapazität zur Oxidation
von Acetyl-CoA im TCA-Zyklus
die Acetatbildung unter diesen Bedingungen
erklärt.
Einsatz eines
Oligonukleotid-Chips zur
Identifikation von
Mikroorganismen in der
bierbrauenden Industrie
Mikrobielle Kontamination ist ein bedeutender
ökonomischer Faktor in
der Lebensmittelproduktion. Das Vorkommen
unerwünschter Mikroorganismen
bedeutet Qualitätsverlust
oder sogar Unbrauchbarkeit des Pro-
Abb. 2: Lage und Aufbau der Intergenic Spacer Region im rrn Operon. Bei
den Sequenzen TCTA und GGT handelt es sich um die 3´- und 5´- Enden
der Intergenic Spacer Regions [7].
dukts und nur nach Nachweis mikrobieller
Unbedenklichkeit für die Gesundheit
des Verbrauchers werden
Lebensmittel für den Vertrieb freigegeben.
Die Tatsache, dass die etablierten
Nachweismethoden zwei bis sieben
Tage Zeit benötigen, führt zu langen
Zwischenlagerzeiten fertiger Lebensmittel.
Auch die Sensitivität ist
bei den angewandten Methoden ein
Problem.
In der bierbrauenden Industrie
kommt es hauptsächlich zu Kontaminationen
der Gattung Lactobacillus.
Seltener lassen sich Arten der
Gattungen Pediococcus, Pectinatus
und Megasphaera nachweisen. Bei
Pectinatus sp. und Megasphaera sp.
handelt es sich um anaerobe Arten,
die bisher nur selten auftraten. Mittlerweile
gewinnen sie aufgrund der
angewandten Technologien allerdings
an Bedeutung. Mikrobielle
Kontaminationen mit den Bakteriengattungen
führen zu einer Trübung
und damit zu einem Qualitätsverlust.
Die Mikroorganismen werden durch
zeitraubende Kultivierung nachgewiesen,
eine Spezifizierung gelingt erst
durch die Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR). In den Brauereien wird zumeist
eine Kombination aus kultivierungsabhängigen
und molekularbiologischen
Methoden eingesetzt, da
eine Anreicherungskultur oft noch
Voraussetzung für eine ausreichende
Detektionssensitivität der PCR ist [6].
Ebenso sind kommerziell erhältliche
Kits zum Nachweis bierkontaminierender
Bakterien auf Voranreicherung
angewiesen. Ein weiterer Grund
für die Kombination beider Methoden
ist, dass die PCR nicht in der Lage
ist zwischen lebenden, d.h. teilungsfähigen,
Mikroorganismen und toten,
d.h. nicht teilungsfähigen, Bakterienzellen
zu unterscheiden. Die Frage
nach der Teilungsfähigkeit ist für die
bierbrauende Industrie allerdings
von besonderem Interesse, da ausschließlich
diese Organismen zu einer
Trübung des Biers und damit zu
einem Qualitätsverlust führen. Es ist
daher für die bierbrauende Industrie
von entscheidender Bedeutung, eine
zeitsparende Nachweismethode einzusetzen,
die es ermöglicht, lebende,
teilungsfähige Organismen von den
Abb. 3: Signalintensitäten des Oligonukleotid-Chip Basissystems. Eine
Säule repräsentiert den Mittelwert der Fluoreszenzsignalintensitäten von
16 benachbarten Spots.
abgestorbenen, nicht teilungsfähigen
Organismen separat zu detektieren
und zu identifizieren.
Intergenic Spacer Regions
(ISR) als Nachweis
lebender Mikroorganismen
Zur Identifikation aktiver, teilungsfähiger
Organismen eignen sich die Intergenic
Spacer Regions (ISR). Dies
sind Sequenzabschnitte zwischen der
16S rDNA und der 23S rDNA bzw. 23S
rDNA und 5S rDNA, die artspezifisch
sind und tRNA-codierende Gene enthalten
können(siehe Abbildung 2).
Während der RNA-Prozessierung
wird bakterielle rRNA durch Spaltung
aus einem gemeinsamen Vorläufer
(prä-rRNA) freigesetzt. Die relevanten
rrn-Gene der prä-rRNA liegen in der
Anordnung 16S-23S-5S vor. Das Operon
wird in einer einzigen prä-rRNA
transkribiert, aus der die reifen rRNA-
Moleküle (16S, 23S, 5S), ebenso wie
die tRNAs, durch Spaltung freigesetzt
werden. Die übrigen Bereiche der Intergenic
Spacer Regions werden zu
Nukleotiden abgebaut. Dieser Abbau
findet ebenso nach dem Absterben der
Mikroorganismen statt. Da es in toten
Zellen zu keiner Transkription mehr
kommt, sind vier Stunden nach dem
Zelltod die Intergenic Spacer Regions
nicht mehr nachweisbar. Im Gegensatz
dazu lassen sich die 16S rDNA und
die 23S rDNA noch Tage nach dem
Zelltod nachweisen [8]. Somit stellen
die Intergenic Spacer Regions eine optimale
Möglichkeit zum Spezies-spezifischen
Nachweis von lebenden, d.h.
teilungsfähigen Organismen dar. Eine
eindeutige Identifizierung der Mikroorganismen
anhand der Intergenic
Spacer Regions wird so ermöglicht
[9].
Entwicklung des
Oligonukleotid-Chips
Oligonukleotid-Chips bieten die Möglichkeit,
das Vorkommen einer großen
Anzahl von Nukleinsäuresequenzen
auf kleinsten Raum schnell und
zuverlässig zu bestimmen.
Zum Nachweis aktiver, teilungsfähiger
Organismen wird in der Technischen
Mikrobiologie der TU Hamburg-Harburg
ein Oligonukleotid-
Chip-System entwickelt, das die relevanten
bierkontaminierenden neun
aeroben Stämme der Gattungen Lactobacillus
und Pediococcus, sowie
die drei anaeroben Stämme der Gattungen
Megasphaera und Pectinatus
anhand ihrer 16S rRNA und ihrer Intergenic
Spacer Regions identifiziert.

Zu diesem Zweck werden spezifische
Sonden entwickelt, die auf das
vorhandene Oligonukleotid-Chip Basissystem
übertragen werden. Das entwickelte
Basissystem ist gekennzeichnet
durch hohe Signalintensitäten, ein
geringes Backgroundsignal und eine
hohe Spezifität (siehe Abbildung 3),
das eine Diskriminierung von einer
einzigen Basenfehlpaarung ermöglicht.
Am Ende der Entwicklung steht ein
Oligonukleotid-Chip, der einen kombinierten
Nachweis von 16S rRNA und
ISR RNA erlaubt, um so einen Speziesspezifischen
Nachweis zu erhalten, der
Angaben zur Teilungsfähigkeit der detektierten
Mikroorganismen ermöglicht.
Thermopneumatisch
betriebenes DNA-Chip
Druckkopfsystem in
Mikrosystemtechnologie
Funktionsweise
Um ein schnelles und Rohstoffeinsatzverminderndes
Druckverfahren für
DNA-Chips zu entwickeln, wurde mit
Hilfe der in der Mikrosystemtechnik
etablierten Methoden ein multifunktioneller
Druckkopf und ein dazugehöriger
Basis-Chip mit modifizierter
Oberfläche hergestellt.
Der Druckkopf kann als in zwei
Fluidnetzwerke unterteilt angesehen
werden, die durch eine Anordnung
von Membranen in einer Siliziumschicht
voneinander getrennt sind
(siehe Abbildung 4). Eines der Netzwerksysteme
besteht aus den Fluidikkanälen,
getrennten Reservoiranschlüssen
für unterschiedliche Medien
sowie den Austrittdüsen und dient
zur Förderung der auf den Basis-Chip
aufzubringenden DNA-Suspension.
Der andere Fluidiknetz ist ein isoliertes
System von Fluidikkanälen, Heizelementen
und elektrischen Anschlüssen,
das mit einer Aktuatorflüssigkeit
gefüllt wird (siehe Abbildung 5).
Es wird der thermopneumatische
Effekt genutzt, um die Aktuatorflüssigkeit
zur Expansion zu bringen und
dadurch eine Auslenkung der in Silizium
strukturierten Membran zu bewirken.
Die Membranauslenkung verursacht
den Austritt der Mediumtropfen
an den Düsen. Als Steuersignal für
die Heizelemente wird eine statische
Spannung mit einem Rechtecksignal
überlagert. Der Pegel der DC-Spannung
wird so eingestellt, dass die Temperatur
der Aktuatorflüssigkeit in der
Umgebung der Heizelemente unmittelbar
unter der Verdampfungstemperatur
gehalten wird. Der Rechteckimpuls
löst den eigentlichen Vorgang des
Abb. 4: Schema des Druckkopfsystems.
Entstehens von Verdampfungsblasen
und folglich auch die Membranauslenkung
aus. Die dadurch an den Düsen
entstehenden Tropfen werden
durch Berührung mit der Basis-Chip
Oberfläche auf den Glas-Chip abgesetzt.
Ein Vorteil dieses Aktuator-Prinzips
liegt in der Möglichkeit einer homogenen
Integration der Aktuatorelemente
in das Fluidiknetz durch Strukturierungs-
und Beschichtungsprozesse
der Mikrosystemtechnik, wie Photolithographie,
plasmaunterstützte Ätzund
die Kathodenzerstäubungsprozesse
für die Heizmaterialien in situ.
Eigenschaften und
Charakteristiken des
Drucksystems
Die Abscheidung einer teflonartigen
Schicht [10] als plasmapolymerisierter
Phase wird verwendet, um eine
hydrophobe Filmoberfläche herzustellen,
die sich mit Hilfe des Photolithographieprozesses
strukturieren lässt.
Die Langzeitstabilität und dadurch
auch die sicheren Haftungseigenschaften
der Teflonschicht auf diversen
Oberflächen werden mittels eines im
PECVD Verfahren abgeschiedenen hexamethylhaltigen
Zwischenfilms erreicht.
Durch die teflonartige Schicht
kann auf dem Basis-Chip eine matrixförmige
Anordnung der hydrophoben
und hydrophilen Bereiche realisiert
werden, die eine genaue Lokalisierung
der abgesetzten Tropfen bewirkt. Die
Kontaktwinkelmessungen auf der
Chip-Oberfläche mit destilliertem
Wasser als Medium liefern Werte von
über 108° für die Teflonschicht.
Die auf Kapillarwirkung beruhende
Düsenstruktur in der Siliziumschicht
wurde durch eine plasmaunterstützte
Ätztechnik mit Hilfe von SF 6 ,
CHF 3 und O 2 Gasen realisiert [11]. Um
einen übersprechfreien und eingegrenzten
Tropfenaustritt zu gewährleisten,
wird der Ausgangsbereich der
Düsen mit dem hydrophoben Teflonfilm
beschichtet.
In den Fluidikkanälen zwischen den
einzelnen Aktuatorkavitäten befinden
sich mehrere Flusswiderstände in
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
65
Form von Verjüngungsbereichen. Diese
dienen als Dämpfung für eine
Druckwellenübertragung zwischen
den Aktuatormembranen. Die Kanäle
im Silizium werden mithilfe des plasmaunterstützten
isotropen Ätzprozesses
in einer SF 6 -Gas-Atmosphäre mit
einer Photolackmaskierung strukturiert.
Die Strukturierung der Aktua-
Abb. 5: Draufsicht auf den Aktuator-Array
mit den Fluidikkanälen
für die Aktuatorflüssigkeit, Membranen
und Heizelementen.
tormembran erfolgt durch anisotropes
nasschemisches Ätzen entlang der 111-
Kristallebene des Siliziumsubstrats in
einer Kaliumlauge-Lösung. Die Transportkanäle
und das Reservoir in der
Pyrexschicht werden durch einen isotropen
Ätzprozess in einer hochprozentigen
HF-Lösung strukturiert. Als
Maskenmaterial dienen für die verwendeten
Silizium- und Pyrex-Ätzverfahren
Polysilizium und Siliziumnitrid, die im
Niederdruck- bzw. plasmaunterstützten
Abscheideverfahren (LPCVD,
PECVD) hergestellt werden. Die strukturierten
Substrate werden schließlich
durch anodisches Bonden bei 350°C
und bis 900 V Spannung verbunden.
Um die Siliziumwafer miteinander
durch das feldunterstützte Bondverfahren
zu verbinden, wird als Zwischenschicht
eine in einem Kathodenzerstäubungsprozess
abgeschiedene Pyrexschicht
verwendet.
Verschiedene Strukturen können
als Heizelemente gewählt werden. Ihnen
ist gemeinsam, dass der elektrische
Widerstand der Heizfläche größer
ist als der der Leiterbahnen. Alternativ
können unterschiedliche Materialien
gewählt werden oder, bei
gleichem Material von Heizelementen
und Leiterbahnen, unterschiedliche
Geometrien. Die zweite Möglichkeit
wurde in diesem System gewählt, da
dafür die Anzahl an Herstellungsschritten
reduziert ist. Pyrex dient als
Substrat für die Heizdrähte, um die
optische Ausrichtung beim anodischen
Bonden auf dem Siliziumsubstrat
zu erleichtern.
Die Heizdrähte werden in einer im
Kathodenzerstäubungsprozess spannungsfrei
abgeschiedenen Chrom-Platin-Wolfram
Schicht strukturiert. Wolfram
dient als Opferschicht, die als
Maskierung dient und im letzten Herstellungsschritt
der Heizelemente entfernt
wird. Chrom dient als eine Haftschicht
zwischen Pyrex-Oberfläche
und Platinschicht und wurde wegen
seiner Diffusionseigenschaften gewählt.
Die Hauptkriterien für den Wahl
von in einem Sputterprozess abgeschiedenen
Platin für die Heizelemente
waren Langzeitstabilität und chemische
Beständigkeit über dem ganzen
Betriebstemperatur-Bereich. Die
Schichtdicken betragen 50 nm für
Chrom und bis 200 nm für Platin. Die
Länge der Heizstrecke variiert zwischen
70 µm bis 300 µm. Die geringste
Wert Breite der Mikroheizdrähte
beträgt 4 µm. Die Werte für die Betriebsleistung
der Heizelemente liegen
zurzeit im Bereich von 10-15 mW. Der
elektrische Widerstand eines Platin/
Chrom Heizelementes mit Abmessungen
5 µm x 70 µm bzw. 9 µm x
300 µm (siehe Abbildung 6) liegt bei
100 Ohm [12].
Abb. 6: Foto einer Dampfblase
zwischen der quadratischen Aktuatormembran
und dem Heizelement
mit Abmessungen 9 µm x
300 µm.
Es wurde untersucht, inwieweit
sich ein Standard-Tintenstrahldrukker
für den Einsatz zum Drucken auf
einem Objektträger auf Basis des entwickelten
Druckkopfsystems eignet.
Hierfür wurde ein HP-DeskJet 500
mit einer Auflösung von 300 dpi verwendet.
Für die Positionssteuerung
des Druckkopf-Chips wurde ein Programm
in der Programmiersprache
Quick BASIC geschrieben und eine
Druck-Testreihe auf einem Objektträ-

66 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
ger durchgeführt. Den Ausdrucken
war zu entnehmen, dass die Genauigkeit
der Positionssteuerung für die
Verwendung mit dem eigenen Druckkopf
ausreichend ist. Für die elektronische
Ansteuerung des Druckkopfdüsen
wurden die Signale direkt von der
Steuerungsplatine des Druckers über
angelötete Stiftleisten abgenommen.
Ein solcher Drucker eignet sich aufgrund
seiner Präzision hervorragend
für die Positionssteuerung des speziellen
Druckkopfs. Für den Druck auf
einem oder auch gleichzeitig mehreren
Objektträgern ist die Mechanik
des Druckers noch geeignet zu verändern.
Hierzu gehören insbesondere
der Ersatz des Papiereinzugs durch
einen Vorschub in Y-Richtung und die
Anpassung des Druckabstandes zum
Medium. Mithilfe eines einfachen PC-
Programms lassen sich dann unmit-
WIRKSTOFFSCREENING
telbar die geeigneten Positionen ansteuern.
Prinzipiell ist auch die Verwendung
der Druckkopfsteuerung für die Ausgabe
der Flüssigkeiten möglich. Da die
elektrischen Eigenschaften der Druckkopfsteuerung
bekannt sind, wird gegenwärtig
ein (analoges) Interface
zwischen der vorhandenen Elektronik
und dem neuen Druckkopf entwickelt,
sodass dadurch von der Drucker- bzw.
Software-Seite keinerlei Veränderungen
gegenüber einem üblichen Druckvorgang
notwendig sind. Lediglich im
Anwender-Programm selbst sind entsprechende
Anpassungen (Positionen,
Druckzeichen etc.) vorzunehmen.
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Entwicklung von innovativen
Mikrotiterplattenreaktoren zur
Bewertung des Abbaus und der
Toxizität neuer Wirkstoffe auf Basis
von Mikrosomen und Säugerzellen
� Prof. Dr. Elmar Heinzle 1 , M.Technol. Rahul Ravi Deshpande 1 , Dr. Udo Bock 2 , Dr. Gernot John 3 , Dr. Christian Krause 3 , Dr. Günther Müller 4 , Dr. Harald Waltenberger
4 , Dr. Ruth Maas 5 , 1 Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, 2 Across Barriers GmbH, Saarbrücken, 3 PreSens GmbH, Regensburg, 4
MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, 5 Pharmacelsus GmbH, Saarbrücken
Es werden neue Methoden zur Testung von Wirkstoffen erarbeitet, bei denen 96er-Mikrotiterplatten zur Messung der Sauerstoffaufnahmerate eingesetzt
werden. Die neu entwickelten Sensorplatten sollen somit helfen, das Screening von neuen Wirkstoffen schneller und kostengünstiger zu gestalten.
Keywords: 96-Well-Mikrotiterplatten-Reaktoren, Sauerstoff-Optosensor, Hepatocyten, Cytochrom P450.
Die Einführung neuer Wirkstoffe und
Chemikalien setzt neben den Tests für
die angestrebte biologische Wirksamkeit
umfangreiche Tests des Abbaus,
z. B. in der Leber, der Toxizität im
menschlichen Organismus und der
Ökotoxizität voraus. Diese Tests sind
kostspielig und involvieren in vielen
Fällen Tierversuche. Daneben gibt es
kaum Methoden kostengünstig das
Spektrum der Nebenwirkungen im
menschlichen Metabolismus breit zu
untersuchen. In diesem Projekt werden
neue, effektive Screening-Methoden zur
Bestimmung der Aktivität und des Abbaus
von Wirkstoffen und Chemikalien
und zur Bestimmung metabolischer
Aktivitäten von Säugerzellen erarbeitet.
Dies geschieht unter Einbeziehung von
neu zu entwickelnden Mikrotiterplatten
mit integrierter Sauerstoff-Messung.
Zur Erreichung des Ziels arbeiten vier
kleinere Unternehmen mit einer universitären
Forschungsgruppe zusammen.
Die Firmen PreSens und MicroCoat
entwickeln und produzieren Beschich-
[9] Gürtler, V., Stanisich, V.A., Microbiology
142 (1996), 3-16.
[10] Mex, L., Müller, J., Membrane Technology
115 (1999),5-9.
[11] Krusemark, O., Feustel, A., Müller, J.,
µTAS’98 (1999), 399-402.
[12] Injinaash, T., Müller, J., Proceedings
Sensor 2003: 11th International
Conference Sensor, Nürnberg
(2003), 375-379.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Jörg Müller
Mikrosystemtechnik
TU Hamburg-Harburg
D-21073 Hamburg
Tel.: 040-428 783 029
Fax: 040-428 782 396
eMail: j.mueller@tuhh.de
Web: www.tu-harburg.de/mst/
deutsch/index.shtml
tungen für Mikrotiterplatten für die
Online zu beobachtenden Zellkulturen.
Für die Zellkultivierung müssen
neue Sensoren für Flachbodenplatten
mit integrierter Sauerstoffmessung
entwickelt werden. Diese müssen besonderen
Anforderungen hinsichtlich
Haftung, Langzeitstabilität und Querempfindlichkeit
genügen. Für primä-

e Zellkulturen müssen diese zusätzlich
mit einer zellkompatiblen Schicht
versehen werden (Abbildung 1). Platten
dieser Art wurden neu konzipiert
und werden derzeit entwickelt. Dabei
werden geeignete Kombinationen von
Farbstoffen und geeignete Verfahren
der Sensoraufbringung erarbeitet.
Die Firmen AcrossBarriers und
Pharmacelsus entwickeln unter zu Hilfenahme
der entwickelten Mikrotiterplatten
und unter Benutzung neu entwickelter
Methoden der quantitativen
Auswertung und Analyse neue Verfahren
zum Testen des Abbaus von Pharmazeutika
und der Vitalität von Primärzelllinien.
Es werden Mikrosomen
mit den entsprechenden P-450-Cytochromen
der Leber zur Bestimmung
der Kinetik des Abbaus von Wirkstoffen
und Chemikalien eingesetzt. Die
Analyse der Substanzen soll durch die
Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate
abgelöst werden. Dadurch
können der Durchsatz erhöht
und Kosten und Materialverbrauch
erheblich reduziert werden.
In einem zweiten Einsatzgebiet wird
mit ganzen Zellen der Abbau von
Wirkstoffen untersucht. Im in vitro
BIOVERFAHRENSTECHNIK
Unterschiede von
Primärscreening zur
Produktion
„Aufgrund der sehr hohen Anzahl an
Einzelexperimenten ist eine Stammoder
Medienoptimierung ohne
Abb. 1: Flachboden-Mikrotiterplatte mit integrierter optischer Sauerstoffmessung
und zellkompatibler Beschichtung.
Bereich werden in der letzten Zeit vor
allem isolierte Rattenhepatozyten als
Modell zur Identifizierung und Charakterisierung
pharmakologischer
Metabolite von Arzneistoffen verwendet.
Die Lebensfähigkeit und die metabolische
Aktivität sollen mit Hilfe
einer Sauerstoffplatte durch die Bestimmung
der Sauerstoffaufnahmerate
überprüft werden. Während des Abbaus
von Arzneistoffen soll die Aktivität
der Zellen auf die gleiche Weise
gemessen werden. Die Arbeitsgruppe
Technische Biochemie der Universi-
Schüttelkolben undenkbar. Der Effekt
unterschiedlicher Medienkomponenten
ist relativ, und daher ist das
beste Medium oder der beste Stamm
in der Schüttelkultur auch die beste
Option für den Rührkessel“ (Abb. 1).
Derartige Aussagen finden sich häu-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
67
tät des Saarlandes entwickelt neue
Methoden zur Quantifizierung von Respirationsraten
in suspendierten und
adhärenten Zellkulturen. Dabei werden
mathematische Modelle entwikkelt
und eingesetzt, die Stofftransport,
Respiration und andere metabolische
Aktivitäten beschreiben. Es werden
zwei Arten von respiratorischen Messungen
in Mikrotiterplatten durchgeführt.
Die eine beruht auf einer kontinuierlichen
stationären Messung,
während bei der anderen die Dynamik
der Änderung der Sauerstoffkon-
figer in der Literatur [2]. Diese Haltung
ist eher von der Hoffnung geprägt
als von einer detaillierten Analyse
der tatsächlichen Verhältnisse.
Eine quantitative Änderung des Niveaus
der Produktkonzentration
oder -ausbeute wird allgemein erwar-
zentration bedingt durch den Stofftransport
und die biologische Aktivität
zur Bestimmung der Sauerstoffaufnahmerate
verwendet wird. Die Validierung
der Methode geschieht durch
Vergleiche mit Kultivierungen in Bioreaktoren.
Dies geschieht vornehmlich
mit CHO Zellen, die auf einem definierten
Medium wachsen können.
Später folgt eine Validierung mit bekannten
Wirkstoffen. Mit einer robusten
adhärenten BHK-Zelllinie werden
die Methoden der Sauerstoffmessung
mit adhärenten Zellen erarbeitet und
getestet. Diese Methoden werden in
einer späteren Phase des Projekts
auch auf Hepatozyten angewendet.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Elmar Heinzle
Universität des Saarlandes
Technische Biochemie
Gebäude 2
D-66123 Saarbrücken
Tel.: 0681-302 29 05
Fax: 0681-302 29 05
eMail: e.heinzle@mx.uni-saarland.de
Web: www.uni-saarland.de/fak8/
heinzle
Primärscreening von Mikroorganismen
unter Fed-Batch-Bedingungen
� Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs1 , Dipl.-Ing. (FH) Markus Jeude1 , Priv. Doz. Dr. rer. nat. Doris Klee2 , Dipl.-Chem. Barbara Dittrich2 , Dr.-Ing. Tibor Anderlei3 1 2 3 Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, RWTH Aachen, Lehrstuhl für Textilchemie und Makromolekulare Chemie, RWTH Aachen, AC Biotec, in Jülich
In der modernen Fermentationstechnik werden zunehmend Biotransformationen in der Fed-Batch-Betriebsweise durchgeführt. Diese nicht-kontinuierliche
Betriebsweise wird aufgrund der Tatsache benötigt, dass ausbeuteminimierende Stoffwechselphänomene in einer Batch-Prozessführung nicht kontrolliert
werden können. Der Fed-Batch-Betrieb ermöglicht in vielen Fermentationsprozessen eine optimale Ausbeute an Biomasse und/oder Produkt. Zu
Beginn einer Bioprozessentwicklung steht das Primärscreening mit der Suche und Generierung geeigneter Produktionsstämme und -medien. Da die
statistische Wahrscheinlichkeit gute oder verbesserte Stämme und Medien zu finden relativ gering ist, müssen sehr viele Experimente durchgeführt werden.
Der Aufwand für jede einzelne Kultur muss daher so gering wie möglich gehalten werden. Um den erforderlichen hohen Durchsatz zu erreichen,
werden im Primärscreening ausschließlich Schüttelreaktoren verwendet. Grundsätzlich werden die Schüttelreaktoren im Batch betrieben, wohingegen
die Produktionsprozesse unter Fed-Batch-Bedingungen laufen. Eine fehlerhafte Auswahl von Stämmen und Medien im Primärscreening aufgrund eines
ungeeigneten Testsystems wirkt sich auf die gesamte folgende Prozessentwicklung aus und kann in der Regel nicht mehr kompensiert werden [1].
Keywords: Primärscreening, Fermentationstechnik, Prozessentwicklung, Fed-Batch; Schüttelreaktoren, Bioverfahrenstechnik.
tet. Es gibt allerdings genügend Beispiele,
bei denen sich auch die qualitative
Rangfolge von Stämmen oder
Medien beim Wechsel von Reaktor,
Betriebsweise oder Maßstab ändert.
Dafür gibt es mindestens drei Gründe:

68 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Durch mangelndes verfahrenstechnisches
Wissen über Schüttelreaktoren
[1,3] und der Tatsache, dass bisher
keine online Messtechniken für Schüttelreaktoren
existierten, werden diese
häufig unbewusst unter Sauerstofflimitierung
betrieben. Es ist inzwischen
unbestritten, dass sich eine Sauerstofflimitierung
nicht nur quantitativ in der
biologischen Aktivität der Kulturen niederschlägt,
sondern sich auch qualitativ
auf die Auswahl der Stämme und der
Medienzusammensetzungen auswirkt
[1,6]. Das Wissen über die verfahrenstechnischen
Grundlagen des Stofftransfers
in Schüttelreaktoren hat in den letzten
Jahren allerdings enorm zugenommen
[4]. Durch die am Lehrstuhl für
Bioverfahrenstechnik der RWTH
Aachen neu entwickelte Technik zur
Online-Bestimmung der Atmungsraten
in Schüttelreaktoren (Handelsname:
RAMOS) kann nun die biologische Aktivität
der Mikroorganismen während
der Kultur verfolgt werden und es lassen
sich Sauerstofflimitierungen meist
zweifelsfrei identifizieren [5]. Die Frage
der Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen
stellt daher bei richtiger
Handhabung kein grundsätzliches Problem
bei der Übertragung von Ergebnissen
aus Schüttelreaktoren in gerührte
Fermenter dar.
Bei Schüttelreaktoren kann der pH-
Wert nicht reguliert werden. Bei biologischen
Kulturen, die aufgrund ihrer
spezifischen Stoffwechselaktivität zu einer
starken Veränderung des pH-Werts
neigen, sind suboptimale Verhältnisse
die Folge. Die Effekte lassen sich durch
Zugabe von pH-Puffern zwar vermindern,
diese Zugaben erhöhen allerdings
den osmotischen Druck, worauf
die Mikroorganismen mehr oder minder
empfindlich durch eine Verlängerung
der lag-Phase und Reduktion der
Wachstumsrate reagieren können. In
pH-geregelten Fermentern kann dagegen
der pH-Wert immer im optimalen
Bereich gehalten werden, und es
kommt zu niedrigen osmotischen
Drücken. Durch richtige Wahl eines
Puffers, dessen Konzentration und Anfangs-pH-Wert
lassen sich die Probleme
aber meist minimieren.
Als gravierendster qualitativer Unterschied
zwischen dem Primärscreening
und der Produktion ist die Betriebsweise
der verwendeten Reaktoren anzusehen.
Durch die Entwicklung einer neuen
Nachfütterungstechnik, um diesen
Unterschied zu eliminieren, soll bereits
beim Primärscreening im Schüttelreaktor
unter ähnlichen Bedingungen
(„Fed-Batch“) gearbeitet werden wie
in der späteren Produktion. Besonderer
Bedarf an einem hoch parallelisier-
Abb. 1: Illustration der Problematik beim Wechsel von Bioreaktor, Betriebsweise und Maßstab.
ten geschüttelten Screeningsystem mit
prozesshinreichender Betriebsweise
liegt in folgenden Bereichen vor:
– Screening von Naturisolaten oder
Stammbanken auf neue Aktivitäten,
– Screening von DNA-Mutanten, die
durch evolutive Techniken (z.B. error
prone PCR) erzeugt wurden,
– Stammentwicklung durch konventionelle
Mutagenese,
– Entwicklung rekombinanter Stämme,
bei denen das Fremdgen ins Chromosom
integriert wird,
– Medienentwicklung,
– Expression von synthetischen cDNA-
Banken,
– Expression von DNA-Fragmenten
nicht kultivierbarer Mikroorganismen.
Auswirkungen der Batchund
Fed-Batch-
Betriebsweise auf den
Metabolismus von
Mikroorgansimen
Der qualitative Unterschied zwischen
Batch- und Fed-Batch-Betriebsweise
wirkt sich auf Mikroorganismen physiologisch
ganz unterschiedlich aus.
Das ist ganz besonders ausgeprägt,
wenn die Systeme folgende mikrobielle
Eigenschaften aufweisen:
Spezifische
Substratüberschussinhibierung
Um die Kosten der Aufarbeitung zu
minimieren, versucht man in der industriellen
Fermentation das Produkt
am Ende des Prozesses so hoch wie
möglich zu konzentrieren. Wird deswegen
eine hohe Anfangssubstratkonzentration
wie beim Batch-Prozess eingestellt,
folgt daraus häufig eine Inhibierung
des produktbildenden Stoffwechselwegs
[7].
Unspezifische Inhibierung
aufgrund niedriger
Wasseraktivität bzw. hohen
osmotischen Drucks
Im Batch werden alle Substrate mit
hoher Anfangskonzentration zur Verfügung
gestellt. Dadurch kann es zu
Inhibierungen aufgrund niedriger
Wasseraktivität bzw. hohen osmotischen
Drucks kommen.
Overflow-Metabolismus
Häufig wird bei hohem Substratangebot
z.B. von Glucose im Batch-Betrieb
nach dem Einschleusen in den
Mikroorganismus eine nicht-vollständige
Oxidation durchgeführt. Es
kommt daher zur Bildung und Ausscheidung
von anaeroben Stoffwechselprodukten
wie z.B. Lactat, Acetat,
Ethanol etc. Bekannte Mikroorganismen
dieser Klasse sind Saccharomyces
cerevisiae oder Escherichia
coli.
Katabolitreprimierte
Produktbildung
Mit diesem Begriff werden Phänomene
mechanistisch umschrieben, bei
denen die Synthese der für die Produktbildung
notwendigen Enzyme
bei hohen Konzentrationen z.B. der
Kohlenstoffquelle unterdrückt ist.
Erst bei Unterschreiten der Derepressionsschwelle
eines Operons
wird die Enzymbildung induziert und
die Produktbildung eingeleitet. In
synthetischen Medien produzieren
Mikroorganismen mit intakter Regulation
der Expressionssysteme im
Batch praktisch kein Produkt. Erst
wenn die reprimierende Kohlenstoffquelle
fast aufgebraucht ist, wird die
Katabolitrepression aufgehoben. Die
dann noch vorhandene geringe Menge
an Kohlenstoffquelle kann im Gegensatz
zum Fed-Batch-Betrieb zu
keinen nennenswerten Produktmengen
mehr umgewandelt werden.
Durch ein im Batch durchgeführtes
Screening werden lediglich jene Mikroorganismen
mit defekter Regulation
gefunden, die z.B. einen „leaky-
Promotor“ aufweisen. Das konnte
z.B. bei der Hefe Hansenula polymorpha
explizit gezeigt werden. Somit
läuft die Expression bei diesen
Mikroorganismen schon bei relativ
hohen, normalerweise reprimierenden
Substratkonzentrationen oder
sogar konstitutiv ab, was unerwünscht
ist.
Abb. 2: Fermentation der Hefe Hansenula polymorpha. Im Vergleich zum
Batch mit einer Anfangssubstratkonzentration von 20 g/L konnte alternativ
durch Dosierung von 20 g/L Glucose im Fed-Batch-Prozess der Overflow-Metabolismus
und somit die Bildung von Ethanol und das diauxische
Wachstum weitgehend unterdrückt werden.
Sauerstofflimitierung
Bei besonders schnell wachsenden
und sauerstoffverbrauchenden Mikroorganismen,
wie z.B. E. coli,
kann im Batch-Betrieb ab einer Biomassekonzentration
von 6-10 g/L in
schikanelosen Schüttelreaktoren

häufig der benötigte Sauerstoff vom
Bioreaktor nicht mehr nachgeliefert
werden. In der Folge kommt es zu
einer Ausscheidung von hemmenden
anaeroben Stoffwechselnebenprodukten.
Dadurch screent man unbewusst
auch auf Unempfindlichkeit
der Mikroorganismen gegenüber
diesen Ausscheidungsprodukten. Als
industriell relevante Mikroorganismen
sind hier z.B. Corynebacterium
glutamicum oder Pichia stipidis
zu nennen.
In allen oben aufgeführten Fällen
bringt eine Fed-Batch-Betriebs-
BIOPHARMAZEUTIKA
weise in der Produktion grundsätzliche
Vorteile, die in einem Screening
im Batch nicht nachgestellt
werden können. Abbildung 2 zeigt
als Beispiel Ergebnisse von ersten
Vorarbeiten. Während die Batch-
Kultur durch Overflow-Metabolismus
Ethanol als Zwischenprodukt
bildet und später (14-17 h) wieder
verbraucht (Diauxie), zeigt die im
Fed-Batch betriebene Kultur deutlich
eine einphasige metabolische
Aktivität mit anschließender Atmung
auf erhöhtem Niveau (Fed-
Batch-Phase).
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
69
Literatur
[1] Büchs, J., Biochem. Eng. J. 7 (2001),
135-141.
[2] Kennedy, M.J., Reader, S.L., Davies,
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Microbiology 141 (1995) 663-669.
Plant Made Pharmaceuticals
[7] Riesenberg D., Curr. Opin. Biotechnol.
2 (1991), 380-384.
Korespondenzadresse
Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs
Rheinisch-Westfälische Technische
Hochschule (RWTH) Aachen
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Worringerweg 1
D-52074 Aachen
Tel.: 0241-802 55 46
Fax: 0241-802 22 65
eMail: buechs@biovt.rwth-aachen.de
(PMP) – Die Pflanze als Bioreaktor
� PD Dr. rer. nat. Michael Kleine, Planton GmbH, Kiel
Humane antimikrobielle Peptide zählen zu einer neuen Klasse von Biopharmazeutika. Diese Peptide besitzen einen sehr effektvollen Wirkmechanismus
der angeborenen Abwehr gegen Bakterien, Pilze und Viren. Die zunehmende Resistenzentwicklung verschiedener Erreger, wie sie gegenüber herkömmlichen
Antibiotika beobachtet wird, tritt bei humanen Peptiden nicht auf. Medizinisch können diese körpereigenen Proteine langfristig nur dann genutzt
werden, wenn Produktionssysteme zur Verfügung stehen, die eine kostengünstige, sichere und nachhaltige Herstellung dieser Substanzen garantieren.
Die PLANTON GmbH entwickelt und optimiert die Produktion von antimikrobiellen Peptiden in Kartoffelpflanzen. Die Pflanze ist der effizienteste und umweltfreundlichste
Bioreaktor der Erde: Sie nutzt das Sonnenlicht als Energie- und Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle. Die nahezu identische Proteinbiosynthese
in Mensch und Pflanze ermöglicht es, Kartoffeln als Bioreaktoren zur Erzeugung rekombinanter Biopharmazeutika zu nutzen. Das humane Zielprotein
wird in der Kartoffelpflanze produziert und in der Knolle angereichert. Das aus der Knolle isolierte rekombinante Protein kann für präklinische
und klinische Studien verwendet werden.
Keywords: Defensine, Biopharmazeutika, Kartoffel, antimikrobielle Peptide, HBD-2, Promotor-Tagging.
Einleitung
Rekombinante humane Proteine spielen
in zunehmendem Maße eine bedeutsame
Rolle in der Diagnose und
Therapie von Krankheiten. Mittlerweile
beträgt der weltweite Markt für rekombinante
Therapeutika mehr als 20 Milliarden
(Mrd.) US$ mit jährlichen
Wachstumsraten von 20 bis 30 % [1].
Zudem ist zu erwarten, dass im Zuge
der Humangenomforschung und der
damit verbundenen Funktionsanalyse
weitere menschliche Proteine isoliert
werden, die sich für den pharmazeutischen
Einsatz verwenden lassen. Medizinisch
gesehen können diese körpereigenen
Proteine allerdings langfristig
nur dann genutzt werden, wenn
Produktionssysteme zur Verfügung stehen,
die eine kostengünstige, sichere
und nachhaltige Herstellung biopharmazeutischer
Substanzen zulassen.
Eine umwelt- und ressourcenschonende
Alternative zur Herstellung rekombinanter
Proteine in Zellkultursystemen
bietet die Produktion von
Biopharmazeutika in grünen Pflanzen,
die als autarke Bioreaktoren zur
Erzeugung humaner Proteine Verwendung
finden [2].
Die PLANTON GmbH strebt die
großtechnische Produktion einer
Klasse humaner antimikrobieller Peptide
- der Defensine - in Pflanzen an.
Mit der Verwendung antimikrobieller
Peptide, die in mehrzelligen Organismen
einen evolutionär gesehen alten,
aber sehr effektvollen Wirkmechanismus
der angeborenen Abwehr gegen
mikrobielle Erreger darstellen, kann
eine neue Klasse antiinfektiver Therapeutika
entwickelt werden [3].
Der Markt für Antiinfektiva ist einer
der größten der Pharmabranche
mit einem Volumen von über 23 Mrd.
US$ im Jahr 2002 (www.imshealth
.com). Trotz der großen Anzahl an
verschiedenen Antibiotika-Präparaten
(150 FDA-genehmigte antibakterielle
Medikamente in den USA) sind die
meisten Präparate chemisch gesehen
Abkömmlinge von antimikrobiellen
Substanzen (z. B. Penicillin), die von
Mikroorganismen wie Bakterien oder
Pilzen produziert werden. Die Wirksamkeit
dieser Substanzen in der medizinischen
Praxis wird zunehmend
durch die Bildung resistenter Keime
eingeschränkt.
Antimikrobielle Peptide
Defensine sind Mediatoren der angeborenen
Abwehr in Mensch, Tier und
Pflanze [3].
In vitro Tests zeigten, dass sie antimikrobielle
Aktivität gegen Gram-positive
und Gram-negative Bakterien
[5], Pilze [6], enkapsidierte Viren
[7] und andere Parasiten besitzen. β-
Defensine bilden dabei eine Gruppe
von kationischen antimikrobiellen
Peptiden mit einer Größe von 3-5
kDa, die durch eine charakteristische
Faltung über Disulfidbrücken zwischen
konservierten Cysteinen gekennzeichnet
sind [8]. Ihre sehr effiziente
und stabile Wirkungsweise
wird unter anderem auf die Permeabilisierung
von Zellmembranen des
attackierenden Erregers zurückgeführt
[9,10].
Die humanen β-Defensine HBD-2
[11] und HBD-3 [12], die aus speziellen
menschlichen Hautzellen (Keratinocyten)
isoliert worden sind,
weisen ein breites Wirkungsspektrum
gegen humanpathogene Erreger auf.
Erste biologische in vitro-Tests mit
HBD-2 aus der menschlichen Haut
zeigten, dass HBD-2 insbesondere

70 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
gegen Gram-negative Bakterien sowie
gegen den Pilz Candida albicans
wirkt. Daraus ergeben sich breite Indikationsfelder
in der Humanmedizin.
Die für HBD-2 und HBD-3 codierenden
Gene sind isoliert worden,
sodass mit Hilfe gentechnologischer
Methoden Produktionsverfahren für
beide Peptide entwickelt werden können.
Allerdings ist aufgrund ihrer antimikrobiellen
Aktivität keine effiziente
großtechnische Expression der rekombinanten
HBD-2 und HBD-3-Peptide
in herkömmlichen mikrobiellen
Systemen möglich.
Plant Made
Pharmaceuticals
Die Pflanze ist als photoautotropher
Organismus in der Lage, unter Ausnutzung
des Sonnenlichts, des Treibhausgases
Kohlendioxid und durch
Aufnahme von mineralischen Nährstoffen
große Mengen an Biomasse,
darunter auch Proteine, zu produzieren.
Die Pflanze bietet als Bioreaktor für
rekombinante Proteine ein energetisch
günstiges, ressourcenschonendes
und ein im Sinne der Nachhaltigkeit
umweltfreundliches Produktionssystem.
Angesichts des kostengünstigen,
fast beliebig expandierbaren
landwirtschaftlichen Produktionsverfahrens
im Feldanbau, kann das gewünschte
Humanprotein in großen
Mengen preisgünstig hergestellt werden.
Im Vergleich dazu erfordert die
Kultivierung heterotropher Zellen in
Fermentationsanlagen einen hohen
Energieaufwand: Zum einen in Form
einer kostenintensiven „Fütterung“
mit einer Kohlenstoffquelle, zum anderen
müssen die Kulturen permanent
temperiert und belüftet werden.
Darüber hinaus müssen aber auch die
Anlagen selbst aufwändig sterilisiert
werden, um eine Kultivierung der Organismen
überhaupt zu ermöglichen.
Das pflanzliche System dagegen nutzt
das Sonnenlicht als Energiequelle -
lediglich für Anbau und Ernte muss
Energie aufgewendet werden. In Tabelle
1 werden das pflanzliche, mikrobielle
und tierische System zur
Produktion rekombinanter Proteine
gegenübergestellt.
Neben den ökonomischen und
ökologischen Gesichtspunkten sprechen
viele qualitative Vorteile für den
Bioreaktor Pflanze zur Produktion
rekombinanter Proteine, insbesondere
solcher, die für die pharmazeutische
Nutzung verwendet werden
Abb. 1: Schematische Darstellung des PMP-Prozesses.
sollen. Expressionssysteme in tierischen
Zellen synthetisieren humane
Proteine zwar korrekt, sind aber sehr
teuer und darüber hinaus stark anfällig
gegenüber Umweltveränderungen,
besonders wenn rekombinante
Proteine im industriellen Maßstab
gefertigt werden sollen [13,14]. Mikrobielle
Zellkultursysteme sind
diesbezüglich zwar stabiler, jedoch
oft nicht in der Lage komplexe humane
Proteine richtig zu synthetisieren
und zu falten, sodass diese Moleküle
ihre biologische Aktivität einbüßen.
Die Kartoffel als PMP-
System
Die PLANTON GmbH konnte mit der
Expression eines antimikrobiellen
Peptids im pflanzlichen System bereits
erfolgreich zeigen, dass sich Defensine
grundsätzlich in Pflanzen herstellen
lassen. Als Produktionssystem wird
die Kartoffelpflanze verwendet. Diese
Kulturart bietet wesentliche Vorteile
gegenüber anderen Arten:
– Einfache Transformation und Regeneration.
– Schnelle, klonale Vermehrung.
Tab. 1: Eigenschaften verschiedener Systeme zur Herstellung rekombinanter
Proteine.
Kosten
Qualität
Anwendung
Faktor Transgene Mikroben 1 Säuger-
Pflanzen zellen
Produktionskosten gering gering - mittel hoch
Zeitaufwand 2 mittel gering - mittel mittel
Scale up Kosten gering hoch 3 hoch 3
Vermehrung leicht leicht schwer
Produktivität hoch mittel - hoch mittel
Produktqualität hoch mittel hoch
und -homogenität
Glykosylierungsmuster 4 abweichend keine abweichend
Kontaminationsrisiko nein ja 5 ja 6
Daten-Monitoring mittel leicht leicht
Ethische Bedenken existent gering existent
GMP 7 -Konformität machbar etabliert etabliert
Lagerung transgenen leicht/RT mittel/-20°C schwierig/N 2
Materials
1 2 3 Bakterien, Hefen; Herstellung transgener Organismen; teure Anlagen zur Kultivierung und
Tierhaltung; 4 im Vergleich zum humanen Glykosylierungsmuster; 5 Endotoxine; 6
Humanpathogene; 7 Good Manufacturing Practice8 (aus: Entwicklung und Anwendung der
Technologieplattform „Molekulares Farming“, Strategiepapier zum BMBF Workshop,
Braunschweig, November 2001).
– Kultur-und Erntebedingungen weltweit
etabliert.
– Industrielle Prozessierung etabliert
(Stärkeproduktion).
– Ertragsorgan Kartoffelknolle lagerund
transportfähig.
– Große Biomassenproduktion möglich
(>300 dt Kartoffelknollen/ha).
– Keine Auskreuzungsgefahr des
Transgens, da Blüten obsolet.
Darüber hinaus eignet sich das System
aus folgenden Gründen insbesondere
für die Biopharmazeutika-
Produktion:
– GRAS (generally recognised as
safe) – Organismus
– Klonale Vermehrung, Erstellung
einer genetisch identischen Population
und damit hohe homogene Produktqualität
gewährleistet.
– Erstellung und permanente Erhaltung
einer transgenen Masterlinie
(Produktionslinie) möglich.
– Evtl. Einkreuzung von Fremdpollen
hat keinen Einfluss auf die Produktqualität,
da vegetatives Ernteorgan
(Kartoffelknolle).
– Monitoring von Pflanzenviren etabliert.
Entwicklung hoch
effizienter
Expressionskassetten
Ziel der PLANTON GmbH ist es, die
Expression des pflanzlichen Produktionssystems
um ein Vielfaches zu steigern
und damit eine hohe Ausbeute
an rekombinantem Protein zu erzielen
(30–150 mg/kg Kartoffelknollen).
Des Weiteren soll die Expression und

Einlagerung des Proteins in das Ertragsorgan
– die Kartoffelknolle – dirigiert
werden. Dazu soll eine optimierte
Expressionskassette in einem
binären Vektor entwickelt werden. Sie
soll zudem eine schnelle und effiziente
Fusionierung und/oder Austausch
verschiedener genetischer Elemente
(wie Promotoren und andere Genelemente)
ermöglichen, um eine optimale,
individualisierte Expressionskassette
für das jeweils zu exprimierende
Gen zur Verfügung zu stellen.
Promotoren
Der Weg zu einem effizienten pflanzlichen
Expressionssystem führt über
die Wahl des richtigen Promotors.
Promotoren bestimmen nicht nur die
Expressionsstärke eines Transkripts,
sondern entscheiden auch darüber, in
welchem Gewebe und zu welchem
Entwicklungszeitpunkt der Pflanze das
Transkript gebildet wird. Hierzu stehen
PLANTON bereits verschiedene
Promotoren zur Verfügung.
Um aber knollenspezifische Promotoren
aus der Kartoffel zu isolieren
und für die Produktion von Biopharmazeutika
in der Pflanze einzusetzen,
wird das so genannte Promotor-Tagging
angewendet.
Dazu werden Kartoffelpflanzen mit
einem binären Vektor (pPROMTAG)
transformiert, der auf seiner T-DNA
ein promotorloses Reportergen (GUS)
besitzt. Dieses Reportergen codiert für
ein Enzym, das eine Substratumsetzung
zu einem blauen Farbstoff katalysiert.
Dabei integriert die T-DNA
transformierter Pflanzen in das Kartoffelgenom.
Überall dort, wo sich das
Reportergen in unmittelbarer Nähe zu
einem aktiven Promotorelement befindet,
wird das Gen transkribiert und
das Enzym gebildet. Die Pflanzenorgane,
in denen das Enzym aktiv ist,
werden durch die Blaufärbung sichtbar
gemacht.
Im nächsten Schritt erfolgt dann die
Isolierung und molekulare Analyse
der unbekannten Promotorregion
mittels inverser PCR (Abb. 2). Hierzu
wird die genomische DNA der selektierten
Linien isoliert, mit einem Restriktionsenzym
inkubiert, das einmal
im Reportergen und einmal in der unbekannten
genomischen DNA schneidet.
Es folgt die Zirkularisierung der
Restriktionsfragmente durch Ligation
und schließlich die Amplifikation der
unbekannten Region (Abb.2, hellblaue
Bereiche) durch PCR mit spezifischen
Primern, die an die beiden
bekannten flankierenden DNA-Regionen
aus dem Reportergen binden.
Die so erzeugten PCR-Fragmente
werden sequenziert. Die anschließende
Datenbank-Recherche ermöglicht
es dann, die entsprechenden Promotorbereiche
in silico zu identifizieren.
Alternativ dazu kann mit Hilfe der PCR-
Produkte die physikalische Isolierung
der Promotorregion aus genomischen
Bibliotheken erfolgen.
Die identifizierten und isolierten
Promotoren werden dann zur Funktionsanalyse
vor Reportergene (GUS/
GFP) ligiert und per Agrobacterium
in Kartoffeln überführt, um ihre gewebespezifische
Aktivität zu bestätigen.
Für die Detektion der knollenspezifischen
Expression in der Promotor-
Tagging Population wird das Mikroknollen-System
eingesetzt. Dazu werden
die transformierten Kartoffeln auf
ein Medium überführt, dass das
Wachstum von Mikroknollen induziert.
Das hat den Vorteil, dass bereits
10 –12 Wochen nach der Transformation
die ersten Kartoffelknollen für die
weitere Analyse zur Verfügung stehen.
Das Mikroknollen-System (Abb. 3)
wurde bereits erfolgreich zur Vorselektion
transgener Pflanzen eingesetzt.
Es konnte gezeigt werden, dass das
Reportergen unter dem konstitutiven
35S-Promotor auch in der Mikroknolle
exprimiert wird (Abb. 3A) und damit
ein Screening der Mikroknollen
mit Hilfe des GUS-Assays möglich ist.
Dieses einfache Nachweisverfahren
ermöglicht ein schnelles Sichten einer
großen Anzahl an transgenen Kartoffellinien.
Transformation,
Regeneration und
Selektion transgener
Kartoffelpflanzen
Für die Testung der neuen Expressionkassetten
in der Kartoffel werden
transgene Pflanzen mit der Methode
der Sprosstransformation hergestellt.
Hierzu werden Pflanzen unter sterilen
in vitro Bedingungen vermehrt
und für den Transformationsprozess
eingesetzt. Die Sprosse der gewachsenen
Pflanzen werden geschnitten
und für die Erhaltung der Pflanzen
auf ein Kulturmedium übertragen
sowie für die Transformation mit
Agrobacterium tumefaciens verwendet.
Unter sterilen Bedingungen werden
die Bakterien in einem Kulturmedium
mit einem Antibiotikum vorkultiviert.
Danach erfolgt der eigentliche
Transformationsvorgang. Dafür
werden die Pflanzenteile in der Bakteriensuspension
inkubiert und an-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
71
Abb. 2: Promotor-Tagging aus genomischer Kartoffel-DNA.
schließend auf ein Co-Kultivierungsmedium
übertragen.
Die durch die Inkubation der Agrobakterien
mit dem Kartoffelgewebe ins
Pflanzengenom integrierte T-DNA enthält
neben den Expressionkassetten zusätzlich
einen Selektionsmarker, der die
Selektion erfolgreich transformierter,
regenerierter Pflanzen ermöglicht. Nur
transgene Sprosse können auf solch einem
Medium wachsen.
Nach der Co-Kultivierung mit den
Agrobakterien erfolgt das Übersetzen
der Pflanzenteile (Explantate) auf ein
weiteres Kultivierungsmedium. Nach ca.
3-5 Wochen bilden sich erste Sprosse,
die abgeschnitten und auf ein Spross-
Elongations-Medium gesetzt werden.
Nach weiteren 2-3 Wochen erfolgt der
Transfer dieser Sprosse zur Bewurzelung
auf Murashige/Skoog-Medium. Anschließend
werden die bewurzelten
transgenen Pflanzen zur Erstellung einzelner
Kartoffellinien vermehrt. Von allen
Linien werden Langzeiterhaltungskulturen
und Erdkulturen angesetzt. Ziel
ist es, etwa 50–100 transgene Linien pro
Expressionskassette zu erzeugen.

72 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 3: Das Mikroknollen-System im GUS-Test (A) und in vitro (B).
Nach erfolgter Linienerstellung aus
dem Promoter-Taggging-Ansatz mit
dem pPROMTAG1-Vektor werden die
Kartoffelpflanzen erneut vermehrt
und auf ein Knolleninduktionsmedium
überführt. Mit Hilfe dieses Mediums
werden dann 10-12 Wochen später
erste Mikroknollen in vitro an den
Kartoffelkulturen sichtbar. Diese Mikroknollen
können dann direkt für
den GUS-Test zur Selektion von Pflanzen,
die eine knollenspezifische Blaufärbung
aufweisen, herangezogen
werden.
Aufreinigungsprozess
Der PLANTON GmbH steht Gewächshausfläche
zur Verfügung, die zur Erzeugung
von Kartoffelknollen aus transgenem
Pflanzenmaterial in Erdkulturen
genutzt wird. Diese Knollen werden zur
Aufreinigung von rekombinantem Protein
verwendet. Es werden zunächst
Proteinmengen im mg-Bereich benötigt,
damit reines und biologisch aktives
ß-Defensin für die Aktivitätstests zur
Verfügung steht. Nach Gewebeaufschluss,
Filtrations- und Zentrifugati-
onsschritten erfolgt die chromatographische
Aufreinigung. Die Reinheit des
Peptids wird mittels Gelelektrophorese
und Massenspektrometrie kontrolliert.
Biologische Aktivität der
rekombinanten Peptide
Durch die Produktion von HBD-2 im
pflanzlichen System ist es erstmals
möglich, β-Defensine in größeren
Mengen (mg-Mengen) zur Verfügung
zu stellen. Mit diesem Material werden
Testverfahren entwickelt, die eine Vielzahl
von humanpathogenen Mikroorganismen
einschließen. Neben den einzelnen
Organismen zur Abschätzung
des Wirkungsspektrums der rekombinanten
Peptide können aber auch verschiedene
andere Parameter wie Salztoleranz,
Säurefestigkeit, Konzentrationsabhängigkeit
sowie die Resistenzentwicklung
von pathogenen Erregern
nach längerer Kultivierung der Organismen
unter Gabe von β-Defensinen
intensiv untersucht werden.
Dazu sollen zunächst entsprechende
biologische Testverfahren entwik-
kelt werden. Dabei werden die Peptide
auf antimikrobielle Aktivität gegen
verschiedene humanpathogene Erreger
untersucht. Zunächst sind Stämme
folgender, für die menschliche Gesundheit
bedeutsamer Erreger, vorgesehen:
– Pseudomonas aeruginosa,
– Escherichia coli,
– Staphylococcus aureus,
– Streptococcus pyogenes,
– Candida albicans
Dieses Verfahren dient in einem ersten
Schritt zur Festlegung des Erregerspektrums,
das von den in Pflanzen
produzierten β-Defensinen erfolgreich
bekämpft werden kann. Des Weiteren
soll ein Mikroverdünnungstest mit o. g.
Erregern eingesetzt und die „Minimal
Inhibitory Concentration“ (MIC) in Abhängigkeit
von der Erreger-Konzentration
bestimmt werden.
Literatur
Besuchen Sie unsere Homepage
www.dbu.de
Dort finden Sie weitere
Biotechnologie-Projekte in
unserer Projektdatenbank
(www.dbu.de/db/)
[1] Baez, J., Russell, D., Craig, J., Biopharm.
3 (2000).
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Korrespondenzadresse
Dr. Michael Kleine
PLANTON GmbH
Am Kiel-Kanal 44
D-24106 Kiel
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Fax: 0431-38015 11
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MYKOTOXINANALYTIK
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
73
Innovative Nachweisverfahren
für Mykotoxine
� Dr. Bernhard Reck1 , Dr. Richard Dietrich2 , Dr. Christine Bürk2 , Björn Lauer3 , Dr. Thomas Reinard3 1 2 3 R-Biopharm AG, Darmstadt, Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, LMU München, LG Molekulargenetik, Universität Hannover
Mykotoxin-belastete Lebens- und Futtermittel stellen eine ernstzunehmende Gesundheitsgefährdung für Mensch und Tier dar. Eine Überwachung der
Schimmelpilztoxine in unseren Nahrungsmitteln ist deshalb ein zentrales Anliegen des gesundheitlichen Verbraucherschutzes. Im Rahmen von zwei Projekten
werden innovative Weiterentwicklungen für den Einsatz von spezifischen Antikörpern zum Nachweis von Mykotoxinen verfolgt: Mit einem Mykotoxin-Array
sollen sechs der wichtigsten Mykotoxine in einem einfachen und schnellen immunologischen Test gleichzeitig erfasst werden. Ein Prototyp des
Arrays ist bereits in der Lage, Aflatoxine, Deoxynivalenol (DON), Fumonisin, T-2 Toxin und Zearalenon im jeweils relevanten Konzentrationsbereich (1 –
1000 µg/kg) quantitativ zu detektieren. „Plantibodies“ gegen diverse Mykotoxine mit Bindungseigenschaften, die denen von Antikörpern ähnlich sind,
werden in einem zweiten Projekt aus einer Phagenbank heraus entwickelt. Diese rekombinanten Antikörperfragmente können später in transgenen
Pflanzen produziert werden. So steht eine Möglichkeit zur preiswerten Herstellung von Antikörperfragmenten zur Verfügung, bei denen auf jegliche Immunisierung
und Einsatz von Tieren zur Antikörperproduktion verzichtet werden kann.
Einleitung
Aflatoxin-belastete Pistazien, Ochratoxin
A in Rosinen, Deoxynivalenol
(DON) in Weizenmehl sind nur drei
Beispiele, bei denen Mykotoxin-Belastungen
während der letzten Monate
im Fokus der Gesundheitsbehörden
waren. Neben pathogenen Keimen
und Tierarzneimittelrückständen,
wie Hormonen und Antibiotika,
zählen toxische Schimmelpilzmetabolite
zu den gesundheitsschädlichsten
Verunreinigungen in Lebensmitteln
[1].
So hat das Bundesinstitut für gesundheitlichen
Verbraucherschutz
und Veterinärmedizin (BgVV) beispielsweise
schon am 06.07.2000 in
einer Pressemitteilung darauf hingewiesen,
dass Kleinkindernahrung mit
Fusarientoxinen hoch belastet sein
kann. Das BgVV forderte deshalb die
Hersteller auf, die Rohwaren beim
Wareneingang besser zu kontrollieren
und die Gehalte deutlich zu reduzieren.
Zu den wichtigsten Fusarientoxinen
zählen hauptsächlich De-
oxynivalenol (DON), das häufig in
Weizen und Roggen vorkommt, und
Fumonisine, die fast ausschließlich
in Maispflanzen nachgewiesen wurden,
und dadurch in getreidehaltige
Kleinkindernahrung (Getreidebrei,
Maisgries) gelangen können.
Mykotoxine sind niedermolekulare
(Molekulargewicht 300 - 500 Dalton)
giftige Stoffwechselprodukte bestimmter
Schimmelpilze, von denen
bis heute weit über 100 bekannt sind.
Sie sind hitzestabil und werden durch
herkömmliche Verarbeitungsprozesse
nicht abgebaut. Aufgrund ihrer
vielfältigen toxischen Wirkungen stellen
Mykotoxine eine große Gefahr für
die menschliche Gesundheit sowohl
hinsichtlich einer akuten als auch einer
chronischen Gesundheitsschädigung
dar. Hervorzuheben sind vor
allem das hohe mutagene und kanzerogene
Potenzial einiger Substanzen.
Schon in geringen Mengen sind
sie für Warmblütler toxisch und können
schwere, irreparable Schädigungen
verursachen. Eine Aufnahme von
hochbelasteten Nahrungs- bzw. Fut-
Tab. 1: Schimmelpilzgattungen und deren Mykotoxine. Angabe der gesetzlich
geregelten oder von Gesundheitsbehörden empfohlenen Höchstmengen
für Lebensmittel und der international empfohlenen Richtwerte für
Futtermittel.
Schimmelpilz- Mykotoxin Höchstmenge für Richtwerte für
gattung Lebensmittel Futtermittel
Aspergillus Aflatoxin 4 µg/kg 20 µg/kg
Penicillium Ochratoxin A 3 µg/kg 20 µg/kg
Fusarium Deoxynivalenol 0,5 mg/kg 1 mg/kg
T-2 Toxin keine Empfehlung 0,5 mg/kg
Fumonisin 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Zearalenon 50 µg/kg 0,5 mg/kg
termitteln in der Tierhaltung kann im
Extremfall sogar zum Tod führen.
Eine besonders hohe Toxizität weist
Aflatoxin B1 auf; sowohl hinsichtlich
seiner akuten Toxizität (der 50%
Wert der letalen Dosis lag im Tierexperiment
bei ca. 5 mg /kg) als auch
wegen der kanzerogenen Wirkung
des Moleküls. Abbildung 1 gibt einen
Überblick über die vielfältigen gesundheitsschädigenden
Wirkungen
der wichtigsten Mykotoxine.
Hinsichtlich ihrer Entstehung wird
unterschieden zwischen Mykotoxinen,
die bereits vor der Ernte auf Getreide
gebildet werden (Mykotoxine
von „Feldpilzen“ wie Fusarium) und
denen, die nach der Ernte aufgrund
unsachgemäßer Lagerung im Erntegut
entstehen (Mykotoxine von “Lagerpilzen”
wie Aspergillus oder Pe-
nicillium). Die wichtigsten Vertreter
der Mykotoxine sind in Tabelle 1
zusammengefasst.
Gesetzliche Regelungen
In der Europäischen Union sind für
einzelne Mykotoxine bereits seit län-
Abb. 1: Gesundheitsschädigende Wirkung von Mykotoxinen am Beispiel
eines Nutztiers.
gerem Höchstmengen. In der Verordnung
(EG) Nr. 466/2001 vom
08. März 2001 zur Festsetzung der
zulässigen Höchstgehalte an Kontaminanten
in Lebensmitteln (Kontaminantenverordnung)
gilt für Aflatoxin
B1 eine Höchstmenge von 2 µg/kg,
für die Summe von Aflatoxin B1, B2,
G1 und G2 beträgt die Höchstmenge
4 µg/kg. Dies gilt für Erdnüsse, Schalenfrüchte,
getrocknete Früchte und
Getreide, die zum direkten Verzehr
bestimmt sind. Für Milch und

74 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 2: Molekülstrukturen von Aflatoxin B1, Deoxynivalenol (DON), Fumonisin
B1, Ochratoxin A, T-2 Toxin und Zearalenon.
Milcherzeugnisse gilt ein noch strengerer
Grenzwert: Hier darf ein Gehalt
von 0,05 µg Aflatoxin M1/kg nicht
überschritten werden. Aflatoxin M1
entsteht bei Wiederkäuern nach Verzehr
von Aflatoxin B1-haltigem Futtermittel,
und ist unter anderem in der
in Vorbereitung, in der neben Aflatoxinen
und Ochratoxin A auch Höchstgehalte
für Deoxynivalenol, Fumonisine
und Zearalenon in Lebensmitteln
festgelegt werden sollen [2].
Für Futtermittel sind die erlaubten
Höchstmengen von Aflatoxinen in der
Abb. 3: Mykotoxinanalytik am Beispiel Aflatoxin. ELISAs erlauben preiswerte
und schnelle Analysen zum Screenen von Aflatoxin-belasteten Proben
(Abbildung rechts unten), Positiv gemessene Proben werden in der
Regel nach einer Aufreinigung über Immunaffinitätschromatographie mittels
HPLC oder GC-Analyse bestätigt (Abbildung links unten).
Milch der Tiere nachzuweisen. In der
von Deutschland umgesetzten Mykotoxin-Höchstmengenverordnung
(MHmV) vom 02. Juni 1999 sind die
gleichen Gehalte an Höchstmengen für
alle anderen Lebensmittel geregelt.
Die Höchstmengen für Ochratoxin A
sind unlängst in der EU-Verordnung
472/2002 vom 12. März 2002 für
Getreide mit 5 µg/kg (Rohware) und
3 µg/kg (zum menschlichen Verzehr
bestimmte Backwaren) festgelegt worden,
während bei getrockneten Trauben
die erlaubte Ochratoxin A Belastung
auf 10 µg/kg limitiert wurde.
Grenzwerte für andere Mykotoxine
werden derzeit in den entsprechenden
Gremien der EU-Kommission beraten;
in Deutschland ist eine Neufassung der
Mykotoxin-Höchstmengenverordnung
Futtermittelverordnung geregelt.
In Abhängigkeit von der Art des Futtermittels
und der Tiere liegen die
Höchstgehalte bei 5 bis 100 µg/kg.
Das Bundesministerium für Landwirtschaft
(BML) hat „Orientierungswerte
für Konzentrationen von Deoxynivalenol
und Zearalenon im Futter
von Schwein, Rind und Huhn“
(mg/kg Futter; bei 88 % Trockensubstanz),
bei deren Unterschreitung die
Gesundheit und Leistungsfähigkeit
nicht beeinträchtigt wird, veröffentlicht.
Diese liegen für Deoxynivalenol
zwischen 1,0 und 5,0 mg/kg, für
Zearalenon zwischen 0,05 und 0,5
mg/kg.
International haben sich im Futtermittelbereich
Höchst- und Richtwerte
etabliert, die vor allem in den
USA, Kanada, Lateinamerika und
Asien gelten. Tabelle1 gibt einen
Überblick über die für Lebensmittel
geltenden verbindlichen bzw. empfohlenen
Höchstwerte sowie über die
Richtwerte für den Futtermittelbereich.
Eine enge Überwachung der Mykotoxin-Belastung
unserer Lebensund
Futtermittel wird von allen verantwortlichen
Stellen gefordert und
stellt eine wichtige Aufgabe des vorbeugenden
Verbraucherschutzes dar.
Nachweismethoden für
Mykotoxine
Als Nachweisverfahren für Mykotoxine
stehen eine Reihe von physikalisch-chemischen
Methoden wie
Dünnschichtchromatographie (TLC
oder HPTLC), Hochleistungsfüssigkeitschromatographie
(HPLC) und
Gaschromatographie gekoppelt mit
Massenspektrometrie (GC-MS) zur
Verfügung, die zum Teil schon seit
längerem als Referenzmethoden etabliert
sind [3,4,5]. Diese Methoden
weisen in aller Regel eine hohe Emp-
findlichkeit mit niedrigen Nachweisgrenzen,
bei gleichzeitig hoher Reproduzierbarkeit
der Messmethode
für die einzelnen Mykotoxine bzw.
Mykotoxinfamilien auf. Andererseits
beinhalten die chromatographischen
Methoden einen hohen Investitionsbedarf
für die Geräte und einen großen
Zeitbedarf für die einzelnen Messungen.
Darüber hinaus stellen die
chromatographischen Methoden
hohe Anforderungen an die Ausbildung
des Laborpersonals.
Neben den klassischen Methoden
sind für den Nachweis der wichtigsten
Mykotoxine auf der Basis von
spezifischen Antikörpern immunologische
Testverfahren entwickelt worden,
die heute kommerziell erhältlich
sind [6,7]. Außerdem wurden
auf der Basis von monoklonalen Antikörpern
Immunadsorbentien (Immunoaffinitätssäulen,
IAC) zur Isolierung
von Mykotoxinen aus komplexen
Lebensmitteln hergestellt, die
ebenfalls kommerziell erhältlich
sind. Solche IAC werden vorzugsweise
vor chromatographischen Analysenverfahren
zur Beseitigung von
Abb. 4: Schema eines kompetitiven Enzymimmun Assays. Grundlage eines
immunologischen Tests ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die üblicherweise
in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte stattfindet. Die Vertiefungen
der Mikrotiterplattenstreifen sind mit einem Mykotoxin-spezifischen Antikörper
beschichtet. Zugegeben werden Standards bzw. Probelösung und
enzymmarkiertes Mykotoxin (Enzymkonjugat). Freies und enzymmarkiertes
Mykotoxin konkurrieren um die Antikörperbindungsstellen (kompetitiver
Enzymimmunoassay). Nicht gebundenes enzymmarkiertes Mykotoxin
wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Hinzugegeben
wird Chromogen/Substrat (Tetramethylbenzidin (TMB)/Wasserstoffperoxid),
wobei infolge der Reaktion des gebundenen Enzymkonjugats das
farblose Chromogen in ein blaues Endprodukt umgewandelt wird. Die
Zugabe von verdünnter Schwefelsäure als Stopp-Reagenz beendet den
enzymatischen Prozess und führt zu einem Farbumschlag von blau nach
gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion der
Lösung ist umgekehrt proportional zur Mykotoxin-Konzentration der Probe.
Anhand einer Standardkurve kann graphisch manuell oder mit Hilfe
einer entsprechenden Software die Mykotoxin-Belastung einer Probe in
einfacher Weise ermittelt werden.

Matrixeffekten eingesetzt, die ansonsten
eine korrekte Bestimmung
enorm erschweren oder ganz verhindern
würden.
Die immunologischen Tests zeichnen
sich durch eine einfache Handhabung
in der Testdurchführung und
Auswertung aus, und sind vor allem
geeignet für die Bearbeitung von großen
Probenzahlen. Im ELISA positiv
gemessene Proben werden üblicherweise
durch eine Referenzmethode
wie beispielsweise HPLC bestätigt (s.
Schema Mykotoxinanalytik, Abb. 3).
Grundlage eines immunologischen
Tests ist die Antigen-Antikörper-Reaktion,
die üblicherweise an
einer Festphase, wie beispielsweise
in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte,
durchgeführt wird. Ein Mykotoxin-spezifischer
Antikörper ist adsorptiv
an die Oberfläche einer Mikrotiterplatte
gebunden. Mykotoxin
aus der Probe und Enzym-markiertes
Mykotoxin konkurrieren um die
Antikörper-Bindung. Man spricht
vom sogenannten kompetitiven Enzyme
Linked Immunosorbent Assay
(kompetitiver ELISA). Überschüssige,
nicht gebundene Reagenzien werden
in einem Waschschritt entfernt.
Chromogen wird hinzugegeben und
vom gebundenen Enzym Konjugat in
ein gefärbtes Produkt umgewandelt.
Die Messung erfolgt photometrisch
im Anschluß an die enzymatische Reaktion.
Mykotoxingehalte von unbekannten
Proben werden anhand einer
Standardkurve ermittelt (Abb.
4).
Alternativ lässt sich der ELISA
durch Kombination eines zusätzlichen
Farbstoffs und einer neutralen
Stopplösung visuell (ohne Photometer)
auswerten. Damit steht ein Test
zur Verfügung, der ohne apparativen
Aufwand und von nicht geschultem
Personal durchgeführt werden kann
(Abb. 5).
Im Rahmen der von der DBU geförderten
Projekte (13053/21 und
13059) werden zwei Ansätze der
Weiterentwicklung von immunologischen
Tests verfolgt.
Mykotoxin Antikörper
Array
Auf der Basis von monoklonalen Antikörpern
gegen sechs der wichtigsten
Mykotoxine sollen in einem Test
gleichzeitig die Mykotoxine Aflatoxin,
DON, Fumonisin, Ochratoxin A, T-2
Toxin und Zearalenon in einer Lebensmittel-
bzw. Futtermittelprobe
im relevanten Konzentrationsbereich
detektiert werden. Hierbei wird der
Abb. 5: Beispiel einer visuellen Auswertung eines RIDASCREEN®FAST
Aflatoxin Tests. Teststreifen einer Mikrotiterplatte, von links nach rechts:
Standard 1 (0 µg/kg), Standard 2 (1,7 µg/kg), Standard 3 (5 µg/kg), Standard
4 (15 µg/kg), Standard 5 (45 µg/kg), Probe 1 (ca . 21 µg/kg), Probe 2
(ca. 60 µg/kg), Probe 3 (unbelastete Probe).
Schwerpunkt der Arbeiten auf eine
möglichst einheitliche und einfache
Probenaufarbeitung und eine kurze
Gesamtanalysenzeit gelegt.
Der innovative Ansatz des Tests ist
die simultane Erfassung von sechs
Mykotoxinen im gleichen Testformat.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
75
tion zwischen Antikörper und Analyt.
Mykotoxin einer Probe konkurriert
mit enzymmarkiertem Mykotoxin
um die Bindungsstelle am spezifischen
Antikörper. Die einzelnen enzymmarkierten
Mykotoxine liegen in
einem an die Versuchsführung zu
tikörper auf der Mikrotiterplatte gebundene
Enzymaktivität, die visuell
oder photometrisch gemessen wird.
Da es sich um eine kompetitive Reaktion
handelt, ist das Messsignal
umgekehrt proportional zur Analytkonzentration.
Im Rahmen des Projekts wurden
in Vergleichsuntersuchungen aus verschiedenen
monoklonalen Antikörpern
und Peroxidase-Konjugaten, die
zur Verfügung standen, für die Mykotoxin
Array Entwicklung geeignete
Reagenzien ausgewählt und durch
Titration passende Kombinationen
von Antikörperbeschichtung und Enzymkonjugat
im Detektionsgemisch
ermittelt.
Abbildung 7 zeigt exemplarisch
Standardkurven für drei der in den
Array implementierten Mykotoxin-
Nachweisverfahren, wobei ein Ge-
Abb. 6: Schematische Darstellung eines Mykotoxin Arrays. Die einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörper
sind in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte nebeneinander angeordnet, während die Mykotoxin-Enzymkonjugate
im Gemisch und freies, in den Proben enthaltenes Mykotoxin um die Bindungsplätze der Antikörper konkurrieren.
Im dargestellten Beispiel würde für den Ochratoxin A- und den Fumonisin-Nachweis ein positives Ergebnis erhalten
werden.
Dies erlaubt die umfassende Beurteilung
einer Probe hinsichtlich der Belastung
mit den wichtigsten Mykotoxinen
in einem Schritt, während mit
herkömmlichen immunologischen
Testverfahren jeweils immer nur ein
Parameter erfasst werden kann. Ein
Schema des Mykotoxin Antikörper
Array ist in Abbildung 6 dargestellt.
Die Oberfläche der Mikrotiterplatte
stellt die feste Phase dar, auf der
die so genannte Reaktion zwischen
Antikörper und Analyt statt findet. Die
Vertiefungen der Mikrotiterplatte
sind einzeln und in Reihe angeordnet
(Array-Format) und mit den jeweils
spezifischen Antikörpern direkt
beschichtet. Das Testprinzip beruht
auf der bereits beschriebenen Reak-
optimierenden Gemisch vor („Universaldetektor“).
Der Mykotoxingehalt
einer Probe wird schließlich
durch Vergleich mit der Immunreaktion
bei Einsatz eines entsprechenden
Standards ermittelt. Als Maß
dient die über den spezifischen An-
misch der entsprechenden enzymmarkierten
Mykotoxine eingesetzt
wurde. Die Inkubationszeit für den
Kompetitionsschritt (Standard + Enzymkonjugat)
betrug 30 min. Mit diesen
Untersuchungen konnte gezeigt
werden, dass unter optimierten Ar-
Tab. 2: Mykotoxin Array: Untersuchungen mit einem Prototyp des Mykotoxin
Arrays mit 5 verschiedenen Mykotoxinen (vgl. Abbildung 7). Zusammenstellung
der 50% Dosis und der Messbereiche unter Berücksichtigung
der Probenvorbereitung.
Mykotoxin monoklonaler Antikörper 50 % Dosis Messbereich
Aflatoxin 3E2 5 ppb 1 - 50 ppb
DON 1H8 0,4 ppm 0,1 - 3 ppm
Fumonisin IC9 0,2 ppm 0,1 - 1 ppm
T-2 Toxin 2E3 8 ppb 2 - 20 ppb
Zearalenon P8 40 ppb 10 - 100 ppb

76 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
ray-Bedingungen störende Wechselwirkungen
zwischen den Enzymkonjugaten
nicht auftreten und somit ein
spezifischer und sensitiver Nachweis
der Einzeltoxine möglich ist.
Tabelle 2 zeigt in einer Übersicht
die 50 % Dosis-Werte der Standardkurven
von fünf Mykotoxinen (Werte
der in Abb. 7 dargestellten Standardkurven
und von zwei weiteren Mykotoxinen)
sowie die korrespondierenden
Messbereiche. Die Messbereiche
berücksichtigen bereits die Probenvorbereitung
mit einem Verdünnungsfaktor
von 10. Die Standardkurve
für Aflatoxin weist hierbei die niedrigste
Nachweisgrenze mit etwa 1 µg/
kg auf. Die kalkulierten Messbereiche
für die dargestellten Mykotoxine
befinden sich in den relevanten Konzentrationsbereichen,
die durch EU
Regulierungen bzw. Richtlinien festgelegt
sind. Für Ochratoxin A liegt
derzeit keine geeignete Kombination
von Antikörper und Enzymkonjugat
vor. Die Detektion dieses Mykotoxins
konnte deshalb noch nicht in den
Prototyp des Mykotoxin Arrays integriert
werden.
In den weiteren Arbeiten ist die Untersuchung
von realen Poben (Nullproben
und natürlich belasteten Proben)
und Vergleich der Ergebnisse
mit konventioneller Analytik wie
HPLC und GC-MS vorgesehen. Für
diese Untersuchungen stehen bereits
eine ganze Reihe von Proben zur Verfügung,
wobei erste Tests mit dem
Mykotoxin Array eine gute Übereinstimmung
mit den Vergleichsdaten ergaben.
Desweiteren wird an einer
Verkürzung der Gesamtanalysezeit
gearbeitet.
Plantibodies gegen
Mykotoxine
Das zweite hier vorgestellte Projekt
verfolgt die Etablierung eines alternativen,
spezifisch bindenden rekombinanten
Antikörperfragments,
das in der Lage ist den durch Immunisierung
in diversen Tierspezies erzeugten
(polyklonalen) Antikörper
oder monoklonalen Antiköper durch
eine sehr viel kostengünstigere Variante
zu ersetzen.
Rekombinante Antikörper stellen
eine Alternative zu den klassischen
poly- und monoklonalen Antikörpern
dar. Bei der Herstellung von rekombinanten
Antikörpern werden
die Antikörpergene aus einer RNA
Population heraus isoliert und subkloniert.
Oft wird dabei das Molekül
auf die variablen Teile reduziert,
welche durch einen synthetischen
Abb. 7: Standardkurven von Aflatoxin B1, Zearalenon und Deoxynivalenol
im Mykotoxin Array Test mit einer Mischung der Enzymkonjugate. Inkubationsfolge:
Standard + Enzymkonjugat: 30 Minuten, Chromogen/Substrat:
15 Minuten.
Linker verbunden werden („single
chain variable Fragments“ = scFv).
Alternativ können entsprechende
Fragmente auch aus synthetischen
Banken selektiert werden, die bis zu
10 13 unabhängige scFv-Klone enthalten.
Aus diesen Banken wird der gewünschte
Antikörper in einem Verfahren
selektioniert, welches „Panning“
genannt wird. Ist ein Antikörperfragment
gefunden, wird dieses
in Bakterien produziert (Abb. 8). Da
bei diesem Verfahren nicht mit lebenden
Tieren gearbeitet wird, können
auch Antikörperfragmente gegen
hochgradig toxische Stoffe isoliert
werden. Solche rekombinanten
Antikörper besitzen gleiche Affinitäten
zu ihren Antigenen wie ein vollständiger
Antikörper, weisen aber
nur ein Fünftel seiner Größe auf.
Allerdings haben bakteriell produzierte
scFvs auch einige Nachteile:
Sie sind nicht glykosyliert und
können nur in relativ geringen Mengen
produziert werden.
Eine Weiterentwicklung der rekombinantenAntikörper-Technologie
stellt der Transfer solcher Genfragmente
in Pflanzen dar. In diesen
transgenen Pflanzen kann das scFv-
Fragment bis zu 6% des Gesamtproteins
darstellen. Solche Proteine werden
als „Plantibodies“ bezeichnet
Abb. 8: Panning von scFvs. Für die Selektion von scFvs werden Phagen
verwendet, die jeweils die variablen Teile von Antikörpergenen als Fusionsprotein
mit einem Hüllprotein enthalten. Auf diese Weise enthält der
Phage zum Genotyp auch den passenden Phänotyp, den auf der Phagenoberfläche
exponierten scFv („Phage Display“). Für die Selektion wird das
Antigen an eine Matrix gekoppelt und die Phagenbank aus ca. 10 8 verschiedenen
scFv-Phagen aufgegeben. Nur Phagen, die über den scFv an
das Antigen gebunden sind, werden anschließend eluiert und in einer weiteren
Selektionsrunde („Panning“) eingesetzt. Nach drei bis vier Runden
sind entsprechende Phagen angereichert.
und weisen gegenüber anderen Systemen
viele Vorteile auf:
– Im Vergleich zu anderen Produktionssystemen
können Plantibodies
sehr billig und in großen Mengen hergestellt
werden.
– Es besteht kein Infektionsrisiko für
den Menschen.
– Funktional korrekt gefaltete und
glycosylierte Antikörpermoleküle.
Die Technologie der „Plantibody“-
Herstellung ist noch relativ neu und
erfordert gerade in der Anfangsphase
sehr viel Zeit. Neben mikrobiologischen
und molekularbiologischen
Methoden wird auch die Technologie
der Transformation und Regeneration
von Pflanzen benötigt. Gängige
in der Molekularbiologie eingesetzte
Pflanzen, wie Tabak oder Arabidopsis,
sind zwar für den Labormaßstab
nutzbar, aber wenig für die
Produktion größerer Mengen an rekombinanten
Proteinen geeignet.
Folgende Arbeitsschritte sind notwendig,
um aus einer vorhandenen
Phagen-Antikörper Bank einen gewünschten
Antikörper zu selektieren
und in Pflanzen zu exprimieren:
1. Kopplung eines geeigneten Antigens
an eine Matrix.
2. Herstellen oder Einsatz einer fertigen
scFv-Phage Display Library in einem
Selektionsverfahren (sog. „Panning“,
dieses wird in der Regel 3-5
mal durchlaufen).
3. Expression der selektierten Antikörpergene
in einem geeigneten Bakterienstamm.
4. Analyse der Antikörper-Antigen-
Bindung.
5. Subklonierung in einem binären
Vektor.
6. Transformation von Agrobacterium
tumefaciens.
7. Transformation von Pflanzen (Tabak,
Erbse).
8. Selektion und Regeneration der
Pflanzen.
9. Analyse der transgene Pflanzen auf
scFv-Expression.
10. Kreuzen der Pflanzen, um stabil
exprimierende Linien zu erhalten.
11. Analyse der Expression in der stabilen
Linie.
Aufreinigung des scFv aus
der Pflanze
Es ist offensichtlich, dass der initiale
Aufwand viel größer ist als bei der
Herstellung von monoklonalen Antikörpern.
Alleine die Generationszeit
der zu regenerierenden Pflanzen kann
ein Jahr betragen. Andererseits stellen
„Plantibodies“, wenn sie erst einmal
in einer Pflanze produziert wer-

den, eine sehr preiswerte und effiziente
Produktionsmethode für Antikörper
dar [8]. In diesen transgenen
Pflanzen kann das scFv-Fragment bis
zu 6% des Gesamtproteins darstellen,
was bei proteinreichen Pflanzen wie
Erbsen eine Produktionsrate von 50
kg/Hektar ermöglicht [9]. Die hohen
Erträge bei Erbsen ermöglichen eine
Produktion der scFvs im Gewächshaus.
Daher ist eine in der Öffentlichkeit
stark diskutierte Freisetzung
transgener Pflanzen überhaupt nicht
notwendig. In wenigen S-1 Gewächshäusern
kann der Jahresbedarf an den
entsprechenden „Plantibodies“ ohne
Risiko der Freisetzung transgenen
Materials produziert werden. Nebenbei
ergibt sich durch die Anzucht in
geschlossenen Gewächshäusern ein
Investitionsschutz des Produzenten.
Im Rahmen des DBU-geförderten
Projekts werden rekombinante Antikörper
gegen folgende Mykotoxine
hergestellt:
– Ochratxin A.
– Fumonisin B1, welches eine wichtige
Bedeutung in der Lebensmittelproduktion
hat.
– Nivalenol, wogegen es bisher keine
Antikörper gibt.
– Aflatoxine, hier liegt der Focus auf
der Produktion eines scFv/ „Plantibodies“,
der mehrere Mitglieder der
Gruppe der Aflatoxine gleichzeitig erkennt.
Auf diese Weise wird nur noch
ein einziger Antikörper benötigt, um
eine ganze Stoffklasse zu detektieren.
Ein ähnliches Konzept wurde von uns
bereits zur Detektion pflanzlicher Potyviren
(einer Virengruppe mit über
300 Mitgliedern) erfolgreich angewandt
[10].
Abb.10: Bakteriell produzierte
scFvs sind relativ
instabil und können nicht in
großen Mengen produziert
werden. Daher werden die
Gene in einem binären Vektor
subkloniert um damit
Agrobacterium tumefaciens
zu transformieren. Dieses
Bakterium ist in der
Lage, einen Teil der auf
dem Vektor liegenden Gene
in Pflanzenzellen (hier Erbsen-Embryonen)
zu transferieren.
Die Pflanzenstükke
werden auf einem Selektionsmedium
wieder zu
vollständigen Pflanzen regeneriert,
die das scFv in
großen Mengen produzieren.
Abb. 9: Selektion von scFv-Phagen gegen Fumonisin B1. Die Elution der
Phagen von der mit Fumonisin B1 gekoppelten Matrix erfolgte spezifisch
mit Fumonisin B1. Nach der vierten Panningrunde wurden die scFvs der
erhaltenen Phagen sequenziert und analysiert.
Antikörper gegen die ersten beiden
Mykotoxine erlauben es, diese
Technologie mit bereits etabierten
Techniken zu vergleichen, denn es
sind auch monoklonale Antikörper
sowie kommerzielle Testsysteme gegen
Ochratoxin A und Fumonisin B1
erhältlich. Gegen beide Mykotoxine
wurden bereits scFvs isoliert und in
E. coli exprimiert (Abb. 9). Die Bindungsaffinität
dieser scFvs wird mittels
Oberflächen-Plasmon-Resonanz
Analyse (Biacore) untersucht. Parallel
dazu werden die scFvs in einen
eigens konstruierten binären Vektor
subkloniert. Dieser ist für die Expression
von scFvs in Tabak und Erbse
hin optimiert. Es werden zunächst
transgene Tabakpflanzen hergestellt,
die als „Proof of Principle“ dienen
sollen. Die Transformation von Erbse,
in der viel größere Proteinmengen
produziert werden können,
schließt sich wegen des deutlich höheren
Aufwands bei der Transforma-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
77
tion und Regeneration dieser Pflanze
später an.
Literatur
[1] Otteneder, H., Majerus, P., Deutsche
Lebensmittelrundschau 97 (2001),
334-338.
[2] Rosner, H., Mycotoxin Research 18A
(2002), 1-5.
[3] Walker, F., Meier; B., Journal of AOAC
International 81 (1998), 741-748.
[4] Krska; R., Nachr. Chem. Tech. Lab. 47
(1999), 553-556.
[5] Scott, P., J. Assoc. Off. Anal. Chem.
65 (1982), 876-883.
[6] Usleber, E., Märtlbauer, E., Dietrich,
R, Terplan, G, J. Agric. Food Chem.
39 (1991), 2091-2095.
[7] Dietrich, R., Schneider, E., Usleber, E.,
Märtlbauer, E., Natural Toxins 3
(1995), 288-293.
[8] Daniell, H., Streatfield, S.J., Wycoff,
K., Trends in Plant Sciences 6:
(2001), 219-226.
[9] Jacobsen (ed.), 2001 Entwicklungskonzept
zur BMBF-Förderaktivität
„BioProfile“; (Hannover).
[10] Hust, M., Maiss, E., Jacobsen, H.J.,
Reinard, T., J, Virol Methods 106
(2002), 225.
Abkürzungen
BGVV: Bundesinstitut für gesundheitlichen
Verbraucherschutz und
Veterinärmedizin (heute BVL:
Bundesamt für Verbraucherschutz
und Lebensmittelsicherheit
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (immunologischer
Test)
DON: Deoxynivalenol (Mykotoxin
aus Fusarium Schimmelpilzen)
scFv: single chain variable Fragment
(rekombinantes Antikörperfragment)
IAC: Immunaffinitätssäulen (Englisch:
immunoaffinity column)
HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(Englisch: High
Performance Liquid Chromatography)
ppb: parts per billion (µg/kg)
ppm: parts per million (mg/kg)
Korrespondenzadresse
Dr. Bernhard Reck
R-Biopharm AG
Landwehrstr. 54
D-64293 Darmstadt
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eMail: b.reck@r-biopharm.de

78 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
BULDING BLOCKS
Biokatalytische Synthese
enantiomerenreiner
Building Blocks
� Dr. Markus Kähler1 , Dr. André Rieks1 , Dr. Ulrike Kirchner1 , Kerstin Wiggenhorn1 , Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer2 , Marlen Schmidt2 , Angelika Eisner2 ,
Dr. Wolfgang Petersen3 , Frauke Ellerbrock3 , Stefan Bollow3 1 2 3 Dr. Rieks GmbH, Uetersen, Institut für Chemie und Biochemie, Abt. Technische Chemie und Biotechnologie, Universität Greifswald, UNA-Synth
GmbH, Uetersen
Die Herstellung enantiomerenreiner Verbindungen ist eine der großen Herausforderungen der biokatalytischen Synthese. Enantiomerenreine Alkohole
bergen hinsichtlich ihrer Verwendung als Synthesevorstufen hochwertiger Pharmazeutika ein immenses Potenzial.
Die im Rahmen des Vorhabens zu synthetisierenden sekundären Alkohole, insbesondere 1-Methoxy-2-propanol, 3-Butin-2-ol und 3-Hydroxytetrahydrofuran,
stellen als Synthesevorstufen zahlreicher Wirkstoffe Schlüsselsubstanzen dar. Einer biotechnologischen Produktion dieser so genannten „Building
Blocks“ steht allerdings entgegen, dass verfügbare Esterasen oder Lipasen nur moderate Spezifität und Enantioselektivität gegenüber diesen Verbindungen
aufweisen.
Ziel des Vorhabens ist daher, das Potenzial von Esterasen mithilfe der gerichteten Evolution hinsichtlich verfahrensrelevanter Parameter, insbesondere
Enantioselektivität, Substratspezifität und Kälteaktivität, zu optimieren und somit die biotechnologische Produktion enantiomerenreiner Building Blocks
zu ermöglichen. Anhand des 1-Methoxy-2-propanols wird dargestellt, wie durch eine optimierte Prozessführung enantiomerenreine Alkohole mit hoher
Reinheit und Ausbeute umweltgerecht produziert werden können. Erste vorliegende ökologische Prozessdaten werden ebenfalls präsentiert.
Keywords: Enantioselektivität, Esterase, Kälteaktivität, Building Blocks.
Einleitung
Biokatalytische
Bereitstellung
enantiomerenreiner
Building-Blocks
Die Herstellung enantiomerenreiner
Verbindungen ist eine der großen
Herausforderungen der organischen
Synthese, vornehmlich für die Entwicklung
und Produktion pharmazeutisch
relevanter Building Blocks. Von
vielen racemischen Wirkstoffen ist
bekannt, dass jeweils nur eines der
beiden Enantiomere wirksam, das
andere jedoch inaktiv ist oder Nebenwirkungen
hervorruft. Beispielsweise
interagiert ausschließlich das jeweilige
(S)-Enantiomer der Entzündungshemmer
Ketoprofen und Ibuprofen
mit dem für die Krankheitssymptome
verantwortlichen Enzym Cyclooxygenase.
Traurige Popularität erlangte in
den 60er Jahren das teratogen wirkende
(S)-Enantiomer des unter dem
Handelsnamen Contergan ® vertriebenen
Schlafmittels Thalidomid.
Reine Enantiomere lassen sich entweder
direkt durch stereoselektive
Synthese oder indirekt über die Aufreinigung
von Racematen darstellen.
Im letzteren Fall entstehen in der Regel
allerdings 50 Prozent Abfall in
Form der nichtgewünschten Stereoisomere,
sofern nicht alternative Verwendungsmöglichkeiten
für diese bestehen.
Daher ist es sinnvoll, die so
genannte Chiralitätsinformation bereits
frühzeitig in das zu synthetisierende
Molekül einzufügen, um nachfolgend
die restliche Struktur sukzessive
über adäquate organische Synthesen
aufzubauen.
Für die Synthese von Feinchemikalien
wurden Biokatalysen im Laufe der
letzten Jahre eine zunehmend attraktive
Alternative gegenüber konventionellen
chemischen Methoden. Bereits
heute werden eine Reihe wichtiger
Wirkstoffvorstufen, u. a. D-Hydroxyphenylglycin
oder (R)-Phenylglycidat
ökonomisch effizient in Biokatalyseverfahren
synthetisiert.
Eine konsequente Ausweitung des
Einsatzes von Enzymen in nachhaltig
umweltgerechten und ökonomisch
effizienten Verfahren kann das Wertschöpfungspotenzial
von Biokatalysatoren
auch in der Wirkstoffsynthese
weiter ansteigen lassen.
Enantioselektive Biokatalyse:
Lipasen und Esterasen
Insbesondere Lipasen und Esterasen
bieten sich auf Grund ihres Substratspektrums
für einen Einsatz in Bio-
katalysen an [1]. Wichtige pharmazeutische
Synthesebausteine wie beispielsweise
Alkohole, Amine, Carbonsäuren
oder Ester lassen sich mit Hilfe
von Lipasen oder Esterasen darstellen
[2].
Bisher erfolgte eine industrielle
Verwirklichung der zahlreich publizierten
Esterase- oder Lipase-Reaktionen
jedoch nur im begrenzten
Maß. Kommerziell zugängliche oder
natürlich vorkommende Lipasen und
Este-rasen erfüllen die hohen Anforderungen,
die in einem biokatalytischen
Prozess an sie gestellt werden,
meist nur unzureichend. Als Hinderungsgründe
hierfür sind die nicht
optimalen Temperaturgrenzen für die
katalytische Aktivität, die engen Substratspezifitäten
oder die für unnatürliche
Substrate niedrigen Enantioselektivitäten
der Enzyme verantwortlich.
Temperaturabhängigkeit
der Stereoselektivität
Biokatalysen mit Hilfe kälteaktiver
Enzyme bergen hinsichtlich der Überwindung
genannter verfahrenstechnischer
Schranken ein hohes Problemlösungspotenzial.
Aufgrund ihrer hohen
Flexibilität können kälteaktive
Enzyme ein breites Spektrum natür-
lich vorkommender und anthropogener
Substrate umsetzen. Ein weiterer
Vorteil ist die Eigenschaft kälteaktiver
Enzyme, auch in Gegenwart geringer
Wassermengen hohe katalytische
Aktivitäten zu zeigen. Von herausragender
Relevanz ist die Tatsache,
dass Enzyme bei tieferen Temperaturen
Substrate in der Regel mit
einer deutlich höheren Enantioselektivität
umsetzen. Die diesem aus Sicht
der industriellen Anwendbarkeit interessanten
Phänomen zugrundeliegenden
molekularen Prinzipien wurden
von Rieks et al. am Beispiel des
hydrolytischen Enzyms Penicillinamidase
detailliert diskutiert [3].
Biokatalytische Verfahren bei
Temperaturen unterhalb von 30°C
führen letztendlich mit hoher Ausbeute
zu sauberen, enantiomerenreinen
Wirkstoffen.
Zielsetzung
Ziel des Projekts ist die Integration
evolutiv verbesserter Esterasen in
biotechnologische Verfahren zur Herstellung
enantiomerenreiner sekundärer
Alkohole.
Die im Rahmen des Vorhabens zu
synthetisierenden sekundären Alkohole
(Abb. 1), insbesondere 1-Me-

thoxy-2-propanol (3a), 3-Butin-2-ol
(2a) und 3-Hydroxytetrahydrofuran
(1a) bergen hinsichtlich ihrer vielfältigen
Verwendung als Synthesevorstufen
enantiomerenreiner Pharmazeutika
ein immenses Potenzial.
Zahlreiche Medikamente können
effizient und umweltschonend aus
den genannten Schlüsselverbindungen
synthetisiert werden. Enantiomerenreines
3-Butin-2-ol stellt beispielsweise
die Vorstufe für Thromboseund
Arteriosklerosemedikamente sowie
substituierte Alkinylharnstoffe,
welche als Lipoxygenasehemmer beschrieben
werden, dar. 3-Hydroxytetrahydrofuran
kann als Baustein bei
der Synthese von antiviralen Wirkstoffen,
Atemwegstherapeutika oder Asthmamitteln
verwendet werden.
Sekundäre Alkohole, deren Substituenten
sich nur geringfügig hinsichtlich
ihrer Größe unterscheiden, lassen
sich mit bekannten Lipasen oder
Esterasen nicht oder nur unbefriedigend
in optisch reiner Form herstellen.
Entsprechend der so genannten
Kazlauskas-Regel [4] werden üblicherweise
nur Verbindungen, die einen
großen (z. B. Aryl-) und mittleren
(z. B. Ethyl-) Substituenten aufweisen,
mit hinreichender Enantioselektivität
umgesetzt. Zusätzlich zu
der unbefriedigenden Enantioselektivität
sind diese sekundären Alkohole
bzw. deren Ester leicht flüchtig, was
eine Racematspaltung unter Verwendung
von Enzymen mit Aktivitätsoptima
bei 40-70°C, also dem Bereich,
in dem kommerzielle Biokatalysatoren
optimal aktiv sind, zusätzlich erschwert.
Im Rahmen des Projekts sollen
biotechnologische Verfahren zur Herstellung
enantiomerenreiner sekundärer
Alkohole zur Verwendung als
pharmazeutische Wirkstoffvorstufen
entwickelt werden. Gegenwärtig existierende
verfahrenstechnische
Schranken sollen durch den Einsatz
ausgewählter Lipasen oder evolutiv
verbesserter Esterasen sowie durch
Optimierung von Prozessabläufen
beseitigt werden.
Hierfür soll das biokatalytische Potenzial
gut charakterisierter Esterasen
durch Methoden der gerichteten Evolution
hinsichtlich verfahrensrelevanter
Parameter (Substratspezifität, Enantioselektivität,
ggf. Kälteaktivität)
optimiert werden. Zusätzlich sollen
anforderungsgerecht ausgewählte Lipasen
oder Esterasen aus psychrophilen
Mikroorganismen hinsichtlich einer
Verfahrenstauglichkeit getestet
und gegebenenfalls in den Prozess
integriert werden.
Abb. 1: Strukturen der im Rahmen des Vorhabens untersuchten Synthesebausteine.
Ergebnisse
Erzeugung enantioselektiver
Esterasen durch
gerichtete Evolution
Zur Racematspaltung von 3-Hydroxytetrahydrofuran
(1a) und 3-Butin-
2-ol (2a) wurden zunächst über 100
kommerziell erhältliche Lipasen und
Esterasen sowie mehrere rekombinante
Esterasen aus Bacillus subtilis,
Bacillus stearothermophilus
[5], Streptomyces diastatochromogenes
und Pseudomonas fluorescens
[6] auf ihre Aktivität gegenüber
den entsprechenden Acetaten getestet.
Zur Bestimmung der Aktivität
und Stereoselektivität gegenüber diesen
chiralen Alkoholen wurde ein
Hochdurchsatz-Acetat-Assay verwendet
[7]. Hierbei führt die durch Enzymkatalyse
freigesetzte Essigsäure
mittels einer gekoppelten Enzymkaskade
zur proportionalen Bildung von
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
79
NADH, welches spektrophotometrisch
quantifiziert wird. Bei Einsatz
optisch reiner Acetate in zwei Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte kann so
die Enantioselektivität abgeschätzt
werden. Es zeigte sich, dass zwar eine
ganze Reihe von Enzymen Aktivität
aufweist, die Enantioselektivität war
jedoch in allen Fällen sehr niedrig.
Diese Beobachtung war nicht unerwartet,
da bei beiden Modellverbindungen
die Substituenten am chiralen
C-Atom annähernd gleich groß
sind, was entsprechend der Kazlauskas-Regel
nur zu einer geringen Enantioselektivität
führt.
Um eine effiziente Racematspaltung
dieser wichtigen Synthesebausteine
zu erzielen, wird daher die
Strategie der gerichteten Evolution
[8-10] verfolgt (Abb. 2).
Im ersten Schritt werden hierfür
Bibliotheken der rekombinanten
Esterasen durch Error-prone PCR
Abb. 2: Schema der gerichteten Evolution und des Screenings von Esterasen.
hergestellt. Dabei werden durch Erhöhung
der Magnesiumchloridkonzentration,
Verwendung von Manganchlorid
oder Variation der Nukleotidverhältnisse
verstärkt Fehler bei
der Genamplifizierung erzeugt. Die
mutierten Gene werden dann in einen
Expressionsvektor kloniert, dieser
transformiert und die erhaltenen
Transformanten in Mikrotiterplatten
als Bibliotheken abgelegt. Bisher
wurden etwa 4000 Klone aus der ersten
Mutationsrunde, ausgehend von
Bacillus stearothermophilus Esterase
und einer p-Nitrobenzylesterase
aus Bacillus subtilis (BsubpNB)
[11], unter Verwendung des Acetat-
Assays als Hochdurchsatz-Sreening-
Methode hinsichtlich ihrer Aktivität
gegenüber den Acetaten von 3-Hydroxytetrahydrofuran
und 3-Butin-2ol
untersucht. Dabei wurden eine
ganze Reihe von Varianten mit hoher
Aktivität gegenüber den Acetaten von
3-Butin-2-ol und einige mit moderater
Aktivität bezüglich dem Acetat von
3-Hydroxytetrahydrofuran identifiziert.
Erste Verifizierungen dieser
Mutanten in präparativen Biokatalyseansätzen
ergaben, dass bereits enantioselektivere
Esterasen gefunden
wurden. Die detektierte Steigerung
der Enantioselektivität reicht noch
nicht aus, um den Anforderungen an
ein technisches Verfahren zu genügen.
Im weiteren Verlauf des Vorhabens
soll die Enantioselektivität dieser
Varianten durch weitere Mutationsrunden
und Einbeziehung von
rationalem Proteindesign basierend
auf der Struktur der BsubpNB-Esterase
gesteigert werden.
Industrielle Umsetzung
Ziel des Vorhabens ist die Entwicklung
eines universellen biotechnologischen
Verfahrens zur Synthese enantiomerenreiner
sekundärer Alkohole.
Mit Hilfe einer kommerziell erhältlichen
Lipase aus Candida antarctica
B (CALB) konnte bereits
eine Racematspaltung des Synthesebaustein
1-Methoxy-2-propanol
durchgeführt werden. Entsprechend
der Arbeit von Baumann et al. (12)
weist dieses Enzym eine hohe Enantioselektivität
für das (S)-Enantiomer
auf. Aufgrund dieses sehr frühzeitig
verfügbaren Enzym-Systems, das bei
niedrigen Temperaturen und damit
verbundener hoher Selektivität ausreichend
aktiv war, konnte für (S)-
1-Methoxy-2-propanol bereits ein
Verfahren zur biotechnologischen
Synthese enantiomerenreiner sekundärer
Alkohole erarbeitet werden.

80 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Der inzwischen erreichte technische
Stand genügt prinzipiell den Anforderungen
der Produktion von enantiomerenreinem(S)-1-Methoxy-2propanol
im Kilogramm-Maßstab.
Basierend auf dieser Entwicklung
und bei Verfügbarkeit entprechend
enantioselektiver Enzyme kann in
Kürze ebenfalls die enantiomerenreine
Herstellung der Zielsubstanzen 3-
Hydroxytetrahydrofuran und 3-Butin-2-ol
erfolgen.
Ökologische
Prozessbetrachtung
Steigender Wettbewerb und gleichzeitig
wachsende Anforderungen in
Hinsicht auf produktionsintegrierten
Umweltschutz erfordern bei der chiralen
Wirkstoffsynthese die Entwicklung
nachhaltiger Produktionsverfahren.
Beim Scale-up des im Labormaßstab
vorab entwickelten Syntheseverfahren
der genannten Zielsubstanz
wurden deshalb vorzugsweise
ökologisch relevante Prozessschritte
berücksichtigt.
Beispielsweise konnten aufgrund
einer detaillierten Stoffstromkonzeption
anfallende Prozessrückstände
reduziert werden. Diese Rückstände,
deren Inhaltsstoffe alle biologisch
sehr gut abbaubar sind, können
direkt einer kommunalen Kläranlage
zugeführt werden.
Häufig führt in Kläranlangen der
mangelnde Zulauf von organischen
C-Quellen zu einer Anreicherung
stickstoffhaltiger Verbindungen. Ursache
hierfür ist die natürliche Kopplung
von Stickstoffeliminierung und
Kohlenstoffabbau (Nitrifikation/Denitrifikation).
In dem hier beschriebenen
Verfahren zur Synthese von
(S)-1-Methoxy-2-propanol konnte
der bislang als Reaktionsmedium
verwendete Phosphatpuffer durch
einen Acetatpuffer (C-Quelle) substituiert
werden. Somit kann in den
Kläranlagen eine ausgewogene Stick-
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stoff-Kohlenstoffbilanz erzielt und
Kosten durch den zusätzlichen Eintrag
von kohlenstoffhaltigen Substanzen
(wie z.B. Methanol, Citrat) reduziert
werden.
Für alle Kühlprozesse wird Brunnenwasser
aus eigener Förderung
eingesetzt. Wertvolle Trinkwasserressourcen
werden demnach nicht
berührt. Infolge einer optimalen Reaktionsführung
bei niedrigen Temperaturen
(10°C) erfolgt zudem keine
signifikante Erwärmung des Kühlwassers.
Dadurch und unter Vermeidung
produktberührter Wasserphasen
(Festphasenextraktion, Vakuum-
Kreislaufwasser, Prozessluftreinigung)
konnte das Kühlwasser ohne
Aufbereitung direkt in die Vorflut
eingeleitet werden. Infolgedessen reduziert
sich der Entsorgungsaufwand
lediglich auf die kläranlagenfähige
Acetat-Lösung (Reaktionsmedium).
Die Rückgewinnung aller eingesetzten
Lösemittel reduziert den Kostenaufwand
für Verbrauchsmittel erheblich.
Der Gesamt-Energieaufwand
liegt mit 29,43 kWh Strom und
126,0 kg Dampf pro Batch sehr
deutlich unter dem vergleichbarer
chemischer Verfahren. Die Energiekosten
betragen aus dem laufenden
Betrieb heraus weniger als 10,00
EUR je 3-L-Charge Produkt. Der
Kühlwasserbedarf (Brunnenwasser)
beträgt 4,81 m 3 je 3-L-Charge Produkt
mit Kosten, die unter jeder sinnvollen
Kalkulationsgrenze liegen
(0,15 EUR/m 3 ).
Die hieraus abgeleiteten Kenngrößen
wurden bereits in Vorbereitung
der ökologischen und ökonomischen
Evaluation bewertet. Danach
zeichnen sich umweltrelevante Vorteile
gegenüber den chemisch-technischen
Prozessen ab. Im Weiteren
stehen für das Zielprodukt nunmehr
Feinarbeiten zur Installation und Dokumentation
eines validen Prozesses
aus.
Ausblick
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Die erfolgreiche industrielle Umsetzung
der enantioselektiven Synthese
von (S)-1-Methoxy-2-propanol hat die
Leistungsfähigkeit biokatalytischer
Prozesse auch bei niedrigen Temperaturen
belegt. Bezüglich einer Minimierung
des Energiebedarfs, einer
Vermeidung toxischer Reagenzien und
der Reduzierung von Abfallentsorgungs-
und Abwasseraufbereitungskosten
erweist sich das biokatalytische
Verfahren zur Produktion enantiomerenreiner
sekundärer Alkohole als
nachhaltig umweltgerecht.
In der kommenden Phase gilt es,
die bereits etablierte technologische
Basis im Rahmen der Verwirklichung
weiterer enantiomerenreiner Alkohole
auszubauen und den Übergang von
der Molekularbiologie über den labortechnischen
Ansatz bis hin zum fertigen
Massenprodukt zu realisieren.
Apparativ ist das nunmehr etablierte
Verfahren flexibel auf vergleichbare
Synthesen übertragbar. Zielsetzung
soll nun in erster Linie die evolutive
Steigerung der Enantioselektivität ausgewählter
Esterasen, insbesondere
der bereits vorliegenden BsubpNB-
Esterase-Mutanten, gegenüber 3-Hydroxytetrahydrofuran
und 3-Butin-2ol
sein. Mit den Arbeiten zur weiteren
Optimierung erster enantioselektiverer
Enzymmutanten über Error-prone
PCR wurde bereits begonnen. Parallel
werden kälteaktive Lipasen aus
neuisolierten Psychrophilen nach
Substratspezifität und Enantioselektivität
gescreent. Der Integration enantioselektiver
Enzyme in das Syntheseverfahren
folgt anschließend eine Optimierung
der Prozessabläufe unter
Berücksichtigung der genannten ökologischen
und ökonomischen Parameter.
Aus dem Vorhaben wird
schließlich ein universelles umweltgerechtes
Verfahren zur effizienten Synthese
enantiomerenreiner sekundärer
Alkohole resultieren.
Literatur
[1] Bornscheuer, U.T., Kazlauskas, R.J.,
Hydrolases in Organic Synthesis -
Regio- and Stereoselective Biotransformations,
Wiley-VCH, Weinheim(1999).
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[5] Henke, E., Bornscheuer, U.T., Appl.
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U.T., Angew. Chem. 113
(2001), 4329-4333.
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[10] Bornscheuer, U.T., Curr. Opin. Biotechnol.
13 (2002), 543-547.
[11] Henke, E., Pleiss, J., Bornscheuer,
U.T., Angew. Chem. 114 (2002),
3338-3341.
[12] Baumann, M., Hauer, B.H., Bornscheuer,
U.T., Tetrahedron: Asymmetry
11 (2000), 4781-4790.
Korrespondenzadresse
Dr. Markus Kähler
Dr. Rieks GmbH
Deichstr. 25a
D-25436 Uetersen
Tel.: 04122-9066-43
Fax: 04122-9066-53
eMail: kaehler@riekslab.de
Web: www.riekslab.de

ESTERASEN/LIPASEN
Esterasen und Lipasen aus
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
81
kultivierten und nicht-kultivierten
Mikroorganismen
� Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Dr. Anna Musidlowska-Persson, Dominique Böttcher1 , Dr. Klaus Liebeton, Dr. Patrick Lorenz, Dr. Jürgen Eck, Dr. Holger
Zinke2 , Dr. Christa Schleper3 , Prof. Dr. Peter Langer4 , Dr. Harald Trauthwein, Dr. Andreas Karau, Dr. Stefan Buchholz5 ,
1 2 Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie, Abt. Technische Chemie und Biotechnologie, Greifswald, B.R.A.I.N. AG, Zwingenberg,
3 4 Institut für Mikrobiologie und Genetik, TU-Darmstadt, Darmstadt, Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie, Abt. Bioorganische
Chemie, Greifswald, 5Projekthaus Biotechnologie, Degussa AG, Hanau
Im Rahmen des von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) geförderten Verbundprojekts werden Enzyme aus mikrobiellen Isolaten sowie aus Metagenom-Genbanken
verschiedenster Habitate isoliert, um Enzymbanken darzustellen. Die darin enthaltenen Biokatalysatoren (Lipasen/Esterasen) werden
eingehend bezüglich ihres Substratspektrums und ihrer Enantioselektivität charakterisiert. Hierfür stehen sowohl effiziente Methoden für das Hochdurchsatzscreening
(HTS) im Mikrotiterplattenformat als auch zur Synthese zahlreicher chiraler racemischer Ausgangsverbindungen zur Verfügung. Ein
zweites Ziel des Verbundprojekts ist die Verfügbarmachung von rekombinanter Schweineleberesterase (rPLE). Ein im Vergleich zu kommerzieller PLE
hochstereoselektives Isoenzym dieser für die organische Synthese wichtigen Esterase kann zwar durch Expression in der Hefe Pichia pastoris hergestellt
werden, die zu niedrige Produktivität dieses Expressionssystems erfordert jedoch eine Optimierung bzw. den Wechsel zu alternativen Wirtsorganismen,
um eine wirtschaftliche Vermarktung dieses Enzyms zu ermöglichen. Darüber hinaus werden Mutanten der PLE hergestellt und mittels HTS bezüglich
Substratspektrum und Stereoselektivität charakterisiert.
Keywords: Metagenom, Lipase, Esterase, Hochdurchsatzscreening, PLE, Dominoreaktionen.
Einleitung und Zielsetzung
Enzymatische Prozesse, insbesondere
stereoselektive Hydrolysen und Synthesen,
gewinnen in der modernen Feinchemie
ständig an Bedeutung. Enzymatische
Reaktionen können im Vergleich
zur chemischen Katalyse häufig unter
milderen Bedingungen bezüglich der
Verwendung von organischen Lösungsmitteln
und Prozessparametern wie
Temperatur, Druck und pH-Wert
durchgeführt werden. Ein weiterer
ökologischer Vorteil von Biokatalysatoren
beruht auf der Eigenschaft der
Enzyme, eine Vielzahl von Reaktionen
stereo- und enantioselektiv zu katalysieren,
sodass mehrstufige Synthesen
mitunter verkürzt, Ausbeuten gesteigert
und Nebenprodukte minimiert
werden können. Biokatalytische Prozesse
haben also ein erhebliches Potential
zur Ressourcenschonung und
Umweltentlastung [1-4].
Trotz großer Fortschritte in der
Molekularbiologie und Enzymologie
und dem exponentiell wachsenden
Verständnis von Struktur-Aktivitätsbeziehungen
von Biokatalysatoren stößt
die breite Einführung derartiger Verfahren
in die industrielle Anwendung
aufgrund der Nichtverfügbarkeit von
großen Sammlungen an Enzymen und
deren Bereitstellung in industriell erforderlichen
Mengen und Qualitäten
auf erhebliche Barrieren. Besonders
vielseitig einsetzbar sind Lipasen und
Esterasen, die sich durch ein breites
Substratspektrum, oft sehr hohe Enantioselektivität,
sowie Aktivität und
Stabilität in organischen Lösungsmitteln
auszeichnen [1]. Derzeit sind jedoch
nur etwa 50 verschiedene Lipasen/Esterasen
auf dem Markt erhältlich,
die aber nicht immer die unterschiedlichen
Anforderungen, z.B. hinsichtlich
Substratspezifität, Enantioselektivität
und Prozessstabilität wechselnder
Fragestellungen, erfüllen können
[1].
Ein vielversprechender Zugang zu
neuen Biokatalysatoren besteht in der
Erstellung komplexer Metagenombanken.
Da nur etwa 1% der in einem
Habitat vorhandenen mikrobiellen
Diversität durch traditionelle Kultivierungstechniken
einer funktionellen
oder genetischen Durchmusterung
zugänglich gemacht werden können,
stellt der Ansatz der direkten Extraktion
von Umwelt-DNA idealerweise aller
in einer Bodenprobe vorhandenen
Mikroorganismen, also ohne einen
Kultivierungsschritt, eine immense
Erweiterung der verfügbaren mikro-
biellen Biodiversität dar. Diese hohe
Diversität bietet die Möglichkeit, ideale
Biokatalysatoren für die Mehrzahl
industrieller Anwendungen aufzufinden
[5,6].
Um eine möglichst rasche, zuverlässige
und anwendungsorientierte
Charakterisierung dieser Enzyme zu
ermöglichen, werden diese mittels
Hochdurchsatzscreening-Systemen
eingehend bezüglich Aktivität und Enantioselektivität
gegenüber einer Reihe
von Modellsubstraten charakterisiert.
Zusätzlich wird im Rahmen des
Vorhabens die Expression der Schweineleberesterase
(PLE) untersucht.
PLE stellt derzeit eine der wichtigsten
Esterasen für Anwendungen in der
organischen Synthese dar. Mit diesem
Enzym konnte eine große Zahl optisch
reiner Verbindungen durch Asymmetrisierung
oder durch Racematspaltung
dargestellt werden [7]. Die problematische
Anwesenheit einer Reihe
von Isoenzymen der PLE in kommerziellen
Präparationen aus der Schweineleber
konnte durch Expression eines
spezifischen Isoenzyms in der Hefe
Pichia pastoris umgangen werden
[8], welches zudem deutlich veränderte
Substrat- und Enantioselektivi-
täten (E>>100) in der Racematspaltung
sekundärer Alkohole im Vergleich
zu käuflichen Präparaten (E~1-
4) aufweist [9]. Allerdings ist die Produktivität
in der Herstellung des Enzyms
mittels Pichia pastoris unbefriedigend
und es werden daher alternative
Expressionssysteme untersucht.
Die Gesamtstrategie ist in Abbildung
1 veranschaulicht.
Vorgehensweise und
Ergebnisse
Identifizierung von neuen
Esterasen und Lipasen in
der kultivierten und nicht
kultivierten Biodiversität
Als Ressource für das Auffinden neuer
und verschiedenartiger Esterasen
und Lipasen werden sowohl die kultivierte
Biodiversität in Form von umfangreichen
Stammsammlungen eubakterieller
und thermophiler archaealer
Mikroorganismen als auch
die nicht-kultivierte Biodiversität in
Form von so genannten Metagenom-
Banken genutzt. Die Identifizierung
der Gene solcher Enzyme kann über
zwei verschiedene Strategien erfolgen.
Zum einen können unter Verwendung
eines Agarplattentests mit Tri

82 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 1: Gesamtstrategie zur Erzeugung neuer Biokatalysatoren.
butyrin als Substrat die Klone bzw.
Stämme identifiziert werden, die ein
aktives lipolytisches Enzym bilden
(Abb. 2). Diese Vorgehensweise basiert
auf der Expression der gesuchten
Gene und dem Nachweis der Aktivität
der korrespondierenden Enzyme.
Ist ein Esterase-bildender Metagenom-Klon
gefunden worden, so wird
das zugehörige Gen durch eine
Transposonmutagenese auf dem zwischen
8 – 40 kBp großem Metagenom-Fragment
identifiziert. Durch
eine zufällige Insertion des Transposons
wird das gesuchte Gen inaktiviert.
Der daraus resultierende Verlust
der lipolytischen Aktivität des
erzeugten Transposon-„Knock-out“
Klons dient als Indikator für die Identifizierung
des gesuchten Gens.
Durch eine Sequenzierung mit Transposon-spezifischen
Primern kann die
gesuchte flankierende DNA-Sequenz
unmittelbar bestimmt werden.
Ist ein Esterase/Lipase-bildendes
mikrobielles Isolat aus der kultivierbaren
Biodiversität, der zweiten Ressource
dieses Projekts, identifiziert
worden, so wird von diesem Stamm
eine genomische Genbank in E. coli
angelegt und diese über die gleiche
Vorgehensweise durchmustert, wie
für die Metagenom-Klone beschrieben.
Der zweite Ansatz bedient sich der
Sequenzinformation bereits bekannter
Esterasen und Lipasen. Diese Information
wird genutzt, um konservierte
Proteinstrukturen zu identifizieren,
die idealerweise nur in der Enzymklasse
der Esterasen/Lipasen oder
sogar nur in einzelnen Familien dieser
Klasse auftreten. Über eine reverse
Genetik werden von diesen konservierten
Proteinstrukturen DNA-Sequenzen
abgeleitet, die dann als spe-
zifische Sonde zur Identifizierung ähnlicher
Gene, also solcher, die auch für
Esterasen/Lipasen kodieren, verwendet
werden. Die Sonden können entweder
in einer klassischen Koloniefilterhybridisierung
oder in einer PCR
eingesetzt werden. Auch diese Vorgehensweise
ist sowohl für die Identifizierung
von Esterasen und Lipasen in
Metagenom-Banken als auch in genomischen
Banken von Lipase-positiven
Isolaten geeignet.
Abb. 2: Aktivitäts-basiertes Durchmustern von Metagenom-Banken nach
lipolytischen Klonen. Die Trübungsklärung um einzelne Kolonien ist auf
den enzymatischen Abbau des Tributyrins zurückzuführen und deutet auf
das Vorhandensein einer aktiven Esterase oder Lipase hin.
Im Laufe des Projekts wurden
bisher acht Metagenom-Banken auf
Klone mit lipolytischer Aktivität
durchmustert. Diese Banken umfassen
zwei Plasmid-Banken mit Metagenom-Fragmentgrößen
von 3-12
kBp („Activity Based Expression Libraries“
(ABEL ® )) sowie 6 Cosmidbzw.
Fosmid-Banken mit Fragmentgrößen
von 35-45 kBp („Large Insert
Libraries“ (LIL ® )). Obwohl nur
Bruchteile der Plasmidbanken untersucht
wurden, ergibt sich bisher
ein Gesamtumfang der durchmusterten
Metagenom-DNA von etwa
6300 MBp, was bei einer durchschnittlichen
Genom-Größe von 4-
5 MBp etwa 1500 Genom-Äquivalenten
entspricht. Insgesamt konnten
bisher über 500 Klone identifiziert
werden, die im ersten Test lipolytische
Aktivität zeigten. Tatsächlich ist
die Auffindungsrate von aktiven Klonen
in den Plasmid-Banken höher
als in den Cosmid- und Fosmid-Banken,
was auf die Präsenz der Vektor-lokalisierten
Promotoren zurückzuführen
sein könnte, die eine
heterologe Expression erleichtern.
Unter der Annahme einer durchschnittlichen
Genomgröße von 4
MBp ergibt sich für die ABELs ® bzw.
LILs ® eine Effizienz der Identifizierung
von 0,8 bzw. 0,2 Esterasen/Lipasen
pro Genomäquivalent. Die
Analyse von 30 vollständig sequenzierten
und annotierten eubakteriellen
und 7 archaealen Genomen
zeigt, dass die o.g. Auffindungsraten
80% bzw. 20% der gemäß Annotierung
theoretisch auffindbaren
Esterase/Lipase-Genen entspricht.
Damit stellt sich der Aktivitäts-basierte
Ansatz für das Auffinden von
Esterasen/Lipasen in Plasmid-Banken
als sehr effizient dar und liefert
sogar höhere Auffindungsraten als
die Durchmusterung der kultivierten
Biodiversität (siehe unten)
(Abb. 3).
Die Sequenzierung der über das
Aktivitäts-basierte Durchmustern
von Metagenom-Plasmidbanken
identifizierten Gene belegt, daß es
sich tatsächlich um neue und hoch
diverse Gene handelt. Darüber hinaus
zeigte eine anfängliche Charakterisierung
der Enzyme hinsichtlich
Substratspezifität/Enantioselektivität,
Temperatur- und pH-Stabilität
auch die erwünschte funktionelle
Diversität. Erwähnenswert ist an dieser
Stelle die Tatsache, dass äußerst
thermostabile Enzyme auch in Metagenom-Banken
gefunden wurden,
die aus Bodenproben von nicht-extremen
Standorten erstellt wurden.

Um auch die Esterase/Lipase-Gene
in den Metagenom-Banken finden zu
können, die im Wirtsorganismus der
Genbanken (E. coli) nicht exprimiert
werden und somit durch den Aktivitäts-basierten
Ansatz nicht identifizierbar
sind, wurde der oben beschriebeneSequenzhomologie-basierte
Ansatz etabliert. Es zeigte sich,
dass sogar die verschiedenen Familien
von Esterasen und Lipasen, wie
etwa die „echten“ Lipasen (Familie
1 [10]) oder die „GGGX-Typ“-Esterasen
[11], welche zur Hydrolyse von
tertiären Alkoholen befähigt sind,
spezifisch adressiert werden können.
So konnten z.B. in einem ersten Versuch
19 verschiedene und neue
„GGGX-Typ“ Carboxylesterasen in
zwei Fosmid-Banken identifiziert
werden, ohne ein Gen einer anderen
Familie zu amplifizieren. Da die Positionen
dieser Klone auf den für die
Konservierung von LILs ® verwendeten
Mikrotiterplatten andere sind, als
die der über das Aktivitäts-basierte
Durchmustern gefundenen Klone, ist
die Verschiedenheit der Enzyme sehr
wahrscheinlich und unterstreicht
den komplementären Charakter beider
„Screening“-Ansätze.
Die kultivierte Biodiversität in
Form von Stammsammlungen bietet
eine weitere Ressource für das Auffinden
neuer Esterasen und Lipasen.
Auch hier konnten in einem ersten
Versuch zahlreiche Kandidaten identifiziert
werden, die durch ihre lipolytische
Aktivtität aufgefallen sind.
Von 569 getesten Stämmen zeigten
266 eine Hofbildung auf Tributyrin-
Agarplatten. Von diesen wiesen 41
Stämme eine echte Lipaseaktivität
auf, wie die Hydrolyse von Triolein
anzeigte. In jedem Fall stellt aber die
Sammlung thermophiler archaealer
Organismen eine weitere vielversprechende
Ressource für thermostabile
Carboxylesterasen dar. Zusammen
mit der Durchmusterung der nichtkultivierten
Biodiversität bietet dieses
Projekt einen umfassenden und
komplementären Ansatz zur Erschließung
neuer Esterasen und Lipasen
für die Feinchemie.
Die in Metagenom-Banken und
der kultivierten Biodiversität identifizierten
Enzyme werden in diesem
Verbund einer Charakterisierung
unterzogen, um Entscheidungskriterien
für eine Priorisierung hinsichtlich
der Klonierung und Überexpression
der Kandidaten zu gewinnen.
Schließlich sollen neue und verschiedene
Enzymproben gewonnen und
für Anwendungstests Dritten zur Verfügung
stehen.
Abb. 3: Vergleich der Auffindungsraten von Esterase/Lipase-Genen beim
Aktivitäts-basierten Durchmustern von Plasmid- und Cosmid/Fosmid-
Metagenom-Banken sowie zufällig ausgewählten Isolaten einer Stammsammlung.
Die Klone der Metagenom-Banken und 569 Isolate wurden mittels Tributyrin-Agarplatten
auf ihre Fähigkeit zur Expression und aktiven Darstellung
von Esterasen/Lipasen untersucht. Für die Berechnung der Auffindungsrate
in den Metagenom-Banken wurde eine durchschnittliche Genomgröße
von 4 MBp angenommen. Zur Genomanalyse wurden 30 eubakterielle
und 7 archaeale vollständig sequenzierte Genome auf das Vorhandensein
von Esterase/Lipase-Genen untersucht.
Substratsynthesen
Die Charakterisierung von neuen
Esterasen und Lipasen hinsichtlich
ihres biotechnologischen Potenzials
macht die Bereitstellung von Substra-
Abb. 4: Durch Domino-Reaktionen zugängliche Synthesebausteine.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
83
ten erforderlich. Durch effiziente Domino-Reaktionen
[12,13] ist ein sehr
breites Spektrum an Verbindungen
zugänglich (Abbildung 4), die mittels
der Hydrolasen in ihre optisch reinen
Verbindungen überführt werden sol-
len. Dies schließt die Entwicklung geeigneter
Methoden zur Enantiomerenanalytik
(chirale HPLC und Gaschromatographie)
ein.
Hochdurchsatzscreening
der Biokatalysatoren
Die aus Metagenombanken zugänglichen
Lipasen und Esterasen werden
mittels verschiedener Hochdurchsatz-Screeningsysteme
(HTS) im Mikrotiterplattenformat
durchmustert.
Die hierzu verwendeten Modellsubstrate
stellen Ester vorwiegend sekundärer
und tertiärer Alkohole dar.
Zur Bestimmung der Aktivität und
Stereoselektivität gegenüber chiralen
Alkoholen wird zunächst ein Acetat-
Assay verwendet [14]. Hierbei führt
die durch Enzymkatalyse freigesetzte
Essigsäure mittels einer gekoppelten
Enzymkaskade zur proportionalen
Bildung von NADH, welches spektrophotometrisch
quantifiziert wird.
Bei Einsatz optisch reiner Acetate in
zwei Vertiefungen einer Mikrotiterplatte
kann so die Enantioselektivität
abgeschätzt werden. Zusätzlich
erlaubt ein weiterer HTS-Test die direkte
Bestimmung der Syntheseaktivität
der Biokatalysatoren in organischen
Lösungsmitteln [15]. Anschließend
erfolgt mit aktiven und enantioselektiven
Enzymen eine Umsetzung
im präparativen Maßstab und
eine Verifizierung durch chirale Gaschromatographie
bzw. HPLC.
Mit dieser Strategie wurden bereits
einige neu erhaltene Enzyme charakterisiert.
Danach zeigen alle Esterasen
Aktivität gegenüber den Modellsubstraten.
Selbst Ester tertiärer Alkohole
werden mit guter Aktivität
umgesetzt (Abbildung 5).
Optimierte Expression
rekombinanter
Schweineleberesterase
(PLE)
Eine effiziente und stabile Enzymexpression
ist für die spätere industrielle
Produktion der Biokatalysatoren
von ausschlaggebender Bedeutung.
Die verwendeten Systeme sollen hohe
Expressionsraten bei niedrigen Induktions-
und Medienkosten ermöglichen.
Des Weiteren sollte die Aufarbeitung
des Biokatalysators möglichst
einfach und kostengünstig sein. Eine
weitere Anforderung an ein möglichst
universelles Expressionssystem ist
eine umfassende Flexibilität gegenüber
unterschiedlichen, im Screening
aus verschiedenen Organismen identifizierten
Enzymen.

84 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 5: Qualitativer Aktivitätstest für ausgewählte Esterasen und Substrate. Sek., sekundärer Alkohol; Tert., tertiärer
Alkohol.
Bei der heterologen Expression
von eukaryotischen, insbesondere
aus tierischen Geweben stammenden
Enzymen, sind bis dato nur unzureichend
effiziente Expressionssysteme
beschrieben worden. Die Verwendung
von tierischen Proteinen und
Enzymen, die direkt aus tierischen
Gewebe gewonnen werden, wird im
Zusammenhang mit in letzter Zeit auftretenden
Krankheiten wie BSE immer
kritischer gesehen. Dies verlangt eine
fermentative Expression solcher Enzyme,
für die in mikrobiellen Systemen
aber wenig Erfahrungen vorhanden
sind.
So ermöglicht zwar das Pichia pastoris-System
erstmalig die heterologe
Expression rekombinanter PLE
[8], doch muss die Produktivität aufgrund
der niedrigen Ausbeuten noch
wesentlich gesteigert werden. Auch
die pulsierende Zugabe von Methanol
für das etablierte Pichia pastoris-System
ist in der Praxis aufwändig.
Die Aufreinigung der rPLE ist dagegen
relativ einfach, da das Enzym
ins Medium sekretiert wird. Die Aufarbeitung
enthält lediglich einen
Schritt zur Zellabtrennung und anschließender
Aufkonzentrierung der
Lösung (Abb. 6).
In jüngster Zeit sind jedoch weitere
Expressionssysteme auf Basis von
Hefen und Pilzen etabliert worden,
deren Verwendbarkeit auf eukaryotische
Systeme, wie der PLE untersucht
werden sollen [16,17]. Die weitere
Charakterisierung und Optimierung
dieser Systeme hinsichtlich ihrer Expressionsleistung
für die rPLE-Gewinnung
kann somit wesentliche Beiträge
und Strategien liefern, tierische
Enyzme mittels mikrobieller Systeme
fermentativ zu produzieren.
Zusammenfassung
In diesem stark interdisziplinär angelegten
Vorhaben gelang es, effiziente
Methoden zur Darstellung diverser
neuartiger Lipasen und Esterasen
zu etablieren. Erste Untersuchungen
mittels Hochdurchsatz-
Screeningverfahren deuten auf hohe
Aktivitäten dieser Biokatalysatoren
gegenüber verschiedenen Estern sekundärer
und insbesondere tertiärer
Alkohole hin. Diese Verbindungen
können zudem im Gramm-Maßstab
in wenigen Stufen synthetisiert
werden. Eine entsprechende Enantiomerenanalytik
über Gaschromatographie
wurde etabliert. Im weiteren
Projektverlauf stehen die
Durchmusterung weiterer Lipasen
und Esterasen und Racematspaltungen
im präparativen Maßstab mit
ausgewählten enantioselektiven Enzymen
im Vordergrund. Für die industrielle
Herstellung rekombinan-
Abb. 6: Schematische Darstellung
der Aufarbeitungsstrategie zur
Herstellung rekombinanter
Schweineleberesterase.
ter Schweineleberesterasen wurden
Aufarbeitungsstrategien entwickelt.
Erste Untersuchungen zur Expression
der PLE in alternativen Wirtsorganismen
zur Hefe Pichia pastoris
wurden begonnen.
Literatur
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(1999) Hydrolases in Organic Synthesis
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transformations, Wiley-VCH, Weinheim.
[2] Liese, A., Seelbach, Wandrey, C.
(2000) Industrial Biotransformations,
Wiley-VCH, Weinheim.
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(2001), 2934-2936.
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U.T., Angew. Chem. 113
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U.T., Angew. Chem. 115 (2003), 1449-
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54 (2000), 741-750.
[17] Devchand, M., Gwynne, D. I., J. Biotechnol.
17 (1991), 3-9.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer
Institut für Chemie und Biochemie,
Abt. Technische Chemie und
Biotechnologie, Ernst-Moritz-Arndt
Universität Greifswald
Soldmannstr. 17
D-17487 Greifswald
Tel.: 03834-8643 67
Fax: 03834-8643 46
eMail: uwe.bornscheuer@unigreifswald.de
www.chemie.uni-greifswald.de/
biotech

PHYTASE
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
85
Produktion der Phytase von
Escherichia coli
� Dr. Gerhard Miksch1 , Dr. Sophia Kleist1 , Dr. Bernd Hitzmann2 , Dr. Michael Arndt2 , Dr. Karl Friehs1 , Dr. Arno Cordes3 , Prof. Dr. Erwin Flaschel1 1 2 3 Lehrstuhl für Fermentationstechnik der Technischen Fakultät, Universität Bielefeld, Institut für Technische Chemie, Universität Hannover, ASA Spezialenzyme
GmbH, Wolfenbüttel
Phytasen werden seit einigen Jahren in der Ernährung monogastrischer Nutztiere (z.B. Schweine und Geflügel) eingesetzt, um den Nährwert des Futters
durch Aufschluss der im Futter enthaltenen Phytate zu erhöhen. Die industrielle Produktion der Phytasen erfolgt zur Zeit hauptsächlich durch Fermentation
von Pilzen (Aspergillus sp.), die Phytasen ins Medium sekretieren. Die Phytase von E. coli besitzt gegenüber pilzlichen Phytasen Eigenschaften, die
eine höhere Effektivität als Futteradditiv bedingen können. Dies betrifft insbesondere eine wesentlich höhere spezifische Aktivität, geringeres pH-Optimum,
Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau im Tiermagen sowie Temperaturstabilität beim Pelletieren. Zur Überexpression und extrazellulären
Produktion der Phytase in E. coli wurde ein Expressionsvektor entwickelt, wobei ein Sekretionssystem auf der Basis der kontrollierten Expression des
kil-Gens integriert wurde. Die extrazelluläre Produktion der Phytase wurde in Fermentationen mit Zufütterungsmodus untersucht. Zwei Zufütterungsstrategien
wurden verglichen: Kontrolle der Zufütterung bei konstant geringer Glucosekonzentration und Kontrolle der Zufütterung bei konstant geringer
Sauerstoffkonzentration. Während die Zufütterung bei geringer Glucosekonzentration zu hoher Wachstumsgeschwindigkeit und zu einer schnellen Erhöhung
der Phytasekonzentration (120 U ml -1 ) führte, wurden mit der Zufütterung bei einer konstant niedrigen Sauerstoffkonzentration von 5-10 % höhere
Phytaseausbeuten, allerdings bei längerer Kultivierungszeit, erzielt. In Tierversuchen mit Schweinen und Geflügel zeigte die E. coli-Phytase eine höhere
Phosphor- und Calcium-Verdaulichkeit als kommerziell verfügbare pilzliche Phytasen.
Keywords: Escherichia coli, Phytase, Fermentation, Zufütterungsstrategien, Tierversuche, Futteradditiv.
Phytase als wichtiges
Futteradditiv bei intensiver
Tierproduktion
Phytinsäure (myo-Inositol 1,2,3,4,5,6hexakisdihydrogenphosphat)
ist die
Hauptspeicherform für Phosphor in
Tierfutter, insbesondere bei Getreide.
In dieser Speicherform ist der lebenswichtige
Phosphor für monogastrische
Nutztiere (z.B. Schweine,
Geflügel) nicht verfügbar. Phytase
(myo-Inositol-hexakisphosphat-
Phosphohydrolase, EC 3.1.3.8 für 3-
Phytase bzw. EC 3.1.8.26 für 6-Phytase)
hydrolysiert Phytat zu myo-
Inositol und anorganischem Phosphat.
Da im Verdauungstrakt monogastrischer
Tiere keine oder nur
sehr wenig Phytase vorhanden ist,
wird Phytat nicht verdaut und reichert
sich in den Fäkalien an. Auf
diese Weise führt Phytat zu einer ernsten
Umweltbelastung. Die Phosphoranreicherung
insbesondere in
Regionen mit intensiver Tierhaltung
ist inzwischen zu einem globalen
Problem geworden [1]. Außerdem
beeinflusst Phytat die gesamte Ernährung
negativ, da unlösliche Komplexe
mit lebenswichtigen Metallen
wie Kalcium, Zink, Magnesium und
Eisen sowie Proteinen gebildet werden.
Dies verringert den Wert vom
Futter auf der Basis von Getreide und
Leguminosen.
Seit mehreren Jahren werden Phytasen
industriell aus Pilzen (Aspergillus
sp.) gewonnen und dem Futter
von monogastrischen Tieren zugegeben
[2]. Um verbesserte Phytasen
zu erhalten, wurden verschiedene
Organismen wie Bakterien, Pilze
und Pflanzen untersucht.
Besondere Eigenschaften
der E. coli-Phytase
Verglichen mit allen bisher untersuchten
Phytasen aus den verschiedensten
Organismen besitzt die Phytase
aus E. coli die höchste spezifische
Aktivität. So ist diese etwa 8fach
aktiver als die kommerziell erhältlichen
Phytasen. Bei pH 4,5 wurde
eine spezifische Aktivität von
1060 U mg -1 gemessen [5]. Die Analyse
einer reinen Phytase aus E. coli
[3] zeigte, dass sie ähnliche Eigenschaften
besitzt, wie die bereits bekannte
saure Phosphatase [4]. Die
Sequenzierung der E. coli-Phytase
ergab, dass die DNA- und Aminosäuresequenz
mit wenigen Ausnahmen
identisch ist mit denen der sauren
Phosphatase [5]. Aus einem Vergleich
der kinetischen Parameter für
unterschiedliche Substrate (Phytinsäure
und PNPP) wird ersichtlich,
dass das Enzym bifunktionell ist. Die
Phytaseaktivität ist allerdings wesentlich
ausgeprägter als die Aktivität der
sauren Phosphatase (Tab. 1). Das
pH-Optimum der E. coli-Phytase
liegt mit pH 4,5 niedriger als bei pilzlicher
Phytase (pH 5,5). Es ist deshalb
davon auszugehen, dass die E.
coli-Phytase im sehr sauren pH-Milieu
des Tiermagens ihre Aktivität
besser entfalten kann als die von Pilzen.
Als besonders vorteilhafte Eigenschaft
der E. coli-Phytase gegenüber
pilzlichen Phytasen wurde eine Resistenz
gegen proteolytischen Abbau
durch Verdauungsenzyme im Magen
festgestellt. Darauf wird ausführlich
im letzten Abschnitt eingegangen.
Tab. 1: Kinetische Konstanten für die Hydrolyse von Natriumphytat und p-
Nitrophenylphosphat (PNPP) durch die E. coli-Phytase.
Substrat K M (10 -3 mol l -1 ) k cat (s -1 ) k cat /K M (10 5 s -1 M -1 )
Phytinsäure 0,083 1131 136
PNPP 36 4203 1,1
Anmerkung: Puffer pH 4,5 for Phytinsäure und pH 2,5 für PNPP;
Substratkonzentration 0,03-9 mM für Phytinsäure und 6,25-70 mM für PNPP.
Expression der Phytase in
E. coli
In normal wachsenden Zellen von E.
coli ist die Expression des Phytasegens
kaum messbar. Obwohl unter anaeroben
Bedingungen die Phytase in
geringem Umfang exprimiert wird, ist
die Konzentration viel zu gering für
- Cm
P-fic
kil
Km
P-bgl
pPhyt109
7.0 kb
Ap
Phytase
Abb. 1: Schematische Darstellung
des Expressionsvektors zur Produktion
der E. coli-Phytase.
praktische Anwendungen. Da das Enzym
im Periplasma der Zellen angereichert
wird, müssen die Zellen aufgebrochen
werden. Für eine industrielle
Gewinnung wäre eine extrazelluläre
Produktion der Phytase wünschenswert.
Deshalb haben wir einen
Expressionsvektor entwickelt, der die
Voraussetzung für eine hohe Expression
der Phytase und deren Sekretion
ins Kulturmedium bildet. Der Expres-
ori

86 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Enzymlösung (GOD)
Pufferstrom
Bioreaktor Glucoselösung
sionsvektor pPhyt109 (Abb. 1) wurde
auf der Basis eines Plasmids mit
hoher Kopienzahl (pUC19) hergestellt.
Für die Phytaseproduktion wurde
der konstitutive Promotor der β-
Glucanase aus Bacillus amyloliquefaciens
verwendet, da der natürliche
Promotor nur unter anaeroben Bedingungen
induziert wird [5]. Um Sekretionskompetenz
zu erreichen,
wurde eine Sekretionskassette auf
dem Expressionsvektor integriert. Die
Kassette beinhaltet das kil-Gen vom
Plasmid ColE1 mit einem schwachen
Stationärphasenpromotor (fic), ein
Interposon zur Vermeidung unkontrollierter
Expression des kil-Gens
sowie die Gene für die Kanamycinresistenz
(Km) und Ampicillinresistenz
Injektoren
zentrationen an sekretiertem Zielproteinen
im Medium erreicht werden
können. Die Regelung des Verfahrens
erfolgte bisher jedoch nur so, dass
die C-Quelle in nicht reproduzierbarer
Form zugeführt wurde. Diese einfachen
Strategien gewährleisten
nicht, die stationäre Wachstumsphase
gezielt zu einem gegebenen Zeitpunkt
einzuleiten bzw. sie hinauszuzögern.
Daher sind Versuche zur fermentativen
Gewinnung der Phytase
durchgeführt worden, bei denen zwei
Strategien im Zulaufverfahren verglichen
wurden: Regelung der Zufütterung
von Glucose entweder über die
Glucosekonzentration oder die Sauerstoffsättigung.
Um eine Zufütterung
von Glucose über die aktuelle Glu-
Tab. 2: Einfluss der Pelletierung auf die Phytaseaktivität (%).
Phytase Vor dem Pelletieren Nach dem Pelletieren bei
60°C 70°C
Aspergillus A 100 (1850) 92,6 70,5
Aspergillus R 100 (1830) 84,0 62,3
Peniophora 100 (2670) 26,8 15,7
Aspergillus T 100 (1750) 51,9 25,0
E. coli 100 (410) 98,8 78,0
Signal (Units)
6
5
4
3
2
1
0
Kalman-Filter
Vorhersage der Glucosekonzentration
FIA-System
Manifold Sauerstoffelektrode
Zellen
DO
Glucose
0 20 40 60 80 100 120
Zeit (sec)
Glucosekonzentration
Abb. 2: Flussdiagramm des schnellen FIA-Systems zur Regelung der Glucosekonzentration.
(Ap) als Selektionsmarker [6].
Durch die Expression des kil-Gens
unter Kontrolle eines Stationärphasenpromotors
kann die Kultur ohne
den zellschädigenden Einfluss des Kil-
Peptids bis zur maximalen Zelldichte
wachsen. Die Expression wird automatisch
bei Eintreten in die stationäre
Phase induziert, was die Wachstumsphase
auf natürlichem Wege von
der Produktionsphase trennt [7].
Extrazelluläre Produktion
im Bioreaktor
Fermentationstechnische Untersuchungen
haben gezeigt, dass unter
Zulaufbedingungen recht hohe Kon-
cosekonzentration im Medium regeln
zu können, ist eine schnellere Analytik
erforderlich, als dies mit den derzeit
verfügbaren Fließinjektionssystemen
(FIA) möglich ist. Deshalb wurde
eine schnelle Fließinjektionsmethode
entwickelt, die bei der Produktion
der E. coli-Phytase eingesetzt
wurde (Abb. 2) [8,9,10]. Fermentationsexperimente
wurden in einem 7
L-Fermenter mit drei verschiedenen
konstant geringen Glucosekonzentrationen
(0,3, 0,2 und 0,1 g l -1 ) durchgeführt.
Da die Variante mit 0,2 g l -1
die besten Ergebnisse zeigte, wird
diese Variante hier beschrieben. Die
Zufütterung wurde nach einer Kultivierungszeit
von 4,5 h gestartet, wenn
die Glucosekonzentration auf 0,2 g l -1
gesunken war. Abbildung 3 zeigt,
dass es mit dem entwickelten System
möglich ist, eine konstant niedrige
Glucosekonzentration während der
gesamten Nachfütterungszeit zu halten.
Die Wachstumsgeschwindigkeit
der Bakterien war relativ hoch (µ =
0,5 h -1 ). Die Phytaseproduktion insgesamt
sowie im Medium stieg während
der gesamten Nachfütterungsperiode
schnell an, insbesondere
während der stationären Phase. Die
produzierte Phytase wurde fast vollständig
ins Kulturmedium sekretiert.
Bereits nach 14 h wurden 120 U ml -1
an extrazellulärer Phytase produziert.
Die Fortsetzung der Fermentation
über diese Zeitspanne hinaus brachte
keinen weiteren Zuwachs an extrazellulärer
Phytase.
sehr gering (0,1 g l -1 ), wobei keine
Acetatbildung beobachtet wurde. Die
besten Ausbeuten an Phytase wurden
bei einer Sauerstoffkonzentration von
5–10 % erreicht (Abb. 4). Die Ausbeute
an extrazellulärer Phytase betrug
140-180 U ml -1 .
Um die Effektivität der Fermentationen
zu ermitteln, wurden die optimalen
Varianten aus beiden Nachfütterungsstrategien
hinsichtlich der
Selektivität (Verhältnis von Phytaseaktivität
zur produzierten Biomasse)
miteinander verglichen (Abb. 5).
Dabei zeigte sich, dass auch über die
einfachere Strategie einer sauerstoffgeregelten
Glucosezufütterung bei
niedrigem Niveau des Sauerstoffpartialdrucks
(pO 2 ) eine ähnlich gute
extrazelluläre Phytaseaktivität erreicht
werden kann wie mit Hilfe der
Abb. 3: Fermentation von E. coli bei konstant niedriger Glucosekonzentration
(0,2 g l -1 ) mit Regelung der Zufütterung durch die Glucosekonzentration.
Bei der Zufütterungsstrategie mit
konstant geringem Sauerstoffgehalt
und Regelung über die Gelöstsauerstoffkonzentration
wurden 4 Varianten
mit unterschiedlicher Sauerstoffkonzentration
verglichen: 2, 5, 10
und 20 % Sättigung[10]. Die Wachstumsgeschwindikeiten
der Bakterien
waren bei allen 4 Varianten sehr gering
(µ = 0,5 h -1 ). Die Bakterientrokkenmasse
stieg kontinuierlich während
der gesamten Fermentationszeit.
Die Glucosekonzentration war
während der gesamten Fermentation
Regelung eines konstanten Glucoseniveaus.
E. coli-Phytase in
Tierversuchen
Im Institut für Tierernährung der
Freien Universität Berlin wurde die
von uns produzierte E. coli-Phytase
hinsichtlich der Eignung für die Pelletierung
sowie Phosphor- und Calcium-Verdaulichkeit
bei ausgewählten
monogastrischen Tieren untersucht.
Tab. 3: Phytaseaktivitäten (Restaktivitäten in %) nach Inkubation mit einer
Lösung, die Proteasen des Schweinemagens enthielt.
Phytase Pepsin Pancreatin
Aspergillus A (von Aspergillus produziert) 25,9 22,6
Aspergillus R (in Raps produziert) 32,2 26,7
Peniophora 1,8 0
Aspergillus T (von Trichoderma produziert) 8,1 0
E. coli 94,6 91,1

Abb. 4: Fermentation von E. coli bei konstant niedriger Gelöstsauerstoffkonzentration
(5 %).
Die E. coli-Phytase besitzt im Gegensatz
zu pilzlichen Phytasen eine
optimale Aktivität bei höheren Temperaturen
[11]. Während pilzliche
Phytasen nach einer Inkubation von
20 Minuten bei 60°C nur noch 50 %
Aktivität besitzen, sind dies bei der
E. coli-Phytase über 70 %. Entscheidend
für die praktische Verarbeitung
derweise Resistenz gegenüber den
im Tiermagen vorhandenen Enzymen
Pepsin und Pankreatin (Tab. 3).
In ähnlicher Weise war die E. coli-
Phytase auch resistent gegenüber
dem Verdauungsüberstand aus dem
Tiermagen. Im Gegensatz dazu verloren
pilzliche Phytasen – bedingt
durch proteolytische Enzyme und
Tab. 4: Phytaseaktivität (Restaktivität in %) verschiedener Phytasen nach
Inkubation (60 min bei 40°C) im Verdauungsüberstand aus verschiedenen
Segmenten des Verdauungstrakts von Schweinen.
Phytase Speise- Magen Zwölffinger- Dünndarm
röhre darm
Aspergillus A 98,5 60,4 93,6 54,5
Aspergillus R 97,4 67,8 96,4 81,3
Peniophora 96,8 59,2 94,8 84,8
Aspergillus T 92,6 56,8 90,3 56,4
E. coli 96,9 92,8 96,8 80,4
von Phytasen ist das Verhalten im
Konditionierer beim Pelletierungsprozess.
Bei einer Konditionierungstemperatur
von 60 °C hat die E. coli-
Phytase noch 99 % Aktivität, während
pilzliche Phytasen in Abhängigkeit
von der Herkunft nur 84-93 %
Aktivität zeigen. Bei einer Konditionierungstemperatur
von 70 °C besitzt
die E. coli-Phytase noch 78 %
Aktivität, pilzliche Phytasen dagegen
weitaus geringere Aktivitäten (Tab.
2).
Da die Effektivität der Phytase wesentlich
von der Resistenz gegenüber
proteolytischem Abbau im Tiermagen
abhängt, wurden verschiedene
pilzliche Phytasen im Vergleich mit
der E. coli-Phytase hinsichtlich Resistenz
gegen die Hauptabbauenzyme
Pepsin und Pancreatin getestet
[11]. Während alle getesteten pilzlichen
Phytasen durch proteolytische
Aktivitäten inaktiviert wurden, zeigte
die E. coli-Phytase überraschen-
den niedrigen pH-Wert – einen beträchtlichen
Teil ihrer Aktivität (Tab.
4).
Ein entscheidendes Kriterium für
die Anwendung von Phytasen als Futteradditiv
ist letztendlich die Erhöhung
der Phosphor- und Calcium-
Verdaulichkeit des Futters. In drei
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
87
unabhängigen Versuchen wurde die
Effektivität der E. coli-Phytase auf die
Bioverfügbarkeit von P und Ca bei
Broilern, Hennen und Ferkeln im
Vergleich mit einer kommerziellen
Aspergillus-Phytase (NATUPHOS von
BASF) untersucht [12]. Die Phytasen
wurden einer Grundfuttermischung
(ohne Zugabe von anorganischem
P) in einer praxisüblichen
Konzentration von jeweils 500 U/kg
Futter zugegeben. Die Fütterungsversuche
wurden im Institut für Tierernährung
der Freien Universität Berlin
durchgeführt. Die P-Verdaulichkeit
(Gesamtbilanz) bei Broilern
wurde sowohl durch Zugabe von
Aspergillus- als auch E. coli-Phytase
erhöht, wobei die Erhöhung nur
der Aspergillus-Phytase betrug die
Erhöhung weitere 18 %.
Die Ca-Verdauung wurde ebenfalls
verbessert. Aufgrund einer relativ
großen Streuung der Einzelwerte
waren die Differenzen nicht signifikant.
Ähnliche Ergebnisse brachten
Fütterungsversuche mit Junghennen.
Dabei wurde die P-Verdauung mit
der Aspergillus-Phytase um 18 %
und mit der E. coli-Phytase um 25 %
verbessert. In gleichem Ausmaß
wurde die Gesamt-P-Verdaulichkeit
– allerdings nicht signifikant – verbessert,
wobei die E. coli-Phytase die
Verdaulichkeit deutlich mehr verbesserte
als die Aspergillus-Phytase
(7 % gegenüber der Aspergillus-
Phytase). Auf die Ca-Verdaulichkeit
Abb. 5: Selektivität von 2 Fermentationsstrategien: Kultivierung bei einer
Glucosekonzentration von 0,2 g l -1 und bei konstanter Gelöstsauerstoffkonzentration
von 5 %.
bei Zugabe von E. coli-Phytase signifikant
war (Tab. 5). Die Aspergillusund
E. coli-Phytase erhöhten auch
die präcaecale P-Verdauung (Verdaulichkeit
vor der Darmpassage)
um 11 % bzw. 29 %, wobei auch hier
eine Signifikanz nur bei der E. coli-
Phytase erreicht wurde. Gegenüber
hatte die Zugabe der Phytasen keinen
signifikanten Einfluss.
Bei Ferkeln erhöhten beide Phytasen
die P-Verdaulichkeit in weitaus stärkerem
Maße als bei Broilern und Hennen,
d.h. 33 % durch Aspergillus-Phytase
und 34 % durch E. coli-Phytase
(Tab. 6). Ebenso deutlich war der Ef-
Tab. 5: Einfluß der E. coli-Phytase auf die Verdaulichkeit von P und Ca bei Broilern im Vergleich zur Aspergillus-
Phytase (Mittelwerte ± SD, P< 0,05).
Kontrolle (ohne Phytase) Kontrolle + Natuphos Kontrolle + E. coli-Phytase
Gesamtverdaulichkeit (Balance)
n 10 12 12
P-Verdaulichkeit (%) 43,2 ± 10,2a 47,7 ± 5,2ab 51,5 ± 5,6b rel. 100 110 119
Ca-Verdaulichkeit (%) 37,1 ± 9,8 38,2 ± 9,2 39,4 ± 10,5
rel.
Präcaecale Verdaulichkeit
100 103 106
n 4 4 4
P-Verdaulichkeit (%) 48,0 ± 3,8a 53,3 ± 2,2a 62,0 ± 2,5b rel. 100 111 129
Ca-Verdaulichkeit (%) 43,1 ± 3,0 52,7 ± 9,4 54,4 ± 4,6
rel. 100 122 126

88 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Tab. 6: Einfluss der E. coli-Phytase auf die Gesamt-Verdaulichkeit (Balance) von P und Ca bei Ferkeln im Vergleich
zur Aspergillus-Phytase (Mittelwerte ± SD, P< 0,05).
Kontrolle (ohne Phytase) Kontrolle + Natuphos Kontrolle + E. coli-Phytase
n 5 5 5
P-Verdaulichkeit (%) 26,8 ± 1,9 a 35,5 ± 3,8 b 35,8 ± 1,7 b
rel. 100 133 134
Ca-Verdaulichkeit (%) 55,8 ± 3,4 a 65,7 ± 4,2 b 67,2 ± 4,2 b
rel. 100 118 120
fekt beider Phytasen auf die Ca-Verdaulichkeit
(18 % bzw. 20 % gegenüber
der Kontrolle).
Die Tierversuche zeigen, dass die
E. coli-Phytase die Bioverfügbarkeit
des gebundenen P in Futtermittelphytaten
signifikant stärker erhöhte als
die Aspergillus-Phytase. Dieser Effekt
ist offensichtlich darauf zurückzuführen,
dass die E. coli-Phytase wesentlich
stärker als die Aspergillus-Phytase
vor proteolytischem Abbau im Tiermagen
geschützt ist. Aufgrund dieser
Eigenschaft ist die E. coli-Phytase für
OXIDASEN
einen längeren Zeitraum im Magen
aktiv als die Aspergillus-Phytase.
Literatur
[1] Jongbloed, A.W., Lewis, N.P, Mroz, Z.,
Vet. Q 19 (1997), 130-134.
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[11] Igbasan, F.A., Männer, K., Miksch, G.,
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[12] Igbasan, F.A., Simon, O., Miksch, G.,
Männer, K., Arch Animal Nutr. 54
(2001), 117-126.
Korrespondenzadresse
Dr. Gerhard Miksch
Universität Bielefeld
Lehrstuhl für Fermentationstechnik
D-33501 Bielefeld
Tel.: 0521-106 52 99
eMail: gmi@fermtech.techfak.unibielefeld.de
Herstellung bakterieller Oxidasen
zur Synthese chiraler
Feinchemikalien
� Dr. Birgit Geueke1 , Priv.-Doz. Werner Hummel1 , Dipl.-Ing. Ingo Knabben2 , Dr. Simon Curvers2 , Dr. Tibor Anderlei2 1 2 Institut für Molekulare Enzymtechnolgie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, AC Biotec GmbH
In dem geplanten Projekt sollen für drei
technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme
entwickelt werden.
Mit diesen Enzymen (L-Aminosäureoxidase,
D-Aminosäureoxidase und
NADH-Oxidase) sollen neue Syntheserouten
für die Herstellung eines breiten
Spektrums an D- und L-Aminosäuren,
Ketosäuren, Alkoholen und Ketoverbindungen
eröffnet werden. Um die
enzymkatalysierten Reaktionen im
technischen Maßstab rentabel durchführen
zu können, ist es notwenig, die
Expression und die Fermentation der
Zielenzyme molekularbiologisch und
verfahrenstechnisch zu optimieren.
Stereoselektive Synthese
Feinchemikalien und chirale Vorläufermoleküle,
die in der pharmazeuti-
schen und chemischen Industrie eingesetzt
werden, müssen meist von sehr
hoher Enantiomerenreinheit sein.
Häufig existieren jedoch keine befriedigenden
chemischen Syntheserouten,
die den Anforderungen an die Reinheit
des Produkts und an die Wirtschaftlichkeit
des Prozesses gerecht
werden. In den letzten Jahren wurden
unterschiedliche biokatalytische Systeme
zur Produktion chiraler Feinchemikalien
auch im industriellen Maßstab
etabliert, sodass Substanzen wie
Alkohole, Amide und Aminosäuren
auch im Tonnenmaßstab enatiomerenrein
hergestellt werden können. Durch
den Einsatz von Enzymen können gerade
bei der Synthese chiraler Verbindungen
schwermetallhaltige Katalysatoren
und aufwändige Aufarbeitungsverfahren
vermieden werden. Häufig
eröffnen sich erst durch die Anwendung
von Enzymen wirtschaftliche und
umweltverträgliche Synthesewege für
die Herstellung chiraler Substanzen.
Der Einsatz von Oxidasen für die
Herstellung chiraler Feinchemikalien
wurde bisher wenig untersucht, ob-
Tab. 1: Übersicht über die in dem Projekt zu bearbeitenden Oxidasen.
wohl diese Enzyme hoch stereoselektiv
sind. Der Cofaktor (FAD/FMN) ist
fest gebunden, sodass eine externe
Zugabe nicht erforderlich ist. Für Enzyme
dieser Gruppe ist kein zusätzliches
Coenzym-Regenerierungssystem
erforderlich, da reduziertes FADH 2
oder FMNH 2 durch Sauerstoff reoxidiert
wird.
Bakterielle Oxidasen
Im Rahmen dieses Projekts sollen
drei technisch interessante, FAD-ab-
Enzym E.C. Nummer Organismus Literatur
L-Aminosäureoxidase 1.4.3.2 Rhodococcus opacus DSM43250 [1,2]
D-Aminosäureoxidase 1.4.3.3 Arthrobacter protophormiae DSM15035
NADH-Oxidase 1.6.99.- Lactobacillus brevis DSM20054 [3,4]

Abb. 1: Reaktion der D- und L-Aminosäureoxidasen.
Abb. 2: Reaktion einer S-spezifischen, NAD-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase in Verbindung mit einer NADH-
Oxidase zur Regenerierung von NAD.
hängige Oxidasen untersucht werden,
die zur stereoselektiven Darstellung
verschiedener Feinchemikalien
eingesetzt werden können (Tabelle
1).
Diese Enzyme wurden bei Screeningstudien
identifiziert und nach der
Reinigung und Charakterisierung
wurde ihr präparatives Potenzial untersucht.
Die Aminosäureoxidasen
lassen sich erfolgreich in der Synthese
von Ketosäuren und enantiomerenreiner
Aminosäuren einsetzen,
während die NADH-Oxidase in Kopplung
mit verschiedensten NADH-abhängigen
Dehydrogenasen zur Regenerierung
von NAD verwandt werden
kann (Abbildung 1, 2).
Beim Einsatz von Enzymen im
technischen Maßstab sind die Biokatalysatoren
oft der entscheidende Kostenfaktor.
Aus diesem Grund ist es
wichtig, die Produktion der Enzyme
möglichst kostengünstig zu gestalten.
Die beiden entscheidenden Faktoren
sind die Entwicklung effizienter Expressionssysteme
und die Optimierung
des Herstellungsprozesses.
Verschiedene bakterielle Wirtsstämme
sollen zur heterologen Expression
der Oxidasen vergleichend
untersucht werden und die Optimie-
rung der Kultivierungsbedingungen
soll in parallelen Kleinkultursystemen
ablaufen.
In diesem Projekt wird die RAMOS-
Anlage zur Prozessoptimierung ein-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
89
gesetzt (Abbildung 3). Mit RAMOS
werden die Vorteile von geschüttelten
Bioreaktoren (Parallelansätze;
kostengünstig, einfache Handhabbarkeit)
mit denen von gerührten
Abb. 3: Schüttelkolben, die an das Respiratory Activity Monitoring System
(RAMOS) angeschlossen sind.
Bioreaktoren (Online-Messtechnik)
verknüpft [5]. Damit ist es nun möglich,
in einer frühen Phase der Forschung
und Bioprozessentwicklung
aus den Messdaten extrem hilfreiche
Rückschlüsse auf die Kultivierungsbedingungen
und den physiologischen
Zustand der Mikroorganismen
zu ziehen (Erkennung und Verhinderung
von Limitierungen (z.B.
Sauerstoff) und Inhibierungen, Online-Verfolgung
von mikrobiellen
Kulturen in Schüttelreaktoren, Ermittlung
von Kenngrößen (OTR,
CTR, RQ, m max , k L a) für ein sicheres
Scale Up). Damit führt der Einsatz
der RAMOS-Technologie zu einer
effektiveren und zeitsparenderen
Prozessoptimierung, da bereits auf
dem Level von Schüttelkolben preiswerter
und schneller wichtige Prozessdaten
ermittelt werden können.
Durch die Entwicklung neuer Expressionsstämme
und die Optimierung
ihrer Kultivierungsbedingungen
soll in einem ersten Projektabschnitt
die kostengünstige Herstellung
der drei Oxidasen ermöglicht
werden.
Literatur
[1] Geueke, B., Hummel, W., Enzyme
Microbial Technology 31 (2002), 77-
87.
[2] Geueke, B., Hummel, W., Protein
Expression Purification 28 (2003),
303-309.
[3] Hummel, W., Riebel, B., Biotechnology
Letters 25 (2003), 51-54.
[4] Geueke, B., Riebel, B., Hummel, W.,
Enzyme Microbial Technology 32
(2003), 205-211.
[5] Anderlei, T., Büchs, J., Biochemical
Engineering Journal 7 (2001), 157-162.
Korrespondenzadresse
Dr. Tibor Anderlei
Prof.-Rehm-Str. 1
D-52428 Jülich
Tel.: 024 61-980 119
Fax: 024 61-980 450
eMail: t.anderlei@acbiotec.com

90 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
EXTREMOPHILE
Das thermoalkaliphile Bakterium
Anaerobranca gottschalkii als Quelle
stabiler Enzyme zur Herstellung
hochwertiger Kohlenhydrate
� Volker Thiemann1 , Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian1 , Dr. Hans-Peter Klenk2 , Angela Vollstedt3 , Prof. Dr. Roland Freudl3 , Catharina Jürgens4 , Prof. Dr.
Reinhard Sterner4 , Prof. Dr. Wolfgang Liebl5 1 2 3 4 5 TU-Hamburg-Harburg, e.gene Biotechnologie GmbH, Forschungszentrum Jülich GmbH, Universität zu Köln, Universität Göttingen
Ziel des DBU-Projekts „Hochwertige Kohlenhydrate“ ist die Identifizierung der für die Kohlenhydrat-prozessierenden Enzyme kodierenden Gene des
thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii, ihre rekombinante Expression und der Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Herstellung
hochwertiger Kohlenhydrate. Hierzu wurde das Genom von A. gottschalkii mit der Shotgun-Technik partiell sequenziert, wobei ca. 95 % der Sequenzinformation
des Genoms erfasst werden konnten. Zur rekombinanten Herstellung der Enzyme wurden die Wirtsorganismen Staphylococcus carnosus und
Escherichia coli verwendet. Die Enzyme Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Pullulanase, Verzweigungsenzym sowie zwei α-Amylasen wurden gereinigt,
charakterisiert und werden zurzeit auf ihre biotechnologische Anwendbarkeit getestet. Die Eigenschaften ausgewählter Enzyme sollen gegebenenfalls
über gerichtete Evolution oder rationales Proteindesign optimiert und zur Herstellung hochwertiger Kohlenhydrate eingesetzt werden.
Keywords: thermoalkaliphile Bakterien, sekretorische Expression, Enzymoptimierung.
Einleitung
Extremophile Mikroorganismen
wachsen optimal bei extremen Temperaturen,
pH- Werten, Salzgehalten
oder Drücken. Viele Enzyme dieser
Mikroorganismen weisen Eigenschaften
auf, die neue, vielversprechende
Potenziale für die biotechnologische
Anwendung bergen. Beispielsweise
weisen die Enzyme extrem thermophiler
(60-70°C) und hyperthermophiler
(80-110°C) Mikroorganismen
neben einer hohen Thermostabilität
im Allgemeinen eine relativ hohe Beständigkeit
gegenüber denaturierenden
Chemikalien, wie Detergenzien,
chaotropen Reagenzien, organischen
Lösungsmitteln, sowie gegenüber extremen
pH-Werten auf [1,2] .
Das aus dem heißem Sodasee „Lake
Bogoria“ isolierte Bakterium Anaerobranca
gottschalkii vereint zwei Extreme
miteinander. Es wächst optimal
bei pH 9,5 und 55°C [3]. Zusammen
mit der Tatsache, dass A. gottschalkii
verschiedene Kohlenhydrate als Substrate
nutzen kann, nimmt das Bakterium
aus diesem Grund unter den extremophilen
Mikroorganismen eine
Sonderstellung ein.
Stärke beispielsweise spielt in der
Lebensmittelindustrie eine herausra-
gende Rolle. Unter dem Sammelbegriff
„Modifizierte Stärke“ findet sich diese
hochwertige Kohlenhydratquelle in
vielen Lebensmitteln wieder. Zur Modifikation
von Stärke werden z.B.
Amylasen und Verzweigungsenzyme
eingesetzt. Mit Hilfe thermostabiler,
Stärke-modifizierender Enzyme kann
die Stärkeveredelung gezielter und
effizienter durchgeführt werden, da
beispielsweise die Raum-Zeit-Ausbeute
bei hohen Temperaturen aufgrund
der höheren Löslichkeit der Stärke
wesentlich besser ist. Darüber hinaus
ist Stärke das Substrat für die Herstellung
der aus 6, 7 bzw. 8 Glucoseeinheiten
bestehenden α-, β und γ-Cyclodextrine.
Diese finden, vorwiegend
aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene
hydrophobe Moleküle zu komplexieren,
in einer großen und noch stets
wachsenden Anzahl an industriellen
Prozessen und Produkten Anwendung.
In der Pharmaindustrie beispielsweise
werden Cyclodextrine zur
Einkapselung von Wirkstoffen verwendet,
in der Lebensmittelindustrie werden
sie zur Aromastabilisierung genutzt.
Wie kürzlich nachgewiesen wurde,
bilden einige CGTasen [4] sowie
Amylomaltasen [5] und Verzweigungsenzyme
[6,7,8] mit Stärke als
Substrat cyclische Ringe, die aus mehr
als 8 Glucoseeinheiten bestehen. Von
diesen konnte gezeigt werden, dass sie
in der Lage sind, die Ausfällung (Retrogradation)
von Stärke zu minimieren
und Proteinlösungen zu stabilisieren
[9].
Ziel des Verbundprojekts „Hochwertige
Kohlenhydrate“ ist die Identifizierung
der Gene von Anaerobranca
gottschalkii, welche die Kohlenhydrat-prozessierenden
Enzyme kodieren
und deren rekombinante Expression.
Nach Aufreinigung der Enzyme
sollen diese charakterisiert und
auf ihre biotechnologische Anwendbarkeit
hin untersucht werden. Vielversprechende
Kandidaten sollen im
Anschluss gegebenenfalls über gerichtete
Evolution und rationales Proteindesign
optimiert werden.
Partielle Genomanalyse zur
Identifizierung
biotechnologisch
interessanter Enzyme
Für die schnelle Identifizierung von
Genen, die für potenziell biotechnologisch
interessante Enzyme kodieren,
empfiehlt sich die Partialsequenzierung
des Genoms mit der nun etablierten
Shotgun-Technik. Mit einer guten,
d. h. statistisch gleichmäßig ver-
teilten, Plasmidbibliothek kann man
z. B. bei dreifacher Sequenzabdekkung
ca. 95% der Sequenz eines mikrobiellen
Genoms erfassen. Für eine
effiziente und kostengünstige Sequenzermittlung
sind zudem lange Leseweiten
(>600 nt) und qualitativ hochwertige
Sequenzen (< 1 Fehler pro 1000
nt Rohsequenz) erforderlich. Durch
den Einsatz von automatischen Annotationssystemen
(z. B. PEDANT oder
MAGPIE) lässt sich auf den Sequenzbruchstücken
(Contigs) eines Genoms
zwar nicht der komplette Satz aller
Gene identifizieren, aber doch ein sehr
hoher Anteil daran. Einige Gene werden
in den verbleibenden Lücken versteckt
liegen, andere sind nur zu sehr
kleinen Teilen sequenziert und können
daher nicht durch Sequenzvergleiche
mit Datenbanken identifiziert
werden. Für das Verständnis des Metabolismus
eines Organismus aus dessen
Genomsequenz heraus ist es überaus
hilfreich, auch die in Spezialdatenbanken
zusammengetragene Information
über Stoffwechselwege einzubeziehen
(Kyoto Encyclopedia of Genes
and Genomes, KEGG, www.tokyocenter.genome.ad.jp/kegg/).
Bei einem gezielten Genomanalyseansatz
zur Suche nach biotechnologisch
wertvollen neuen Enzymen ist es

nicht von Interesse, die Sequenz jedes
Gens im Genom zu vervollständigen.
Nur die für weitere funktionelle
Analysen ausgewählten Gene müssen
vollständig aufgeklärt werden. Die
Komplettierung dieser Gene aus Sequenzfragmenten
ist meist einfach, da
aus der Shotgun-Sequenzierungsphase
zahlreiche Plasmide vorliegen, welche
die Sequenzlücken abdecken.
Durch Sequenzierung mit spezifischen,
aus den bekannten Sequenzbruchstücken
abgeleiteten Primern
lassen sich die potenziell wertvollen
Gene rasch und preiswert vervollständigen.
Die Konstruktion einer Bibliothek
mit großen DNA-Inserts (Cosmide
oder BACs) – für die Vollsequenzierung
von Genomen meist unverzichtbar
– ist hier nicht erforderlich.
Zwar kann man die Anordnung der
Gene im partialsequenzierten Genom
über Contigreihen nur bedingt und
meist in über hundert Fragmenten
bestimmen, doch ist die Information
über großräumige Zusammenhänge
der Genanordnung nur bedingt von
Interesse, wenn ein Projekt primär die
möglichst kostengünstige und rasche
Identifizierung neuer enzymkodierender
Gene zum Ziel hat.
Bei der Partialsequenzierung des
Genoms von Anaerobranca gottschalkii
wurden in insgesamt ca.
15.000 Sequenzierungsansätzen
knapp 12.000 brauchbare Sequenzen
mit einer Rohsequenz von ca. 12 Mbp
generiert. Die Sequenz wies bei 3,65
facher Sequenzabdeckung einen Fehler
pro 6.800 bp auf. Nach dem Schließen
einiger Sequenzlücken mittels
PCR konnte die Sequenz in 510 Contigs
mit einer Gesamtbasenzahl von
1,92 Mbp assembliert werden. Nach
der automatisch vorgenommenen und
manuell überprüften Annotation wurden
1.956 offene Leseraster (open
reading frames, ORFs) identifiziert.
Ein Vergleich dieser mit ca. zwei Dutzend
mikrobiellen Genomen ergab
Homologien zu 78 % der ORFs. Unter
diesen konnten auch 93 putative Gene
des Kohlenhydratmetabolismus identifiziert
werden
Staphylococcus carnosus:
Ein mesophiles
Wirtssystem für die
sekretorische Expression
von Kohlehydratumwandelnden
Enzymen
aus Anaerobranca
gottschalkii
Der Einsatz von Enzymen aus Anaerobranca
gottschalkii in industriellen
Prozessen zur Herstellung hoch-
Abb. 1: Sec- und Tat-Weg: Zwei alternative Möglichkeiten zur Ausschleusung
von Proteinen in den Kulturüberstand Gram-positiver Bakterien.
Sec-abhängige Proteine werden in entfalteter Form über die Membran
transportiert und nehmen anschließend ihre gefaltete Konformation ein.
Im Gegensatz dazu werden Tat-abhängige Proteine in vollständig gefalteter
Form über die Membran transportiert, was eine Unterstützung der Faltungsvorgangs
durch cytosolische Chaperone möglich macht. Rot:
Signalpeptide; blau: reifer Teil der Exportproteine; RR: Zwillingsarginin-
Motif im Tat-Signalpeptid.
wertiger Kohlehydrate setzt voraus,
dass die jeweils benötigten Biokatalysatoren
in ausreichender Menge zur
Verfügung stehen. Es ist daher von herausragendem
Interesse, effiziente Expressionssysteme
für die Gewinnung
der Anaerobranca-Enzyme zu etablieren,
vorzugsweise auf der Basis
mesophiler Wirtsbakterien.
Prinzipiell sind zwei verschiedene
Möglichkeiten zur heterologen Expression
der Anaerobranca-Enzyme
im gewählten Wirtssystem denkbar:
Intrazelluläre Expression sowie die
Sekretion der Enzyme in den Kulturüberstand.
Die weit verbreitete Expression
von heterologen Proteinen
im Cytosol eines Wirtsorganismus
führt in vielen Fällen zu sehr großen
Proteinmengen, was jedoch sehr häufig
die Bildung von Aggregaten, den
sog. „Inclusion bodies“, zur Folge hat.
Aggregierte Proteine sind oft enzymatisch
inaktiv. Die Inclusion bodies
müssen in aufwändigen Verfahren
renaturiert werden, was oft nicht oder
nur teilweise gelingt. Ein weiterer
Nachteil der intrazellulären Expression
ist die Notwendigkeit eines Zellaufschlusses,
was eine Verunreinigung
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
91
des gewünschten Proteins mit wirtszelleigenen
Proteinen nach sich zieht.
Die Sekretion der Anaerobranca-Enzyme
in den Kulturüberstand des gewählten
Wirtsorganismus stellt daher
eine attraktive Alternative zur intrazellulären
Expressionsvariante dar. Die
Vorteile einer sekretorischen Expression
bestehen vor allem im Wegfall der
Notwendigkeit eines Zellaufschlusses,
der Reduzierung der Gefahr der Bildung
von Inclusion bodies sowie der
biologischen Abtrennung des Zielproteins
vom zelleigenen Protein, was
eine signifikante Produktanreicherung
zur Folge hat.
Für die sekretorische Gewinnung
von Anaerobranca-Enzymen bieten
sich Gram-positive Bakterien als vielversprechende
Wirtsorganismen an,
da sie, aufgrund des Fehlens einer
äußeren Membran, die gewünschten
Proteine direkt in den Kulturüberstand
freisetzen können [10]. Die Fähigkeit
Gram-positiver Bakterien zur effizienten
Sekretion von Proteinen wird
schon seit langem in der Waschmittel-
und Lebensmittelindustrie für die
Gewinnung einer Vielzahl von zumeist
wirtseigenen, hydrolytischen Enzymen
(Proteasen, Lipasen, Amylasen) ausgenutzt.
Bei den hierbei eingesetzten
Bakterien handelt es sich zumeist um
Bacillus Arten, die jedoch aufgrund
ihrer hohen intrinsischen Proteaseaussscheidung
als Wirtsorganismen
für die sekretorische Gewinnung heterologer
Protein nicht in Frage kommen.
Für die sekretorische Produktion
von proteaselabilen heterologen
Proteinen bieten sich daher vor allem
Gram-positive Bakterien an, die keine
Proteaseaktivität im Kulturüberstand
aufweisen. Einer der Organismen
der diese Voraussetzung erfüllt,
ist das bei der Wurst- und Fleischreifung
als Starterkultur eingesetzte
Gram-positive Bakterium Staphylococcus
carnosus. An verschiedenen
Beispielen konnte bereits gezeigt werden,
dass dieses Wirtssystem sich besonders
für die sekretorische Gewinnung
heterologer Proteine eignet und
dass sich, nach Optimierung der Kultivierungsbedingungen,
Ausbeuten
von bis zu 2 g Protein/Liter Kulturüberstand
erzielen lassen [11].
Sekretorische Proteine werden als
höhermolekulare Vorläuferproteine
mit einem aminoterminalen Signalpeptid
synthetisiert. Das Signalpeptid
sorgt für die Einschleusung des entsprechenden
Proteins in den Exportweg
und wird im Anschluss an den
Membrantransport durch spezifische
Proteasen, die so genannten Signalpeptidasen,
vom reifen Teil des sekretorischen
Proteins wieder abgespalten.
Der eigentliche Membrantransport
wird durch membranständige
Multiproteinkomplexe („Translokasen“)
katalysiert. Die überwiegende
Mehrzahl der zellulären Exportproteine
wird über den generellen Proteinexportweg,
den „Sec“-Weg, durch die
Cytoplasmamembran transportiert
[12]. Neuere Arbeiten zeigten jedoch,
dass es neben dem Sec-Weg noch einen
weiteren Exportweg gibt, nämlich
den „Tat“-Weg, der vor allem von Cofaktor-haltigen
Redoxenzymen für die
Membrantranslokation benutzt wird
[13]. Signalpeptide des Tat-Wegs besitzen
im Gegensatz zu Sec-Signalpeptiden
ein charakteristisches Sequenzmotif,
dessen herausragendes Merkmal
zwei aufeinanderfolgende Arginin-Reste
sind, welche dem Weg seinen
Namen (Twin-Arginine Translocation)
gaben. Sec-abhängige Proteine
werden in entfalteter Form über die
Membran transportiert und nehmen
ihre native Konformation erst nach
erfolgter Membranpassage ein. Im
Gegensatz dazu besitzt der Tat-Weg die
Eigenschaft, bereits fertig gefaltete
(und sogar multimere) Proteine ex-

92 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 2: Bereits rekombinant produzierte Stärke-umsetzende Enzyme aus Anaerobranca gottschalkii und die von
ihnen katalysierten Reaktionen. In Klammern angegeben die jeweiligen Wirtsorganismen.
portieren zu können (Abb. 1). Da die
Faltung von Proteinen außerhalb des
Cytosols aufgrund des Fehlens von
generellen Chaperonen einen schwerwiegenden
Engpass bei der heterologen
Proteinsekretion über den Sec-
Weg darstellt, bietet der Tat-Weg eine
vielversprechende alternative Möglichkeit
zur sekretorischen Produktion
heterologer Proteine. Die Tat-abhängige
Sekretion erlaubt eine Unterstützung
der Faltung der heterologen
Proteine durch die generellen Chaperone
im Cytosol und den Transport
der Proteine im Anschluss an die erfolgte
Faltung, wobei der oben erwähnte
Engpass bei der Sec-abhängigen
Proteinsekretion umgangen
werden kann [14].
Im Rahmen des Teilprojekts
„Hochwertige Kohlehydrate“ des
DBU-Verbundvorhabens „Biokatalyse“
wurde die Eignung des mesophilen
Gram-positiven Bakteriums S.
carnosus für die sekretorische Gewinnung
ausgewählter Enzyme aus A.
gottschalkii untersucht. Die Anaerobranca-Enzyme
wurden an Signalpeptide
angehängt, die entweder eine
Einschleusung in den Sec-Weg oder
in den Tat-Weg vermitteln. Die entsprechenden
Fusionsgene wurden in
S. carnosus eingebracht und die so
erhaltenen rekombinanten Stämme
anschließend auf Expression und Lokalisierung
der gebildeten Genprodukte
durch eine Vielzahl von Methoden
(Zellfraktionierung, Proteaseverdau
von Protoplasten, Aufnahme von
Exportkinetiken durch Pulse-Chase-
Experimente, Aktivitätsbestimmungen)
vergleichend untersucht. Es
zeigte sich, dass in allen untersuchten
Fällen sowohl mit Hilfe eines Sec-
Signalpeptids wie auch mit Hilfe eines
Tat-Signalpeptids eine Freisetzung
der Enzyme in den Kulturüberstand
der jeweiligen S. carnosus Stämme
erreicht werden konnte. Interessanterweise
zeigte sich, dass die Verwendung
eines Tat-Signalpeptids im Vergleich
zur Sec-abhängigen Membrantranslokation
zu signifikant höheren
Ausbeuten führte. Dies lässt darauf
schließen, dass es für die Anaerobranca-Enzyme
besonders vorteilhaft
ist, die faltungsunterstützende Funktion
der cytosolischen Chaperone
auszunutzen und das native Enzym
erst im Anschluss an die Faltung über
den Tat-Weg aus der Zelle auszuschleusen.
Dennoch war zu beobachten,
dass trotz erfolgreicher Sekretion
der Anaerobranca-Enzyme in den
Kulturüberstand noch signifikante
Mengen aktiven Enzyms in der Zellfraktion
verblieben. Dies deutet darauf
hin, das die bisher erzielten Ausbeuten
aufgrund von Engpässen innerhalb
der Sekretionswege noch
unterhalb der theoretisch erreichbaren
Ausbeuten liegen. Die Identifizierung
dieser Engpässe und deren Umgehung
ist das Ziel momentan laufender
und zukünftiger Arbeiten.
Heterologe Expression,
Reinigung und
Charakterisierung der
rekombinanten Enzyme
Fünf Stärke-umsetzende Enzyme aus
Anaerobranca gottschalkii wurden
bislang erfolgreich rekombinant produziert
(Abb. 2). Das Verzweigungsenzym
wurde in Staphylococcus carnosus
exprimiert, während für die
Produktion der zwei α-Amylasen und
der Pullulanase E. coli als Wirt verwendet
wurde. Die CGTase konnte in
beiden Wirtsorganismen in aktiver
Form exprimiert werden. Zurzeit werden
die Enzyme hinsichtlich ihrer biotechnologischen
Anwendbarkeit untersucht.
Die Temperaturoptima der extrazellulären
Enzyme CGTase, Pullulanase
und α-Amylase lagen mit 65°C bzw.
70°C ca. 10°C über der optimalen
Wachstumstemperatur von Anaerobranca
gottschalkii. Die pH-Optima
der Amylase und der Pullulanase lagen
mit pH 8,0 bzw. pH 8,5-9 ebenfalls
in der Nähe des pH-Optimums
von A. gottschalkii. Die CGTase wies
in einem weiten pH-Bereich (pH 4-
10) nahezu gleich hohe Aktivität auf.
Weniger temperatur- und pH-stabil
waren hingegen das intrazelluläre
Verzweigungsenzym und die intrazelluläre
α-Amylase, die Temperaturund
pH-Optima von 50°C und pH 7
bzw. 55°C und pH 6 aufwiesen.
Die thermische Stabilität der CGTase
wurde neben der Messung der Restaktivität
nach Inkubation des Enzyms
bei unterschiedlichen Temperaturen
über Differential Scanning Calorimetrie
(DSC) analysiert. Die DSC-Messungen
zeigen eine mehrphasige Auffaltung,
wobei die Schmelztemperatur
(Tm) des Hauptpeaks bei 66°C
lag und unabhängig von der Scanrate
(zwischen 0,1 und 1°C/min) und dem
pH-Wert (zwischen pH 8 und pH 10)
war. In Anwesenheit von 5mM CaCl 2
erhöhte sich der Tm-Wert jedoch auf
69°C. Das Substrat Stärke zeigte ebenfalls
eine stabilisierende Wirkung, da
die Halbwertszeit der irreversiblen
thermischen Inaktivierung bei 70°C
in Abwesenheit von Stärke nur ca. 1
min betrug, jedoch bei derselben
Temperatur in Anwesenheit von 20 %
Stärke auch nach 240 min noch signifikante
Aktivität nachweisbar war
(Abb. 3). In der Anfangsphase der
Reaktion wurde bei allen untersuchten
Temperaturen und pH-Werten
relativ am meisten α-CD gebildet. Im
Verlauf der Reaktion stieg der relative
Anteil an gebildetem β-CD deutlich
und der des γ-CD geringfügig an.
Beide α-Amylasen waren calciumunabhängig
und zeigten die höchste
Hydrolyseaktivität mit Amylose als
Substrat. Mit Maltooligosacchariden
zeigte die extrazelluläre α-Amylase
bemerkenswert hohe Transferaseaktivität.
Die Pullulanase gehört zu den
Typ I-Pullanasen. Die Typ I-Pullulanasen
spalten spezifisch die α-1,6
Bindungen in den Polymeren Pullulanan,
Amylopektin und Glykogen. In
Anwesenheit von 0,5 % SDS, 20 %
Tween und 50 % Triton X-100 war die
Pullulanase völlig beständig.
Die Umwandlung von Amylose zu
verzweigten Produkten durch das Verzweigungsenzym
wurde mit Größenausschlusschromatographieanalysiert.
Dabei zeigte sich, dass das Verzweigungsenzym
bevorzugt Ketten mit
einer Länge von 6- 60 Glucoseeinheiten
transferiert.
Veränderung der Funktion
und Stabilität von
Enzymen durch rationales
Design und gerichtete
Evolution
Seit einiger Zeit ist es möglich, die Eigenschaften
von Enzymen gezielt zu
verändern. Dies hat zum einen zu einem
besseren Verständnis der natürlichen
Evolutionsprozesse von Enzymen
geführt [15]. Zum anderen ist
es möglich geworden, biotechnologisch
relevante Enzymen zu erzeugen,
die in industriellen Verfahren eingesetzt
werden können [16]. Es gibt
zwei prinzipiell unterschiedliche Ansätze
zur Veränderung von Enzymen,
rationales Design und gerichtete
Evolution [17]. Rationales Design
setzt die genaue Kenntnis der Struktur
und Funktion eines Enzyms voraus.
Aufbauend auf diesem Wissen,
werden Aminosäuren an sorgfältig
ausgewählten Positionen durch gerichtete
Mutagenese gezielt ausgetauscht.
Mit dieser Strategie ist es
unter anderem gelungen, die Substratspezifitäten
von Enzymen zu verändern
bzw. ihre Thermostabilitäten
zu erhöhen [17,18]. In vielen anderen
Fällen ist rationales Design jedoch
gescheitert. Dies liegt vor allem dar-

an, dass wegen der Komplexität von
Enzymen auch bei genauer Kenntnis
der Struktur die Auswirkung eines
Aminosäureaustauschs auf seine
Funktion nicht exakt vorhergesagt
werden kann. Diesem Problem trägt
der Ansatz der gerichteten Evolution
Rechnung, der sich am Prozess der
natürlichen Evolution orientiert. Dabei
ist eine genaue Kenntnis der
Struktur-Funktionsbeziehung prinzipiell
nicht erforderlich. Bei der gerichteten
Evolution wird durch den
zufälligen Einbau von Mutationen in
das Wildtyp-Gen zunächst ein großes
Repertoire an Genvarianten hergestellt.
Anschließend werden die Genvarianten
in einem passenden Wirtsorganismus
nach den neuen Eigenschaften
selektiert oder gescreent.
Der Prozess von Mutation und Selektion/Screening
kann über mehrere
Runden durchgeführt und so lange
wiederholt werden, bis weitere Verbesserungen
nicht mehr möglich sind
bzw. nicht mehr detektiert werden
können. So können durch schrittweise
Erzeugung kleiner Verbesserungen
über viele Generationen hinweg erhebliche
Änderungen in Funktion und
Stabilität von Enzymen erreicht werden.
Durch gerichtete Evolution wurden
in jüngster Zeit die Löslichkeiten
von Enzymen verbessert, Enantioselektivitäten
gesteigert und erhöhte
Stabilitäten gegenüber thermischer
Inaktivierung erzielt [16,18,19]. Als
besonders erfolgreich bei der gerichteten
Evolution neuer enzymatischer
Eigenschaften hat sich der Einsatz
kombinatorischer Methoden erwiesen,
wie z.B. das „DNA-Shuffling“
[20]. Hierbei wird die DNA aller her-
Abb. 3: Cyclodextrinbildung der rekombinanten CGTase mit 20 % Paselli-
Stärke als Substrat bei 70°C und pH 8,5 in Anwesenheit von 5 mM Ca 2+ .
gestellten Genvarianten einem partiellen
Verdau unterzogen. Anschließend
werden die Fragmente durch
eine PCR ohne externe Primer sukzessive
wieder zu vollständiger Länge
amplifiziert. Dieses Vorgehen kann zu
einer sehr schnellen und drastischen
Verbesserung der Eigenschaften der
gewünschten enzymatischen Eigenschaften
führen [21].
Über DNA-shuffling konnte eine
thermostabilere Mutante der CGTase
hergestellt werden, die zur Zeit charakterisiert
wird.
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Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
93
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Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian
TU Hamburg-Harburg
Technische Mikrobiologie
Kasernenstraße 12
D-21073 Hamburg
Tel.: 040-42878 3117
Fax: 040-42878 2582
eMail: antranikian@tuhh.de

94 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
LIPASEN
Einsatz effizienter
Expressionssysteme und
Membranverfahren: Produktion
von Biokatalysatoren aus
extremophilen Mikroorganismen
� Dr. Karen Sonnenberger1 , Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian1 , Prof. Dr. Roland Freudl2 , Prof. Dr. Horst Chmiel3 , Dr. Ralph Nonninger4 , Dr. Thomas
Schäfer5 1 2 3 Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg, Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich GmbH, Gesellschaft für
umweltkompatible Prozesstechnik mbH, Saarbrücken, 4 ItN-Nanovation GmbH, Saarbrücken, 5 Department Bacterial Discovery Unit, Novozymes A/S,
Dänemark
Die Natur hat eine große Diversität an Syntheseprozessen entwickelt, die an Spezifität und Effizienz nicht zu übertreffen sind. Dieses Potenzial wird bis
heute kaum genutzt. Der Grund dafür ist meist die mangelnde Übertragung der Erkenntnisse vom Labor- auf den Industriemaßstab. Am Beispiel von Lipasen
soll modellhaft die Überproduktion von Enzymen aus extremophilen Mikroorganismen in mikrobiellen Produktionsstämmen demonstriert werden.
Durch die Verwendung neuartiger Keramikmembranen und innovativer Fermentationstechniken sollen sowohl kälteaktive als auch hitzestabile Lipasen
mit besonderen Eigenschaften, z. B. Enantioselektivität, bis zur Produktreife für den industriellen Einsatz gebracht werden.
Keywords: Biokatalysatoren, extremophil, Expression, Sekretion, Lipasen, Fermentation.
Anlass und Zielsetzung
Biokatalysatoren werden von der Industrie
zunehmend eingesetzt, um
chemische Herstellungsprozesse zu
ersetzten, da hieraus sowohl ökologische
wie auch ökonomische Vorteile
erwachsen. Für viele Prozesse stehen
aber noch keine geeigneten Enzyme
zur Verfügung. Extremophile
Mikroorganismen besitzen aufgrund
Ihrer Anpassung an ungewöhnliche
Lebensräume besonders viele Enzyme
mit industriell interessanten Eigenschaften,
wie z. B. Thermostabilität
oder Aktivität bei sehr hohen oder
niedrigen pH-Werten [1]. Die von
Ihnen katalysierten Reaktionen laufen
oft sehr enantioselektiv ab, was
zu hochreinen Produkten führt. Dies
ist z. B. besonders für die pharmazeutische
Industrie von Interesse, da bei
manchen Wirkstoffen nur ein Enantiomer
therapeutisch wirksam ist. Da
sich die biotechnologisch relevanten
Biokatalysatoren oftmals nicht in ausreichenden
Mengen aus den Ursprungsorganismen
gewinnen lassen,
mit Hilfe rekombinanter Organismen
notwendig und kann so der steigenden
Marktnachfrage in Zukunft gerecht
werden. Ausschlaggebend bei
der Produktion rekombinanter Enzyme
ist die Entwicklung effizienter Expressionssysteme,
mit denen Biokatalysatoren
aus Mikroorganismen in
mesophilen Wirtsorganismen in großem
Maßstab hergestellt werden können.
Das Projektziel ist es, am Beispiel
von Lipasen aus extremophilen Mi-
ist eine effektive Enzymproduktion Abb. 1: Triglyceridspaltung durch Lipase.
kroorganismen modellhaft die rekombinante
Expression in mesophilen
mikrobiellen Produktionsstämmen
(z.B. Staphylococcus carnosus,
Bacillus subtilis, Pichia pastoris)
bei gleichzeitig verbesserter Sekretion
der Enzyme sowie einer optimierten
Fermentation zu demonstrieren.
Das Projekt wird in Kooperation
mit dem Forschungszentrum
Jülich, das sich seit vielen Jahren mit
der Optimierung der Enzymsekretierung
beschäftigt und mit den Firmen
Novozymes A/S, Gesellschaft für umweltkompatible
Prozesstechnik mbH
und ItN-Nanovation GmbH durchgeführt.
Die beiden letztgenannten Firmen
arbeiten an der Entwicklung
neuartiger Keramikmembranen, die
im Fermentationsprozess zu einer
Produktionsoptimierung beitragen
werden.
Lipasen – Bedeutung und
Anwendung
Fette machen einen großen Teil der
Biomasse aus. Der Abbau von Fetten
erfolgt durch fettspaltende Enzyme,
die Lipasen (Triacylglycerol-Acylhydrolasen),
welche die Hydrolyse von
Triacylglyceriden zu Glycerol und
freien Fettsäuren katalysieren (Abbildung
1). Die Lipasen gehören zu einer
großen Familie phylogenetisch
verwandter Proteine. Sie sind weit
verbreitet in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen.
Zurzeit sind ca. 400
Proteinsequenzen von Lipasen bekannt
[2]. Die größte Quelle von
neuen Biokatalysatoren sind die mikrobiellen
Lipasen. Darunter befin-

Abb. 2: Lichtmikroskopische Aufnahme einer Lipase-produzierenden psychrophilen
Hefe.
den sich auch eine Reihe von Lipasen
aus extremophilen Mikroorganismen
mit für die Industrie besonders
interessanten Eigenschaften, wie
z. B. hohe Thermostabilität oder
Enantioselektivität (Abb. 2).
Die größte kommerzielle Anwendung
finden hydrolytische Lipasen als
Zusatzstoffe in Detergenzien für
Haushalt und Industrie. In der Lebensmittelindustrie
werden z. B. Lipasen
für die Anreicherung von
mehrfach ungesättigten Fettsäuren
aus tierischen und pflanzlichen Lipiden
eingesetzt. Auch Phospholipasen
sind von großem Interesse, da sie
hervorragende Emulgatoren sind, die
in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie
benötigt werden. Anwendungsbeispiele
im großen techni-
schen Maßstab gibt es allerdings bisher
nur wenige. Es steht also ein umfangreiches,
ungenutztes Potenzial zu
Verfügung.
Hohe
Biokatalysatorenausbeute
durch optimierte Sekretion
Um eine optimale Sekretion der rekombinant
exprimierten Enzyme zu
erreichen, sollen die Gram-positiven
Bakterien Bacillus subtilis und Staphylococcus
carnosus eingesetzt werden,
da aufgrund einer fehlenden äußeren
Membran Proteine direkt in
den Kulturüberstand freigesetzt werden
können. Für die Sekretion von
Proteinen sind zwei bakterielle Proteinexportwege
(Sec- und Tat-Weg)
Abb. 3: 300 l-Fermentationsreaktor für die Überproduktion rekombinanter
Enzyme durch Mikroorganismen.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
95
bekannt. Dabei handelt es sich um
Multiproteinkomplexe, deren Aufgabe
bei der Sekretion der Transport
über die Zellmembran ist [3]. Der Tat-
Weg unterscheidet sich vom Sec-Weg
hauptsächlich dadurch, dass hier bereits
fertig gefaltete Proteine durch die
Membran geschleust werden. Untersucht
werden soll für beide Wege der
Einfluss verschiedener Signalpeptide
auf die Sekretion heterologer Proteine.
Weiterhin ist geplant, durch eine
lokalisierte Mutagenese des entsprechenden
Genbereichs der Signalpeptide
eine erhöhte Sekretion zu erzielen.
Neuartige
Keramikmembranen im
Fermentationsprozess
Durch eine optimierte Prozessführung
lassen sich die Enzymausbeuten
in rekombinanten Produktionsstämmen
signifikant erhöhen. Die
Übertragung biotechnologischer
Produktionsverfahren vom Labormaßstab
in den industriellen Maßstab
scheitert oft an der kontinuierlichen
Entfernung des Produkts
aus dem Bioreaktor. Durch die Integration
neuartiger Module mit
keramischen Mehrkanal-Flachmembranen
in den Fermenter besteht
die Möglichkeit, schon während
der Fermentation Kulturmedium
mit dem rekombinanten Enzym
zu entnehmen und gleichzeitig
die produzierenden Mikroorganismen
(Abb.3) im Fermenter zu-
rückzuhalten. Hierfür werden die
Membranen hinsichtlich Trenneigenschaften
(Porendurchmesser)
und geringer Wechselwirkung mit
dem Kulturmedium (Fouling) optimiert
sowie geeignete sterilisierbare
Module entwickelt (Abb.4)
[4]. Da diese direkt in den Fermenter
getaucht werden, können
die Nachteile eines externen Membrankreislaufs
(Scherkräfte, Stoffgradienten)
eliminiert werden. Außerdem
kann jeweils ein Teil der
Membranmodule genutzt werden,
um dem Fermenter wieder frisches
Medium zuzuführen.
Abb. 4: Anordnung keramischer Vielkanal-Flachmembranen in einem Labormodul.
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Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian
TU Hamburg-Harburg
Technische Mikrobiologie
Kasernenstr. 12
D-21073 Hamburg
Tel./Fax: 040-42878 3117 / 2582
eMail: antranikian@tuhh.de
Web: www.icbio.de

96 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
PYRUVAT
Pyruvat-Produktion aus Glucose
mit rekombinanten Escherichia
coli-Stämmen
� Dr. Ralf Takors2 , Dipl.-Ing. Bruno Zelić 2 , Dr. Tanja Gerharz1 , Prof. Dr. Michael Bott 1
1 2 Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich, 52425 Jülich; Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum Jülich, 52425 Jülich
Um ein effizientes mikrobielles Verfahren zur Produktion von Pyruvat aus Glucose zu etablieren, wurde ein rekombinanter Escherichia coli-
Stamm konstruiert, der vollständig in seiner Fähigkeit blockiert ist, Pyruvat in Acetyl-CoA, Acetat oder Lactat umzuwandeln. Im Schüttelkolben
setzte dieser Acetat-auxotrophe E. coli-Stamm YYC202ldhA Glucose praktisch vollständig (>1,9 Mol/Mol) in Pyruvat um und schied das Produkt
ins Medium aus. Bei Fed-batch-Kultivierung im Fermenter mit Glucose- und Acetat-Regelung konnten maximal 62 g/l Pyruvat bei einer
Raum-Zeit-Ausbeute von 42 g/l/d und einer integralen Pyruvat/Glukose-Ausbeute von 1,1 Mol/Mol erreicht werden. Aufgrund einer Hemmung
der Produktbildung bei hohen Pyruvat-Konzentrationen (> ca. 350 mM) sowie zur Steigerung der molaren Ausbeute wurde eine repetitive Fedbatch-Prozessführung
realisiert, bei der molare Ausbeuten bis zu 1,78 Mol Pyruvat/Mol Glucose bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 145 g/l/d
erreicht wurden. Diese Werte liegen deutlich über denen von alternativen mikrobiellen Pyruvat-Produktionsverfahren, wie z. B. mit Torulopsis
glabrata, und machen in Kombination mit einer Reihe weiterer Vorteile eine technische Umsetzung des Verfahrens attraktiv.
Einleitung
Pyruvat ist ein zentrales Zwischenprodukt
des Stoffwechsels aller Zellen
und an einer Vielzahl von enzymatischen
Reaktionen involviert. Daneben
besitzt Pyruvat auch eine wirtschaftliche
Bedeutung bei chemischen Synthesen,
beispielsweise als Ausgangs-
substrat bei der industriellen Herstellung
der Aminosäuren L-Tryptophan,
L-Tyrosin oder L-Dihydroxyphenylalanin
(L-Dopa) [1].
Klassisch wird Brenztraubensäure
durch Dehydrierung und Decarboxylierung
von Weinsäure in Gegenwart
eines hohen Überschusses an Natriumhydrogensulfat
bei 220°C herge-
Abb. 1: Glukose-Stoffwechsel von E. coli YYC202ldhA. Dieser Stamm besitzt
eine Deletion der aceEF-Gene, die für zwei Untereinheiten des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
kodieren, sowie Mutationen in den Genen
poxB (Pyruvat-“Oxidase”), pflB (Pyruvat-Formiat-Lyase), pps (PEP-Synthetase)
und ldhA (NAD + -abhängige D-Lactat-Dehydrogenase). Er ist daher
nicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat, PEP und Lactat umzusetzen
und benötigt zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium Acetat.
stellt [2]. Daneben wurde auch eine
Reihe von anderen chemischen Verfahren
beschrieben, die wie der klassische
Prozess sehr energieaufwändig
und/oder umweltunverträglich sind.
Als Alternative wurden daher biotechnologische
Verfahren zur Pyruvat-
Herstellung entwickelt, insbesondere
aus Lactat [3] und Glucose. Die auf
Glucose basierenden mikrobiellen
Verfahren verwenden intakte Zellen,
die Pyruvat primär durch die Reaktionen
der Glykolyse bilden. Ein gut
untersuchter Prozess verwendet
Stämme der Hefe Torulopsis glabrata,
die eine multiple Vitamin-Auxotrophie
für Thiamin, Nicotinsäure, Biotin
und Pyridoxin besitzen [4,5]. Bei
Fed-batch-Fermentation konnte mit
diesem Organismus ein maximaler
Pyruvat-Titer von 69 g/l (0,78 M) erreicht
werden bei einer Ausbeute von
1,3 Mol/Mol (0,64 g/g) und einer
Raum-Zeit-Ausbeute von 29,8 g/l/h.
Aufgrund der multiplen Auxotrophien
erwies sich eine ausgewogene Bereitstellung
der essentiellen Vitamine
als sehr wichtig [4]. Ein vergleichbares
Verfahren zur Pyruvat-Herstellung
aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe
Stämme von Escherichia
coli beschrieben [6]. Unter
optimierten Bedingungen konnten
mit diesen Stämmen maximal 30 g
Pyruvat pro 50 g Glucose gebildet werden
(1,2 Mol/Mol).
In den folgenden Kapiteln wird ein
neues Verfahren zur Herstellung von
Pyruvat aus Glucose mit Hilfe Acetatauxotropher
E. coli-Stämme beschrieben.
Es werden verschiedene
Fermentationsprozessführungen vorgestellt
sowie der Einsatz der Elektrodialyse
zur Online-Abtrennung des
Pyruvats aus der Fermentationslösung.
Stammentwicklung und -
charakterisierung
Alle bisher beschriebenen mikrobiellen
Verfahren zur Herstellung von
Pyruvat aus Glucose basieren auf Vitamin-auxotrophen
Stämmen, bei denen
die Umsetzung von Pyruvat zu
Acetyl-CoA und anderen Produkten
bei entsprechender Vitamin-Limitierung
partiell gehemmt ist und das angestaute
Pyruvat daher ausgeschieden
wird. Probleme bei der technischen
Umsetzung dieser Verfahren liegen
unter anderem in der schwierigen
Kontrolle der Vitamin-Konzentration,
insbesondere bei Verwendung von
Stämmen mit multiplen Vitamin-Auxotrophien.
Das hier beschriebene
neue Verfahren basiert auf dem rekombinanten
E. coli-Stamm YYC202,
der prototroph für Vitamine ist, aber
zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium
Acetat benötigt [7]. Diese
Acetat-Auxotrophie ist eine Folge der
vollständigen Blockade der Pyruvat-
Umsetzung zu Acetyl-CoA oder Acetat,
die durch eine Deletion der
aceEF-Gene sowie Mutationen in den

Genen pflB und poxB erreicht wurde
(Abb. 1). Die aceEF-Gene kodieren
für die Pyruvat-Dehydrogenase- bzw.
die Dihydrolipoyl-Transacetylase-Untereinheit
des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
(PDH). Unter aeroben
Bedingungen wird der überwiegende
Teil des Pyruvats durch diesen
Komplex zu Acetyl-CoA umgesetzt.
Die Mutationen in poxB und pflB führen
zur Inaktivierung der Pyruvat-
„Oxidase“ (Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase)
und der Pyruvat-Formiat-
Lyase. Während die Funktion der Pyruvat-„Oxidase“
unklar ist, ersetzt die
Pyruvat-Formiat-Lyase bei anaerobem
Wachstum den PDH-Komplex.
Neben den genannten Mutationen
besitzt E. coli YYC202 eine weitere
im pps-Gen für die PEP-Synthetase,
die zur Inaktivierung dieses Enzyms
führt.
Unter aeroben, nicht-wachsenden
Bedingungen setzte E. coli YYC202
Glucose nahezu vollständig (>1,9
Mol/Mol) in Pyruvat um und sekretierte
es ins Medium (Abb. 2) [8].
Diese Umsetzung kann durch folgende
Reaktionsgleichung beschrieben
werden: Glucose + O 2 2 ➝ Pyruvat - +
2 H + + 2 H 2 O. Auch wachsende Zellen
von E. coli YYC202 produzierten
in Schüttelkolben in Abhängigkeit von
der eingesetzten Acetat-Konzentration
bis zu 1,7 Mol Pyruvat/Mol Glucose.
Leider wurden die genannten Werte
nur bei geringen Zelldichten erreicht,
bei höheren sank die molare Ausbeute
stark ab, bedingt durch die Bildung
des Nebenprodukts Lactat (Abb. 3).
Für eine spätere technische Umsetzung
ist die Lactat-Bildung sehr ungünstig,
da sie nicht nur die Ausbeute
reduziert, sondern auch die Aufarbeitung
des Pyruvats aufwändiger macht.
Um die Lactat-Bildung zu unterdrükken,
wurde das ldhA-Gen, das für die
NAD + -abhängige D-Lactat-Dehydrogenase
kodiert, in E. coli YYC202 durch
Insertion eines Kanamycin-Resistenzgens
inaktiviert. Der resultierende
Stamm E. coli YYC202ldhA bildete
sowohl im Schüttelkolben (Abb. 3) als
auch im Fermenter kein Lactat mehr,
wodurch gezeigt wurde, dass ausschließlich
das ldhA-Genprodukt für
die Lactat-Bildung verantwortlich war
[8].
Fermentationsentwicklung
Für die Fermentationsentwicklung
[9] wurde ein 7,5-Liter Bioreaktor
(Infors, Schweiz) mit 2,5 Liter Startvolumen
sowie ein Glucose-Acetat-
Minimalmedium eingesetzt. Die pH-
Regelung auf pH 7,0 erfolgte durch
Titration mit 25 %iger Ammoniumlauge.
In allen Experimenten wurde
eine Temperatur von 37°C und eine
pO 2 -Konzentration >40 % bei einem
Reaktorüberdruck von 0,2 - 0,8 bar
eingestellt. Die O 2 - und CO 2 -Konzentrationen
im Abgas wurden über einen
Gasanalysator (Binos 102 M, Rosemount,
Deutschland) bestimmt.
Die Glukose-Konzentration wurde
online mittels Kamanfilter und Minimalvarianzregler
zusammen mit einem
Online-Glukose-Messgerät
(OLGA, IBA GmbH, Göttingen) auf 5
g/l eingeregelt.
1. Geregelte Fed-batch-
Fermentationen
Die Fed-batch-Prozessführung (Abb.
4) erfolgte durch Regelung von Glukose
(auf 5 g/l) und Acetat [10]. Als
Ergebnis einer ersten Versuchsserie
konnte ein einfacher, äquimolarer
Zusammenhang zwischen der Acetat-
Verbrauchsrate (ACR) und der CO 2 -
Produktionsrate (CTR) gefunden
werden. Darauf aufbauend wurde
eine indirekte Acetat-Regelung durch
Online-Bestimmung der CO 2 -Emissionsrate
und Einstellung der Acetat-
Feedrate nach folgender Gleichung
etabliert, bei der VR das Reaktionsvolumen
des Bioreaktors darstellt:
ACR (g/h) = [927 (g/mmol) x CTR
(mmol/l/h) x VR (l)] / F
Mit Hilfe des einführten Faktors F
(dimensionslos) kann bestimmt werden,
ob die Acetat-Versorgung limitierend
ist (F>1) oder ob Acetat im
Überschuss zugegeben wird und daher
akkumuliert (F350 mM Pyruvat drastisch
abnahm und bei ca. 700 mM Pyruvat
vollständig zum Erliegen kam. Die
molekulare Ursache für diese Produkt-Inhibierung
konnte noch nicht
geklärt werden.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
97
Abb. 2: Umsetzung von Glucose zu Pyruvat durch eine Zellsuspension von
E. coli YYC202 mit einer OD 600 von 0,8. Die Zellen wurden in Glucose-Acetat-Minimalmedium
vorkultiviert, anschließend in einem Puffer pH 7,0 mit
8 mM Glucose resuspendiert und bei 37°C und 160 Upm inkubiert.
2. Repetitive Fed-batch-
Prozessführung
Um die Produkt-Inhibierung zu vermindern
und die Produkt/Substrat-
Ausbeute zu steigern, wurden Experimente
zur kontinuierlichen Fermentation
von E. coli YYC202ldhA
mit Zellrückhaltung durchgeführt, die
jedoch nicht den gewünschten Erfolg
zeigten. Als Alternative wurde daher
eine repetitive Fed-batch-Prozessführung
etabliert [11], wozu im Bypass
des 7,5-Liter-Bioreaktors eine Ultrafiltrationseinheit
(0,98 m 2 Membranfläche,
500 kDa Cut-off, Schleicher
und Schüll, Deutschland) installiert
und vor Beginn der Experimente 3 h
mit 1 M Natronlauge gereinigt wur-
de. Die repetitive Fed-batch-Prozessführung
startete, nachdem in Phase
I die Biomassebildung analog zur
bisherigen Vorgehensweise erfolgt
war und konstant blieb. Die Suspension
wurde dann durch den Bypass
gepumpt, bis ca. 60 % des Fermentationsmediums
zellfrei aus dem System
entnommen worden waren. Anschließend
wurde das gleiche Volumen an
frischem Medium über die Ultrafiltrationseinheit
in den Fermenter gepumpt.
Dieser Zyklus wurde wiederholt,
nachdem die Glucose-Feedrate
auf

98 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 4: Experimenteller Aufbau zur Fed-batch-Fermentation (mit Zellrückhaltung)
von E. coli YYC202ldhA im 7.5-L-Bioreaktor. Wie im Text beschrieben,
wurde die Glucose-Zugabe direkt, die Acetat-Zugabe indirekt
geregelt. Zellfreies Permeat konnte über die Ultrafiltrationseinheit abgezogen
werden.
sank. Die höchste Raum-Zeit-Ausbeute
von 145 g/l/d konnte in Phase II
erreicht werden und bedeutete eine
beträchtliche Steigerung der maximalen
Raum-Zeit-Ausbeute von 42 g/l/d
aus dem nicht-repetitiven Fed-batch-
Ansatz [10]. Die molaren Pyruvat-/
Glukose-Ausbeuten, die in den Produktionsphasen
II-IV erreicht wurden,
betrugen über 1,7 Mol/Mol, was
ebenfalls eine drastische Verbesserung
gegenüber dem Fed-batch-Prozess
(1,1 Mol/Mol) darstellt. Wie aus
Abbildung 6 nochmals deutlich wird,
konnte die maximale spezifische Pyruvatproduktionsrate
von ca. 7-9
mmol/g BTM /h nur bei Pyruvatkonzen-
Abb. 5: Einfluss der Acetat-Feedstrategie
auf den Pyruvat-Titer bei
Fed-bach-Fermentation von E. coli
YYC202ldhA. Rauten, Acetat-Limititierung
(F = 2.0); Quadrate, Acetat-Limitierung
(F = 1.5); Kreise,
Acetat-Sättigung (F = 1.0); Dreiekke,
Acetat-Akkumulation (F = 0.8).
trationen

Abb. 7: Experimenteller Aufbau des kompletten ISPR-Prozesses mit vollständig integrierter Elektrodialyse-Anlage.
Zellfreies Permeat wurde dem Bioreaktor über die Ultrafiltrationseinheit entnommen, die darin enthaltenen
Proteine in einem zweiten Ultrafiltrationsschritt (10 kDa Cut-off) abgetrennt und das Permeat zur Pyruvat-Abreicherung
in die Elektrodialyse-Einheit geleitet. Das abgereicherte Medium wurde in den Reaktor zurückgeführt.
Die in der Elektrodialyse gebildete Natronlauge bzw. das Ammonium wurde zur Unterstützung der Titration im
Bioreaktor ebenfalls zurückgeführt.
duktion der Pyruvatkonzentration einen
positiven Effekt auf die Pyruvat-
Produktionsrate hat, fiel diese Rate von
ursprünglich 60 mM/h auf ca. 25 mM/
h nach Beginn der Elektrodialyse ab.
Als Ursache wird eine Limitierung des
Stoffwechsels durch Co-Abtrennung
von z.B. Salzen oder anderen geladenen
Komponenten aus der Fermentationslösung
vermutet. Als Folge dieser
reduzierten Produktionsrate lag die
Raum-Zeit-Ausbeute mit 68 g/l/d und
die Produkt/Substrat-Ausbeute mit 1,2
Mol/Mol deutlich unter den im repetitiven
Fed-batch-Verfahren erzielten
Werten. Wird die gesamte Menge des
produzierten Pyruvats auf das Arbeitsvolumen
des Reaktors bezogen, so
wurde rein rechnerisch in dem Experiment
ein Titer von >900 mM Pyruvat
erreicht.
Ausblick
Die dargestellten Resultate zeigen ein
neues Konzept zur mikrobiellen Herstellung
von Pyruvat aus Glucose auf,
das nicht mehr auf Vitamin-auxotrophen
Stämmen basiert, sondern auf
Acetat-auxotrophen E. coli-Stämmen,
bei denen die Umsetzung von Pyruvat
zu Acetyl-CoA, Acetat und Lactat vollständig
blockiert ist. Wachstum und
Produktbildung dieser Stämme können
durch eine Online-Regelung des Acetat-Feeds
beeinflusst werden, die auf
der beobachteten Äquivalenz von CO 2 -
Abb. 8: Pyruvat-Konzentration c P (Kreise) und volumetrische Pyruvat-Produktionssrate
(PPR, Dreiecke) im Verlaufe des ISPR-Prozesses mit vollständig
integrierter Elektrodialyse zur Pyruvat-Abtrennung. Phase I, Biomassebildung,
Phase II, kontinuierliche Prozessführung mit Zellrückhaltung,
Phase III, integrierte Pyruvatabtrennung. Die Konzentrationen des
‚integrierten Prozesses’ (offene Kreise) sind rechnerisch und beziehen
sich auf das tatsächliche Arbeitsvolumen im Reaktor.
Bildungsrate und Acetat-Verbrauchsrate
basiert. Bei repetitiver Fed-batch-
Prozessführung konnten Pyruvat-Konzentrationen
bis zu 700 mM, Produkt/
Substrat-Ausbeuten bis zu 1,8 Mol/Mol
und Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 145
g/l/d erreicht werden. Die Elektrodialyse
konnte als Aufarbeitungsmethode
etabliert werden, die sich für den Offline-Betrieb
eignen würde. Aufgrund
der positiven Ergebnisse aus dem repetitiven
Fed-batch-Ansatz bietet es sich
an, in einem nächsten Schritt den Py-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
99
ruvat-Produktionsprozess mit immobilisierten
Zellen von E. coli YYC202ldhA
weiter zu optimieren und in den technischen
Maßstab zu übertragen. Darüberhinaus
können die dargestellten
Strategien auch für die mikrobielle
Produktion anderer organischer Säuren
von großem Interesse sein.
Referenzen
[1] Li, Y., Chen, J., Lun S.-Y., Appl. Microbiol.
Biotechnol. 57 (2001a), 451-459.
[2] Howard, J.W.,Fraser, W.A., Org. Synth.
Coll. 1 (1932), 475-476.
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J.E., Payne, M.S., Anton, D.L., DiCosimo,
R. J., Mol. Catal. B. Enzymatic 2
(1997), 223-232.
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Appl. Microbiol. Biotechnol. 55
(2001b), 680-685.
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(2002),101-107.
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J. Bacteriol. 169 (1987), 2107-2112.
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10129714.4 (2001).
[9] Gerharz, T., Zelić, B., Takors, R., Bott,
M, German Patent Application
10220234.6 (2002).
[10] Zelić, B., Gerharz, T., Bott, M., Vasić
Rački, D., Wandrey, C., Takors, R.,
Chem. Eng. Technol. (2003), im
Druck.
[11] Zelić, B., Gostovic, S., Vuoriletho, K.,
Vasić-Rački, B., Takors, R., Biotechnol.
Bioeng. (2003), im Druck.
Danksagung
Die Autoren danken der Deutschen
Bundesstiftung Umwelt (DBU) für die
finanzielle Unterstützung dieses Projekts
im Rahmen des Verbundprojekts
Biokatalyse (www.biokatalyse.de) sowie
der Amino GmbH (Frellstedt), die
als Industriepartner an der technischen
Umsetzung des Verfahrens arbeitet.
Ein weiterer Dank gilt Prof. E.
Heinzle und A. Biwer vom Institut für
Technische Biochemie der Universität
des Saarlandes (Saarbrücken) für
die ökologische und ökonomische
Evaluation des Projekts. Für die kontinuierliche
und großzügige Unterstützung
der Forschungsarbeiten bedanken
sich die Autoren bei Prof. H. Sahm
und Prof. C. Wandrey.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Michael Bott
Institut für Biotechnologie 1
Forschungszentrum Jülich
D-52425 Jülich
Tel.: 02461-6155 15
Fax: 02461-6127 10
eMail: m.bott@fz-juelich.de

100 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
BIOTRANSFORMATION
Entwicklung biotechnologischer
Verfahren zur mikrobiellen
Reduktion von Ketoverbindungen
� Andrea Weckbecker1 , PD Dr. Werner Hummel1 , Maya Amidjojo2 , Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz2 , Michel Brik Ternbach3 , Dr. Ralf Takors3 , PD Dr. Michael
Müller3 , Prof. Dr. Christian Wandrey3 1 2 Institut für Molekulare Enzymtechnologie, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, Technische Universität München,
3Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum Jülich GmbH
Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone wurden Verfahren entwickelt, um mit mikrobiellen Methoden – BIOHYDRIERUNGEN – die Darstellung enantiomerenreiner
Alkohole im technischen Maßstab zu erreichen.
Konkretes Beispiel sind enantiomerenreine Hydroxyhexansäureester, die als Bausteine für Pharmaka (Arteriosklerose-Mittel) benötigt werden. Mit Hilfe
einer (R)-spezifischen, NADP-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) aus Lactobacillus kefir können diese Verbindungen hoch enantiomerenrein aus
prochiralen Ketonen hergestellt werden. Für die Regenerierung des Cofaktors NADPH stehen verschiedene Enzymsysteme zur Auswahl, z. B. Glucose/
Glucose-Dehydrogenase oder Glucose-6-Phosphat/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase.
Für die Hydrierreaktionen wurden die Mikroorganismen mit gentechnischen Methoden, durch Coexpression von Reduktase und einem Coenzym-regenerienden
Enzym, verbessert. Als Coenzym-regenerierendes Enzym wurde die Glucose-Dehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis ausgewählt. Es wurden
zwei Plasmide konstruiert, welche sowohl ADH als auch GDH in unterschiedlicher Reihenfolge enthalten. Beide Coexpressions-Systeme zeigen sowohl
ADH- als auch GDH-Aktivität und können in Ganzzellbiotransformationen eingesetzt werden.
Die Eduktbereitstellung erfolgt im Rührkesselreaktor mikrodispers durch in situ-Erzeugung von Edukttropfen in der wässrigen Phase (Durchmesser 30 –
50 µm). Basierend auf reaktionstechnischen Untersuchungen und der Online-Kontrolle der aktuellen Tropfengröße und -verteilung mit Hilfe der 3-dimensionalen
optischen Laser-Reflexionsmessung (3D-ORM) werden Zulaufverfahren entwickelt, um bei der Biohydrierung hohe Raum-Zeit-Ausbeuten bei
hohem Enantiomerenüberschuss im technischen Maßstab zu erreichen.
Keywords: Biotransformationen, Cofaktorregenerierung, Coexpression, mikrodisperse Eduktbereitstellung, 3-dimensionale optische Laser-Reflexionsmessung,
Hydroxyhexansäureester, Makrokinetik.
Einleitung
Obwohl bei der katalytischen, asymmetrischen
Reduktion von C=C-,
C=O- und C=N-Bindungen innerhalb
der letzten 15 Jahre enorme Fortschritte
im Laboratoriumsmaßstab
erzielt worden sind, konnten diese
Ergebnisse nicht direkt in den technischen
Maßstab übertragen werden.
Die Bedeutung der asymmetrischen
Synthese wird aber durch folgende
Zahlen belegt: Die Zunahme des Umsatzes
enantiomerenreiner Pharmazeutika
betrug 1997 weltweit 21 % auf
$ 90 Mrd [1]. Noch in 1994 betrug
der Gesamtumsatz für chirale Wirkstoffe
nur $ 42,2 Mrd, was einer Verdoppelung
innerhalb von 3 Jahren
entspricht [2]. Eine weitere jährliche
Steigerungsrate im zweistelligen Bereich
wird für die kommenden Jahre
erwartet [1].
Da katalytische asymmetrische Reduktionen
im technischen Maßstab
insbesondere zur Herstellung von
Zwischenstufen in der Wirkstoffproduktion
eingesetzt werden, müssen
die Produktionsschritte den an Pharmazeutika
gestellten Anforderungen
entsprechen: Hohe Enantiomerenreinheit,
keine Schwermetall- und organische
Lösungsmittelrückstände
sowie hohe Produktreinheit. Die technische
Durchführung erfolgt aber in
der Regel unter extremen, energieintensiven
Bedingungen, unter Verwendung
giftiger und umweltbelastender
Schwermetallkatalysatoren sowie großer
Mengen organischer Lösungsmittel.
Vergleichende Untersuchungen belegen,
dass die Biokatalyse unter ökonomischen
wie auch ökologischen
Gesichtspunkten mit der chemischen
asymmetrischen Katalyse konkurrieren
kann. Die vergleichende Untersuchung
chemischer und biochemischer
Reduktionen zur Synthese von
(R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure
wurde von der Gruppe um Spindler
und Blaser et al. (Novartis AG, ehemals
Ciba-Geigy AG) [3] publiziert.
Diese kommen zu dem Ergebnis, dass
die Biokatalyse insbesondere dann
konkurrenzfähig ist, wenn das Ziel-
produkt möglichst enantiomerenrein
vorliegen sollte. Dies ist der Fall bei
chiralen Pharmazwischenprodukten.
Stand der Forschung und
Technik
Mit Hilfe von Biokatalysatoren ist es
prinzipiell möglich, enantioselektive
Reduktionen zur Darstellung enantiomerenreiner
sekundärer Alkohole
durch Ketonreduktion in einem Schritt
durchzuführen. Bei der Biotransformation
kommen weder Schwermetall-
Katalysatoren noch umweltbelastende
Chemikalien zum Einsatz. Eine extensive
Nutzung organischer Lösungsmittel
ist nicht notwendig.
Hydrolytische Enzyme, wie Lipasen
oder Esterasen, sind prinzipiell für die
Darstellung enantiomerenreiner Alkohole
geeignet. Allerdings geht man
dabei von dem jeweiligen Racemat
aus, sodass durch kinetische Racematspaltung
die Ausbeute auf maximal
50 % beschränkt ist.
Das Potenzial der Bäckerhefe Saccharomyces
cerevisiae und anderer
Hefen zur stereoselektiven Reduktion
ist auch im präparativen Maßstab
sehr gut untersucht und dokumentiert
[4]. Die breite Anwendbarkeit der
Bäckerhefe basiert auf der günstigen
Verfügbarkeit (600.000 jato), der effizienten
intrazellulären Regenerierung
von Cofaktoren, der Permeabilität
der Zellmembranen für verschiedenste
organische Substanzen und
dem Vorhandensein verschiedener
(R)- und (S)-spezifischer Oxidoreduktasen,
die ein breites Substratspektrum
der Bäckerhefereduktion
zur Folge haben. Dieser letzte Umstand
ist aber auch für die oftmals
erniedrigten Enantiomerenüberschüsse
bei Ganzzellbiotransformationen
mit Hefen verantwortlich.
Dieses Problem kann durch den
Einsatz isolierter Oxidoreduktasen
umgangen werden, was allerdings für
präparative Umsetzungen ein effizientes
Cofaktorregenerierungssystem
voraussetzt.
Ein aktueller Ansatz der japanischen
Arbeitsgruppe um Soda [5]
kombiniert die Vorteile der Ganzzell-

iotransformation, die im Wesentlichen
in der Robustheit des Systems
und der Selbstvermehrung der Katalysatoren
liegen, mit den Vorteilen der
hohen Enantiomerenreinheit isolierter
Enzyme, indem die erforderlichen
Synthese-Enzyme in einem geeigneten
Wirtsstamm coexprimiert und ohne
Isolierung in Form ganzer Zellen eingesetzt
werden. Die grundsätzliche
Realisierbarkeit dieses Ansatzes wurde
in dieser Arbeit am Beispiel der
Coexpression von L-Aminosäuredehydrogenasen
und Formiatdehydrogenase
in E. coli demonstriert. Soda
und Mitarbeiter konnten zeigen, dass
ausgehend von α-Ketocarbonsäuren
die entsprechenden L-Aminosäuren
in hohen chemischen und optischen
Ausbeuten durch mikrobielle Ganzzellbiotransformation
gewonnen werden
können. Allerdings ist dieser Ansatz
auf die Darstellung von Aminosäuren
beschränkt.
Die reaktionstechnische Untersuchung
von Umsetzungen mit ganzen
Zellen hat bisher gezeigt, dass die geringe
Wasserlöslichkeit typischer
Edukte und Produkte, sowie oftmals
auftretende Inhibierungen, wesentliche
Hindernisse bei der technischen
Realisierung darstellen. Zur Überwindung
einer geringen Wasserlöslichkeit
des Edukts wird die mikrokristalline
Eduktzugabe oder die Zugabe von
Löslichkeitsvermittlern vorgeschlagen.
Meist wird versucht, das schlecht
wasserlösliche Edukt über eine zweite,
nicht mit Wasser mischbare Phase
im Reaktor vorzulegen, um die Verfügbarkeit
zu verbessern. Die Verwendung
einer zweiten nicht mit Wasser
mischbaren Phase wird besonders
dann favorisiert, wenn das gebildete
Produkt sich ebenfalls über diese zusätzliche
Phase schnell aus dem Reaktor
entfernen lässt, um Produktinhibierungen
oder -instabilitäten zu
vermeiden [6].
In Vorarbeiten sind mehrere neue
Carbonyl-reduzierende Dehydrogenasen
isoliert und biochemisch charakterisiert
worden, z.B. (R)-spezifische
Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) aus
Lactobacillus brevis und L. kefir,
eine (S)-ADH aus Rhodococcus erythropolis
und aus Candida parapsilopsis
oder eine (R)-spezifische Diacetyl-Reduktase
aus L. kefir (siehe
Tab. 1). Alle Enzyme sind bereits biochemisch
charakterisiert worden. Sie
setzen ein sehr breites Spektrum an
Substraten durch Hydrierung stereospezifisch
zu chiralen Alkoholen um.
Besonders die ADH aus L. brevis
zeichnet sich durch eine breite Substratspezifität,
hohe Enantioselektivi-
Abb. 1: Enzymatische Reduktion von 3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester
(Ausbeute 80 %, > 99.5 % ee).
tät und gute pH- und Temperaturstabilität
aus [7]. So konnten 3,5-Diketohexansäureester
durch eine regioselektive
Biohydrierung mit diesem
Enzym umgsetzt werden. Die resultierenden(5R)-5-Hydroxy-3-oxohexansäureester
werden optisch rein
(> 99.5 % ee) in hohen chemischen
Ausbeuten erhalten (siehe Abb. 1)
[8].
Zur reaktionstechnischen Überwindung
niedriger Produktivitäten
aufgrund der schlechten Wasserlöslichkeit
von Edukten wurde in Vorarbeiten
die Bereitstellung des Edukts
in mikrokristalliner Form als Alternative
zur üblichen Verwendung eines
nicht mischbaren organischen Lösungsmittels
als „Eduktdepot“ im
Rührreaktor untersucht. Es konnte
gezeigt werden, dass bei Produkten,
die besser wasserlöslich sind als das
Edukt, eine selektive Rückhaltung des
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
101
am Beispiel der regioselektiven Oxidation
von Terfenadin mit Cunninghamella
blakesleeana erstmalig demonstriert
[9].
Die zeitnahe praktische Umsetzung
von mikrobiellen Reaktionen macht
eine effektive Bioprozessentwicklung
erforderlich. Hierzu wurden insbesondere
neue Methoden zur Optimierung
von Reaktionsbedingungen, zur
parallelen Versuchsdurchführung,
zur Identifizierung von kinetischen
Modellen und zur Prozesskontrolle in
Bioreaktoren entwickelt [10-12].
Projektinhalt
Ziel des Forschungsvorhabens „Biohydrierung“
ist die Entwicklung von
allgemein nutzbaren mikrobiellen
Verfahren zur Biohydrierung, die im
technisch-industriellen Maßstab einsetzbar
sind. An ausgewählten Bei-
Abb. 2: Coexpression einer ADH zur Synthese eines chiralen Alkohols (A)
gekoppelt mit einem NAD(P)H-Regenerierungsenzym (B-1 bis B-4).
mikrokristallinen Edukts (und des
Biokatalysators) durch eine Querstromfiltration
im Bypass des Bioreaktors
erfolgen kann. Das in der
wässrigen Phase gelöste Produkt wird
dabei über die Filtrationseinheit kontinuierlich
aus dem Reaktor entfernt
und kann somit die biologische Reaktion
nicht inhibieren. Die prinzipielle
Anwendbarkeit dieses neuen reaktionstechnischen
Ansatzes wurde
spielen chiraler sekundärer Alkohole,
die industriell im Tonnenmaßstab
benötigt werden, soll die enantioselektive
Reduktion prochiraler Ketone
mit ganzen Zellen untersucht werden.
Biologische Systeme zur
Biohydrierung
Vorrangige Zielsetzung dieses Teilprojekts
ist die Bereitstellung von rekom-
binanten E. coli-Stämmen zur Durchführung
enantioselektiver Reduktionen
mit ganzen Zellen. Dabei soll neben
der gewünschten Reduktase ein
System zur Coenzym-Regenerierung
in E. coli coexprimiert werden (Abb.
2).
Als Modellreaktion dient die regiound
enantioselektive Reduktion von
6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-tertbutylester
zu 6-Chlor-5-hydroxy-3oxo-hexansäure-tert-butylester
mit
Hilfe einer NADP-abhängigen, (R)spezifischen
Alkohol-Dehydrogenase
(ADH) aus Lactobacillus kefir. 5-
Hydroxy-3-oxo-hexansäurederivate
sind wichtige chirale Intermediate bei
der Produktion synthetischer HMG-
CoA-Reduktase-Inhibitoren.
Zur NADPH-Regenerierung stehen
verschiedene enzymatische Systeme
wie Formiat/Formiat-Dehydrogenase
(NADP-abhängiges Mutein; Gen nicht
verfügbar), Glucose/Glucose-Dehydrogenase,Gluconat/Gluconat-Dehydrogenase,Malat/Malat-Dehydrogenase
oder Glucose-6-Phosphat/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
zur
Auswahl. Das System Glucose/Glucose-Dehydrogenase
(GDH) weist einige
Vorteile auf. So liegen die spezifischen
Aktivitäten von ADH und GDH
aus Bacillus subtilis in der gleichen
Größenordnung (ca. 400 U/mg für
die homogenen Enzyme), die Gensequenz
der GDH ist literaturbekannt,
das Enzym ist stabil und das Substrat
Glucose ist preiswert und führt, ebenso
wie das Oxidationsprodukt Gluconolacton,
nicht zu störenden Nebenreaktionen
bei Biotransformationen.
Die Gene der ADH aus L. kefir sowie
der GDH aus B. subtilis wurden
isoliert und in unterschiedlicher Reihenfolge
in einen Expressionsvektor
kloniert. Das Konstrukt mit dem Plasmid
pAW-3 enthält hinter der ribosomalen
Bindungsstelle die ADH als erstes
Gen und im Anschluss an eine
weitere ribosomale Bindungsstelle
die GDH, während bei Plasmid pAW-
4 die Reihenfolge der beiden Gene
umgekehrt wurde (Abb. 3).
Nach Transformation in verschiedene
E. coli-Wirtsstämme wurden die
rekombinanten Stämme unter Expressionsbedingungen
(1 mM IPTG,
Induktion: 3 h bei 30°C) angezogen,
aufgeschlossen und die Aktivität der
ADH und GDH im Rohextrakt bestimmt
(Tab. 2). Im Konstrukt pAW-
3, das die ADH als erstes Gen enthält,
weist die ADH eine etwa dreimal so
hohe Aktivität auf wie die GDH, während
die Verhältnisse im System pAW-
4 mit der GDH als erstem Gen umgekehrt
sind [13].

102 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 3: Struktur der Expressionsplasmide pAW-3 and pAW-4, die ADH und
GDH in entgegengesetzer Reihenfolge enthalten.
In weiterführenden Experimenten
sollen diese beiden Systeme umfassend
biochemisch charakterisiert
und anschließend vergleichend bewertet
werden. Alternativ zur Glucose-DH
soll ein weiteres Enzym für die
NADPH-Regenerierung geprüft werden.
Bioorganische Chemie
Zielsetzung der Arbeiten im Bereich
der Bioorganischen Chemie ist die
Entwicklung von Synthesen und die
Bereitstellung von prochiralen Ketonen
als Substrate für enantioselekti-
generierungssystemen deutlich erhöht
werden kann und somit die Produktivität
einen auch produktionstechnisch
interessanten Wert erreicht.
Durch die Verwendung von Bäckerhefe
(BY) konnte diese Synthesestrategie
auf die Darstellung beider Enantiomeren
von 5-Hydroxy-3-ketohexansäureestern
(C) ausgeweitet
werden [15]. Durch nachfolgende
diastereoselektive Reduktion und Kristallisation
können so alle vier diastereomere
Diole (D-G) stereoisomerenrein
erhalten werden (Abb. 4).
Die zur Verfolgung des Reaktionsverlaufs
und zur Charakterisierung
Abb. 4: Biokatalytische Darstellung beider Enantiomere von 5-Hydroxy-3keto-hexansäureestern
(B, C) sowie der diastereomeren Diole (D-G).
ve Reduktionen mit Biokatalysatoren
sowie die Ausarbeitung und Bereitstellung
geeigneter analytischer Methoden.
Die von uns entwickelte Methode [8]
zur regio- und enantioselektiven Reduktion
von 3,5-Diketohexansäureestern
(A) im Batch-Verfahren mittels
Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase
(LBADH) wurde bis in den
75g-Maßstab übertragen (bis zu 80
% Ausbeute an enantiomerenreinem
B, R = tBu) [14]. Dabei konnten Umsatzzahlen
(ttn) für NADP(H) von bis
zu 125 erreicht werden. Es wird erwartet,
dass dieser Wert durch die
Verwendung von Ganzzell-Cofaktorre-
der Produkte (Reinheit, Enantiomerenüberschuss)
benötigten chromatographischen
und spektroskopischen
Methoden (GC-MS, HPLC,
NMR) sowie mögliche Derivatisierungstechniken
wurden von uns ausgearbeitet
und den Projektpartnern
zur Verfügung gestellt [15].
Der aus wirtschaftlicher Sicht interessanteste
Baustein (3R,5S)-3,5-
Dihydroxyhexansäure-tert-butylester
(D) ist über diese Route im präparativen
Maßstab zugänglich. Für die
weitere Maßstabsvergrößerung wurde
von uns eine einstufige Synthese
ausgearbeitet, durch die das benötigte
Diketon (A) in effizienter Weise zu-
gänglich wird. Hierzu wird im Gegensatz
zu früheren Methoden nur ein
Äquivalent Butyllithium benötigt. Im
Labormaßstab (2 L Reaktionsgefäß)
konnten so pro Ansatz 150 g des Diketons
(A) in 80%iger Reinheit dargestellt
werden. Diese Synthese sollte
sich ohne weiteres auch auf die
Darstellung im kg-Maßstab übertragen
lassen können [14].
Neben dieser als Zielsubstrat ausgewählten
Verbindung wurden in Zusammenarbeit
mit den Projektpartnern
weitere schlecht wasserlösliche
Ketone ausgewählt, welche ebenfalls
in der biokatalytischen Hydrierung
eingesetzt werden sollen. Hierbei ist
4-Chloracetophenon als geeignete
Vergleichsverbindung zu nennen, da
hierzu sowohl für das Substrat als
auch für die Racematspaltung der resultierenden
Alkohole ausgearbeitete
analytische Verfahren und Vergleichsverbindungen
zur Verfügung
stehen.
Die von uns eingeführte dynamische
kinetische Racematspaltung
(Abb. 5) durch regio- und stereoselektive
Reduktion von in 2-Position
substituierten acyclischen 1,3-Diketonen
[16,17] am Beispiel eines alkylierten
3,5-Dioxohexanoates wurde
inzwischen von anderen Arbeitskreisen
auf die Chemokatalyse übertragen
[18]. Dieses Beispiel belegt eindrucksvoll,
dass die Untersuchung
biokatalytischer Verfahren zu neuen
Entwicklungen auch in der rein chemischen
Synthese Anstoß geben kann.
Der Einsatz der von uns generierten
Bausteine in der Naturstoff- und
Wirkstoffsynthese wurde durch die in
Abb. 5: Dynamische kinetische Racematspaltung durch regio- und stereoselektive
Reduktion eines in 2-Position substituierten 1,3-Diketons [16,17].
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe
von Prof. Dieter Enders, RWTH
Aachen (Förderung durch die DFG,
SFB 380), durchgeführten Synthesen
zu S-(+)-Argentilactone, S-(-)-Goniothalamin
und zweier Callystatin-
Stereoisomeren nachhaltig belegt
[19,20,21]. Insbesondere die erste
Abb. 6: Gegenüberstellung von Simulation und experimentellen Ergebnissen
von Batch-Experimenten im Labormaßstab mit L-Valin produzierenden
C. glutamicum Stämmen. Die gemessen Konzentrationen an Biomasse
(CX,[OD600]) als +, Glucose (CS1,[g/l]) als o und L-valine (CP , [mM]) als *
sind angegeben. Die Linien entsprechen den jeweils simulierten Werten.

Tab. 1: Neue verfügbare NADH- und NADPH-abhängige Dehydrogenasen (DH).
Enzym Stereo- Organismus Coenzym Bearbeitungsstand
Spezifität
Biochemische Sequenzierung/
Daten Klonierung
Alkohol-DH R Lactobacillus brevis NADPH Proteinchemisch charakt. sequenziert
Substratspektrum kloniert
Kinetische Konstanten überexprimiert
Alkohol-DH R Lactobacillus kefir NADPH Proteinchemisch charakt. sequenziert
Substratspektrum
Kinetische Konstanten
Alkohol-DH R Lactobacillus brevis -Gen NADH Proteinchemisch charakt. sequenziert
(Mutein) in E. coli Substratspektrum kloniert
Kinetische Konstanten
Alkohol-DH S Candida parapsilosis NADH Proteinchemisch charakt. sequenziert
Substratspektrum kloniert
Kinetische Konstanten exprimiert
Alkohol-DH S Rhodococcus erythropolis NADH Proteinchemisch charakt.
Substratspektrum
Kinetische Konstanten partiell sequenziert
Diacetyl- R Lactobacillus kefir NADH Proteinchemisch partiell
Reduktase charakterisiert
Substratspektrum
vollständig auf enantioselektiven Syntheseschritten
aufbauende Synthese
des Zytotoxikums Callystatin beleuchtet
die Vorteile kombinierter chemoenzymatischer
Synthesestrategien.
Makrokinetische Analyse
der Biohydrierung mit
ganzen Zellen
Ein wichtiger Schritt der verfahrenstechnischen
Prozessentwicklung ist
die quantitative Beschreibung der mikrobiellen
Reaktionskinetik, um darauf
aufbauend, z. B. modellgestützt,
eine Prozessoptimierung durchführen
zu können. Hinsichtlich der Vielzahl
möglicher Produktionsstämme, sollte
die makrokinetische Analyse möglichst
effizient erfolgen, was durch die
Entwicklung und den Einsatz einer
modelldiskriminierenden und/oder
optimalen Versuchsplanung für Fedbatch
Experimente realisiert werden
soll. Dabei können z. B. die Konzentration
der Kohlenstoffquelle im Feed,
die zeitlich variablen Feedraten, die
Vorgabe von Probennahmezeitpunkten
und vieles mehr als Parameter der
Versuchsplanung dienen.
Ziel der Versuchsplanung ist die
Identifizierung eines geeigneten makrokinetischenModellierungsansat-
zes für ein biologisches System innerhalb
weniger, sequentieller Experimente.
Dabei wird insbesondere die
Ausgangssituation berücksichtigt,
dass vor Beginn der makrokinetischen
Versuchsreihe oftmals nur we-
nige Informationen – auch über
grundlegende Reaktionsmechanismen
– in dem ‚neuen’ Produktionsstamm
vorhanden sind. Dies hat die
anfängliche Berücksichtigung einer
Vielzahl ‚konkurriender Modellansät-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
103
ze’ zur Folge, die durch die modelldiskriminierende
Versuchsplanung
auf das ‚wahre’ Modell reduziert werden
sollen.
Basierend auf einem modelldiskriminierenden
Versuchsplanungsansatz
von Box und Hill [22] wurde in der
Entwicklungsumgebung von MATLAB/
SIMULINK ein entsprechender Algorithmus
implementiert, der als diskriminierendes
Kriterium die zu erwartende
abnehmende Differenz der Mo-
dellsystem-Entropie in aufeinanderfolgenden
Experimenten verwendet.
Diese Größe berücksichtigt die Covarianz
der Parameterschätzung in der
Fisher-Informationsmatrix als Basis.
Nachdem erste Simulationsrechnungen
erfolgreich verliefen, wurde
die Versuchsplanungstechnik experimentell
getestet. Da zum Zeitpunkt der
experimentellen Überprüfung das E.
coli basierte Produktionsystem mit
Cofaktorregenerierung noch nicht
einsatzbereit war, wurde alternativ ein
rekombinanter L-Valin produzierender
C. glutatmicum Stamm als Testsystem
eingesetzt (aus dem Institut für
Biotechnologie 1, Forschungszentrum
Jülich GmbH). Dieser Stamm war Pantothensäure
und L-Isoleucin-auxotroph.
Ausgehend von dem biologischen
Verständnis über die L-Valin-Produktion
in C. glutamicum wurden vier
konkurriende Modellansätze formuliert,
die die Konzentrationen an Biomasse
(c x ), Glucose (c S1 ), dem Co-
Substrat 2 (Isoleucin und Pantothensäure)
(c S2 ) und dem Produkt L-Valin
(c P ) berücksichtigten. Im einzelnen
unterschieden sich die Modelle
wie folgt:
Abb. 7: Beispiel eines diskriminierend geplanten Fed-batch Experiments zur Unterscheidung der oben genannten
vier Modelle. Wie angegegen sind die geplanten Startkonzentrationen an Substrat eins 27 g/L und Substrat zwei 0
mM. Links sind die Feedraten an Glucose (durchgezogen, 500 g/L) und Substrat 2 (gestrichelt, 2.9 g/L Isoleucin,
4.7 mg/L Pantothensäure) dargestellt. Rechts sind die simulierten Konzentrationsverläufe an Biomasse (CX) als
durchgezogene Linie, Glucose (CS1) als gestrichelte Linie und L-Valin (CP ) als gepunktete Linie dargestellt. Zur
Vereinfachung sind nur die Modellaussagen der Modelle 3 und 4 aufgeführt, die deutliche Prognoseunterschiede
aufweisen, was Ziel der diskrimierenden Versuchsplanung ist.
Tab. 2: Vergleich der Konstrukte pAW-3 und pAW-4; Aktivitäten und Enzymverhältnis.
pAW-3 (ADH-GDH) pAW-4 (GDH-ADH)
Expressions- Spez. Akt. Spez. Akt. GDH ADH Spez. Akt. Spez. Akt. ADH GDH
stamm ADH [U/mg] GDH [U/mg] [%] ADH [U/mg] GDH [U/mg] [%]
Tuner(DE3) 40,6 11,2 27,5 9,1 32,9 27,7
BL21(DE3) 41,6 12,9 31,1 13,8 58,0 23,7
Origami(DE3) 37,7 12,4 32,9 5,3 17,3 30,6
– Modell 1: Wachstumslimitierung
durch eines der beiden Substrate,
Maintenance-Bedarf basierend auf
Glucose, Glucose-abhängige L-Valin
Synthese (ohne Einfluss durch Substrat
2)
– Modell 2: Analog zu Model 1, jedoch
limitiert die Verfügbarkeit von
Substrat 2 die Glucoseaufnahme.
Hohe Konzentrationen an Substrat 2
können die Produktsynthese inhibieren.
– Modell 3: Inhibierung des Wachstums
durch L-Valin, keine Wachtumslimitierung
durch Substrat 2, Inhibie-

104 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 8: Prinzipskizze der mikrodispersiven Biohydrierung (Cosubstrat:
Glucose; Cosolvenz: Isopropanol; 3-D-ORM: 3-dimensionale optische Laser-Reflexionsmessung).
rung der Produktbildung durch Substrat
2.
– Modell 4: Wachstumsabhängigkeit
von beiden Substraten, L-Valin Synthese
ist wachstumsgekoppelt, Produktinhibierung
durch L-Valin.
Wie in Abbildung 6 dargestellt, erlauben
alle Modelle eine akzeptable
Widergabe der experimentellen Daten,
was durch realtiv geringe χ 2 Wer-
derung entspricht. Alle 2 Stunden war
eine Probennahme vorgesehen.
Ein entsprechendes Experiment
wurde durchgeführt. Dabei konnten
die zuvor berechneten Feedraten
weitgehend eingehalten werden. Allerdings
zeigte sich auch, dass ein
manuelles Eingreifen im Versuchsablauf
durch den Experimentator teilweise
notwendig war, um z. B. eine
Abb. 9: Reaktionstechnische Untersuchungen zur Biohydrierung mit Lactobacillus
kefir (Batch-Ansätze mit 50 g/L L. kefir, 30°C, pH 6,5, 125 mM 4-
Cl-Acetophenon, 200 mM Glucose): ee > 99 %, ttn > 1100.
te von 1,1 (Modell 3) bis 2,1 (Modell
1) belegt ist. Da eine eindeutige
Modellidentifizierung jedoch noch
nicht möglich war, wurde ein modeldiskriminierendes
Experiment gemäß
der nachfolgenden Abbildung 7
geplant. Der Versuchsplan berücksichtigte
die Startkonzentrationen
beider Substrate und deren zeitlich
variablen Feed (Obergrenze: 15 ml/
h) wie angegeben. Um eine einfache
Übersetzung der Feed-Trajektorien
zu erreichen, wurde ein jeweils für 6
Stunden konstanter Feed angenommen.
Die maximale Dauer des Experiments
war auf 48 h begrenzt, was
einer 8-fachen potenziellen Feedän-
zu starke Limitierung des Zellwachstums
zu vermeiden. Dieser Fall konnte
dann eintreten, wenn aufgrund einer
noch ungenauen Modellidentifizierung
die Modellaussage für die
Substrataufnahme zu geringe Werte
prognostizierte. Das Problem erscheint
typisch für die sequentielle
Versuchsplanung basierend auf
nicht-linearen Modellen und wird
daher zur Zeit näher untersucht. Damit
verbunden sind auch Untersuchungen
zur Modellerweiterung im
Rahmen der Versuchsplanung, da es
sich zeigte, dass durch die diskriminierend
geplanten Experimente neue
Systemeigenschaften auftreten, die
durch die ursprünglichen Modellansätze
nur teilweise widergegeben
werden können.
Verfahrenstechnik zur
mikrokristallinen
Biohydrierung
Zielsetzung ist die Entwicklung einer
allgemein nutzbaren Verfahrenstechnik
zur Biohydrierung mit ganzen
Zellen.
Reaktionstechnische Probleme
der Biohydrierung mit ganzen Zellen
sind die geringe Wasserlöslichkeit typischer
Edukte und Produkte, sowie
oftmals auftretende Inhibierungen
der biokatalytischen Aktivität schon
bei niedrigen Edukt- und Produktkonzentrationen
in der wässrigen
Phase. Eine Alternative zur oftmals als
„Eduktdepot“ im Bioreaktor eingesetzten,
nicht mit Wasser mischbaren
organischen Phase mit gelöstem
Edukt ist die Bereitstellung des
Edukts in mikrodisperser Form im
Bioreaktor. Zur Erzeugung einer hohen
Stoffaustauschfläche zwischen
Eduktphase und wässrigem Reaktionsmedium
wird das in einem gut
wasserlöslichem Cosolvenz gelöste
Edukt in den Bioreaktor injiziert. Aufgrund
der sofortigen Vermischung
des Cosolvenz (Isopropanol) in der
wässrigen Phase können sehr feine
Edukt-Tropfen in situ erzeugt werden.
Für die Kontrolle der mikrodispersiven
Eduktbereitstellung wird
die 3-dimensionale optische Laser-
Reflexionsmessung (3-D-ORM) eingesetzt.
Damit stehen die aktuelle
Tropfengröße der dispersen Phase
und Tropfengößenverteilung online
zur Verfügung (siehe Abb. 8).
Basierend auf reaktionstechnischen
Untersuchungen (siehe Abb.
9) und den online Signalen der 3-D-
ORM-Sonde werden (intermittierende)
Dosierprofile für ausgewählte
prochirale Ketone entwickelt, wie
z.B. 4-Chloracetophenon und 6-Cl-
3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester,
um hohe Raum-Zeit-Ausbeuten und
Endproduktkonzentrationen bei hohem
Enantiomerenüberschuss in
Fed-batch Prozessen erreichen zu
können.
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Wolberg, M., Müller, M., Chem. Eur.
J. 8 (2002), 4272-4284.
[22] Box, G.E.P., Hill, W.J., Technometrics
9 (1967), 57-71.
Korrespondenzadresse
PD Dr. Werner Hummel
Institut für Molekulare
Enzymtechnologie
Heinrich Heine Universität
Düsseldorf
Forschungszentrum Jülich
D-52426 Jülich
Tel.: 02461-613 790
Fax: 02461-612 490
eMail: w.hummel@fz-juelich.de

GASPHASENKATALYSE
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
105
Enzymatische Gasphasenkatalyse
zur Produktion chiraler
Substanzen
� Dipl.-Chem. Clara Ferloni 1 , Dipl.-Ing. Matthias Heinemann 1 , Dr. Thomas Daußmann 2 , Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs 1 *
1 Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, RWTH Aachen, 2 JFC - Jülich Fine Chemicals GmbH, Jülich
Die enzymatische Gasphasenkatalyse bietet aufgrund einer Reihe an verfahrenstechnischen Vorteilen ein großes Potenzial zur Produktion leichtflüchtiger,
chiraler Feinchemikalien. Im Rahmen der laufenden Arbeiten soll dieses Potenzial erschlossen und ein Verfahrenskonzept der enzymatischen Gasphasenkatalyse
zur Synthese optisch aktiver Feinchemikalien im technisch-industriellen Maßstab entwickelt werden. Im Vordergrund der bereits durchgeführten
Arbeiten stand zunächst die Verbesserung der Langzeitstabilität der eingesetzten Enzyme durch geeignete Immobilisierungsverfahren und
durch Zugabe von Saccharose. Darüber hinaus erfolgte die Entwicklung eines Gasphasen-Batchreaktors für das Screening nach geeigneten Enzymen
und nach Reaktionsbedingungen sowie die eines kontinuierlichen Reaktors zur Produktion im Labormaßstab. In Batchexperimenten konnte gezeigt werden,
dass die Enantioselektivität quasi-trockener Alkoholdehydrogenase (ADH) höher ist als in wässrigen Medien. Nach einer Optimierung der Reaktionsbedingungen
für die Reduktion von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol konnte im kontinuierlich betriebenen Reaktor ein Umsatz von 87 % erreicht
werden, welcher die thermodynamische Grenze darstellt.
Keywords: Gasphase, Katalyse, Enzyme, Alkoholdehydrogenase, Lactobacillus brevis, sekundäre Alkohole, Cofaktorregenerierung.
Einleitung
Die meisten synthetischen Pharmawirkstoffe
und Pflanzenschutzmittel,
die derzeit auf den Markt kommen,
besitzen mindestens ein chirales Zentrum.
Da in der Regel nur ein Enantiomer
biologisch aktiv ist, während
die anderen Enantiomere unerwünschte
Nebenwirkungen zeigen
können, sind aufgrund aktueller Zulassungsbestimmungen
Wirkstoffe in
racemischen Mischungen kaum noch
genehmigungsfähig. Aufgrund des
wachsenden Markts für Feinchemikalien
und chirale Zwischenprodukte
werden Enzyme in der chemischen
Industrie zunehmend als Katalysatoren,
insbesondere für stereoselektive
Synthesen oder Racemattrennungen
unter milden Bedingungen, etabliert.
Dabei werden die Edukte oft in einem
ansatzweisen Prozess durch den Biokatalysator
umgesetzt. Mittels Lösungsmitteln
werden die Produkte anschließend
aus der Produktlösung
extrahiert.
Neben dem Einsatz von Enzymen in
wässrigen oder organischen Medien,
in überkritischem CO 2 oder in ionischen
Flüssigkeiten konnte gezeigt
werden, dass isolierte Enzyme ihre katalytische
Wirkung auch dann entfalten
können, wenn sie in der Gasphase
im annähernd trockenen Zustand
vorliegen, wodurch eine direkte Um-
setzung von gasförmigen Edukten
möglich ist. Der Wasserbedarf der
Enzyme beschränkt sich auf eine etwa
monomolekulare Bedeckung des Enzyms.
Die entstehenden Produkte werden
gasförmig aus dem Reaktor abgezogen
und können leicht durch beispielsweise
fraktionierte Kondensation
von eventuell nicht umgesetzten
Edukten abgetrennt werden.
Überblick über die
enzymatische
Gasphasenkatalyse
Die erste bekannt gewordene enzymatische
Gasphasenreaktion erfolgte mit
dem Enzym Hydrogenase (aus Desulfovibrio
desulfuricans) [1,2]. Das
Edukt dieses Enzyms, Wasserstoff, ist
natürlicherweise gasförmig. Yagi und
Koautoren konnten zeigen, dass das
Enzym auch im trockenen Zustand in
der Lage ist, nicht nur einfache Reaktionen
wie die Umwandlung von ortho-H
2 in para-H 2 und den Austausch
zwischen H 2 und D 2 zu katalysieren,
sondern auch den Elektrontransfer zu
nicht-gasförmigen Akzeptormolekülen.
Seit diesen ersten Arbeiten wurden
enzymatische Gasphasenreaktionen
auch mit weiteren Enzymen untersucht,
die normalerweise fluide
Edukte umwandeln. Erfolgreiche Reaktionen
wurden mit Lipasen [3,4],
mit Oxidasen [5,6,7] und etwas sel-
tener mit Dehydrogenasen [8,9]
durchgeführt. Bei den letztgenannten
Arbeiten wurden die verschiedenen
Alkoholdehydrogenasen mit den erforderlichen
Coenzymen (z. B. NAD + ) zusammen
getrocknet und eingesetzt. Es
konnte gezeigt werden, dass mit quasi-trockenen
Enzymen in der Gasphase
sogar eine Regenerierung des Coenzyms
mit Hilfe eines Cosubstrats
möglich ist. Die Regenerierung des
Coenzyms ist jedoch grundsätzlich nur
mit dem gleichen Enzym möglich, mit
dem auch die angestrebte Umsetzung
O
Ph CH3
NADPH
O
H C CH
3 3
2
Ph CH
LBADH NADP
Cofaktorregenerierung
erfolgt. Offenbar wird beim gemeinsamen
Immobilisieren des Enzyms
und des Coenzyms ein gewisser Anteil
des letzteren im aktiven Zentrum des
Enzyms fixiert und kann dort im quasi-trockenen
Zustand vom Substrat
und Cosubstrat abwechselnd oxidiert
und reduziert werden. Die beiden Arbeitsgruppen,
die bisher Arbeiten mit
Alkoholdehydrogenasen für Umsetzungen
in der Gasphase publizierten,
haben Oxidationsreaktionen durchgeführt.
So wurden mit Pferdeleber-ADH
und mit der ADH des thermophilen
OH
OH
H C CH
Abb. 1: Schema der in der Gasphase durchgeführten Modellreaktion: Reduktion
von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol unter Regeneration des
Coenzyms durch Oxidation von Isopropanol zu Aceton. Enzym und Cofaktor
sind auf Glaskugeln immobilisiert.
3
+
3
3

106 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Abb. 2: Schemazeichnung des
Batch-Reaktors zur Durchführung
von enzymatischen Gasphasenreaktionen.
(A) Aufnahme für das
Enzym; (B) Enzympräparat; (C)
Vorlage der Edukte; (D) Septen für
die Probenahme; (E) Ventil.
Mikroorganismus Sulfolobus solfaricus
aus Butanol, Pentanol und Hexanol
die entsprechenden Aldehyde
hergestellt [8]. Als Cosubstrat diente
in diesem Fall Acetaldehyd. Von einer
zweiten Arbeitsgruppe wurde mit
Hefe-ADH 3-Methyl-2-buten-1-ol zu
3-Methyl-2-butenal umgesetzt [9]. Als
Cosubstrat diente hier Aceton.
Die Abwesenheit jeglicher Art von
fluidem Lösungsmittel stellt einen erheblichen
Vorteil der enzymatischen
Gasphasenreaktionen gegenüber den
konventionellen Verfahren der Enzymkatalyse
dar. Für den Einsatz derartiger
enzymkatalysierter Stoffumwandlungsverfahren
sprechen folgende
Argumente:
– Die Abwesenheit von jeglichen organischen
Lösungsmitteln in solchen
Verfahren ist produktionsintegrierter
Umweltschutz.
– Es können Edukte eingesetzt werden,
die in wässrigen Medien nur sehr
schlecht löslich sind, ohne dass ein
(z. B. organisches) Lösungsmittel benötigt
wird.
– Die Edukte werden ohne Lösungsmittel
zugeführt. Neben einer einfachen
Produktgewinnung (z. B. durch
fraktionierte Kondensation) besteht
somit auch keine Gefahr von Nebenreaktionen
mit den Lösungsmitteln.
– Enzyme im quasi-trockenen Zustand
weisen eine zum Teil stark erhöhte
Stabilität im Vergleich zu wässrigen
Milieus auf [5,9]. Dadurch sind
bei der Gasphasenkatalyse höhere Reaktionstemperaturen
möglich, wodurch
in der Folge höhere Reaktionsgeschwindigkeiten
erreicht werden
können.
– Da Gasphasen-Reaktionssysteme
quasi-wasserfrei sind, lassen sich die
natürlichen Reaktionsrichtungen hydrolytischer
Reaktionen umkehren
und so z. B. auch Veresterungen
durchführen.
– Die Diffusionskoeffizienten in der
Gasphase sind um über drei Zehnerpotenzen
höher als in der Flüssigphase.
Es wird in der Literatur angegeben,
dass daher bei enzymatischen
Reaktionen in der Gasphase Limitationen
beim Stofftransfer zum Enzym
oder innerhalb von porösen Enzymimmobilisaten
kaum zu erwarten
sind [5,9,10].
den, da sie bereits partikulär (quasitrocken)
vorliegen und so leicht im
Reaktor zurückgehalten werden können.
– Aufgrund der extrem wasserarmen
Umgebung und den erhöhten Temperaturen
besteht keinerlei Gefahr einer
mikrobiellen Kontamination der
Reaktorsysteme.
Dem großen, vorteilhaften Potenzial
der enzymatischen Gasphasenkatalyse
stehen jedoch auch Nachteile
gegenüber. Die größte Limitierung ist,
dass nur Stoffe mit einer gewissen
Abb. 3: Verlauf des Anteils an nicht-umgesetztem Edukt während einer
Batch-Gasphasenreaktion. 100 mg lyophilisiertes YADH-Präparat; Temperatur:
30°C; Druck: 1 bar; relative Feuchte: 68 % (eingestellt mit KI); Substratlösung:
100 µl Hexanal und 1 ml Ethanol in 25 ml Wasser.
– Da die Konzentrationen in der Gasphase
niedrig sind, besteht nur eine
geringe hemmende oder deaktivierende
Wirkung der Edukte oder Produkte
auf das Enzym.
– Die Enzyme müssen für den wiederholten
oder kontinuierlichen Einsatz
nicht speziell immobilisiert wer-
Mindestflüchtigkeit in der Gasphase
angewendet werden können. Die enzymatische
Gasphasenkatalyse scheint
daher insbesondere geeignet für die
Produktion niedermolekularer Feinchemikalien
und leichtflüchtiger Substanzen,
wie beispielsweise Riechund
Aromastoffe oder Pheromone.
Abb. 4: Einfluss des absoluten Drucks auf die Reaktionsgeschwindigkeit
und die Dauer der Lag-Phase bei Batch-Gasphasenreaktionen. 100 mg
lyophilisiertes YADH-Präparat; Temperatur: 30°C; relative Feuchte: 68 %
(eingestellt mit KI); Substratlösung: 100 µl Hexanal und 1 ml Ethanol in
25 ml Wasser.
Ziel des Projekts
Mit der enzymatischen Gasphasenkatalyse
haben sich weltweit bisher erst
fünf Gruppen beschäftigt. Neben der
Tatsache, dass bislang noch keine stereoselektive
Stoffumwandlung mittels
enzymatischer Gasphasenkatalyse publiziert
wurde, sind darüber hinaus
noch viele Fragen sowohl grundsätzlich
mechanistischer als auch produktionstechnischer
Natur ungeklärt. Das eigentliche
Potenzial der enzymatischen
Gasphasenkatalyse ist also noch in
keinster Weise erschlossen. Ziel des
Forschungsvorhabens ist daher die
Entwicklung eines Verfahrenskonzepts
der enzymatischen Gasphasenkatalyse
zur Synthese optisch aktiver Feinchemikalien
im technisch-industriellen
Maßstab.
Die geplante Vorgehensweise sieht
neben der Optimierung des Katalysators
(Immobilisierung des Enzyms) die
Entwicklung eines ansatzweise und eines
kontinuierlich betriebenen Reaktors
vor. Mittels eines Modellreaktionssystems
wird der Einfluss diverser Reaktionsbedingungen
untersucht und
eine Methodik entwickelt, anhand derer
die Reaktionsbedingungen gezielt
optimiert werden können. Das zunächst
betrachtete Modellreaktionssystem
ist in Abbildung 1 dargestellt. Es
handelt sich dabei um die Reduktion
von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol.
Die Alkoholdehydrogenase aus
Lactobacillus brevis (LBADH), coimmobilisiert
mit dem Cofaktor NADP + ,
wird dabei als Katalysator eingesetzt.
Die erforderliche Regenerierung des
Cofaktors erfolgt durch die Oxidation
des Cosubstrats Isopropanol zu Aceton.
Enzymimmobilisierung
Der wesentliche Nachteil von Biokatalysatoren
ist, dass diese sehr empfindlich
sind: Sie können leicht deaktiviert
werden und sie erfordern zur
Entfaltung ihrer optimalen katalytischen
Aktivität meist genau eingestellte
Reaktionsbedingungen (pH, Temperatur,
Wasseraktivität, etc.). Die katalytische
Aktivität und Stabilität von
Enzymen kann beispielsweise schon
durch die Art der Immobilisierung
des Katalysators beeinflusst werden.
Eine schonende, von uns gewählte
Immobilisierungsmethode ist die physikalische
Adsorption auf Glaskugeln.
Dafür werden einer Enzymlösung
Glaskugeln (mit ca. 0,3 mm Durchmesser)
zugegeben. Nach längerem
Rühren wird der Ansatz getrocknet.
Durch diese Methode wird eine feine
Verteilung des Enzyms auf der Ober-

fläche des Trägers erzielt. Dabei liegt
die adsorbierte Menge an Enzym bei
ca. 5 mg pro Gramm Trägermaterial.
Durch die Zugabe von Saccharose
zu der Enzymlösung vor der Immobilisierung
konnte die Stabilität des Enzyms
deutlich erhöht werden. So konnte
die Halbwertszeit des Enzyms, ermittelt
in einem bei 40°C kontinuierlich
betriebenen Reaktor, in etwa verfünfzigfacht
werden im Vergleich zu einem
Enzym, das ohne die Verwendung von
Saccharose immobilisiert wurde.
Darstellung des
entwickelten Batch-
Reaktors
Der entwickelte Batch-Reaktor ist in
Abbildung 2 dargestellt. Unterhalb des
Deckels einer Schottflasche ist eine
Aufnahme platziert (A), in der das Enzympräparat
(B) Platz findet. Die Edukte
der Reaktion liegen zusammen mit
einer gesättigten Salzlösung am Boden
der Schottflasche vor (C). Zwei Septen
(D) ermöglichen die Probenahme aus
der Flüssig- sowie aus der Gasphase.
Durch ein Ventil am Deckel (E) kann
der Reaktor auch bei verschiedenen
Drücken betrieben werden.
Im geschlossenen System stellt sich
ein Gleichgewicht zwischen Flüssigund
Gasphase ein: Nur die Moleküle,
die sich in der Gasphase befinden, sind
an der Reaktion beteiligt, während die
Flüssigphase als Speicher für Edukte
und Produkte wirkt. Sobald die Reaktion
die Edukte in der Gasphase verbraucht,
werden aufgrund des Gleichgewichts
neue Eduktmoleküle aus der
Flüssigphase nachgeliefert. Gleichzeitig
werden die Produktmoleküle, die
in der Gasphase freigesetzt werden, in
der Flüssigphase abgeschieden.
Die einfache Bauweise und die simple
Handhabung solcher Reaktoren
erlaubt leicht parallelisierte Experimente
und daher die Generierung großer
Mengen an Daten in kurzer Zeit.
Durchführung
enzymatischer
Gasphasenreaktionen im
Batch-Reaktor
In den ersten Arbeiten mit dem Batch-
Reaktor wurde die Alkoholdehydrogenase
aus Saccharomyces cerevisiae
(YADH) eingesetzt. Grundlegende Einflussparameter
wie Temperatur und
Druck wurden untersucht. Darüber
hinaus wurde die Kinetik der Reaktion
bestimmt.
Die zeitliche Abnahme der gasförmigen
Eduktkonzentration zeigt, wie in
Abbildung 3 dargestellt, einen charak-
Abb. 5: Foto und Schemazeichnung des Reaktors zur kontinuierlichen
Durchführung von enzymatischen Gasphasenreaktionen. (A) Massendurchflussregler;
(B) Vorlagegefäße für Edukte und Wasser; (C) Mischkanal;
(D) Festbettreaktor; (E) Feuchtesensor; (F) Probenahme-Port; (G) Kühlfalle.
teristischen Verlauf: Am Anfang ist eine
kurze „Lag-Phase“ zu erkennen, welcher
eine Phase mit exponentieller
Abnahme - entsprechend einer Kinetik
erster Ordnung - folgt. In Abhängigkeit
der mit der Salzlösung einge-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
107
ausreichende Beweglichkeit des Enzyms
erlaubt, um die katalytischen
Schritte durchzuführen. Die lange Dauer
der Lag-Phase von bis zu 10 % der
gesamten Reaktionszeit ist auf den geringen
Stofftransport innerhalb des
Abb. 6: Abhängigkeit des maximalen Umsatzes während einer kontinuierlichen
Gasphasenreaktion von der relativen Feuchte im System. Temperatur:
25°C; 0,5 g Enzympräparat (auf Glaskugeln adsorbierter LBADH-Rohextrakt
mit 4 mg Protein/g Träger); Fluss 12 ml/min; Aktivität Acetophenon
0,2; molares Verhältnis zwischen Isopropanol und Acetophenon: 60.
so gering, dass die Hydratisierung dennoch
relativ viel Zeit in Anspruch
nimmt. Durch die Reduktion des absoluten
Drucks in den Reaktoren wird
die Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle
in der Gasphase erhöht, was zur
Folge hat, dass die Lag-Phase verkürzt
und die beobachteten (scheinbaren)
Reaktionsgeschwindigkeiten erhöht
werden, wie Abbildung 4 zu entnehmen
ist
In weiteren Batch-Versuchen wurde
die Alkoholdehydrogenase von Lactobacillus
brevis (LBADH) eingesetzt. In
einem durchgeführten Screening
konnten für dieses Enzym geeignete
prochirale Ketone (Edukte), deren Alkohole
als Aromastoffe, Pheromone
oder als Bausteine für andere Feinchemikalien
Anwendung finden, identifiziert
werden. Tabelle 1 zeigt einen Vergleich
der katalytischen Aktivitäten von
LBADH in Flüssig- und Gasphase mit
einigen dieser ausgewählten Edukte. In
dieser Tabelle sind darüber hinaus die
jeweils erzielten Enantiomerenüber-
Tab. 1: Vergleich der relativen Aktivitäten (jeweils bezogen auf Reaktion mit Acetophenon) und Enantioselektivitäten
von LBADH in wässriger Phase und in der Gasphase, erzielt in ansatzweisen Versuchen. Absolute Aktivität bei
der Reaktion von Acetophenon in wässriger Lösung: 150 U/mg; in der Gasphase: 2,5 U/mg.
In wässriger Phase In Gasphase
Edukt Relative EE (R) des Relative Aktivität EE (R) des
Aktivität [%] Produkts [%] [%] Produkts [%]
Acetophenon 100 100 100 100
Sulcaton 70 92 765 >99
3-Octanon 45 97 233 >99
2,4-Pentandion 156 n.b. 107 100
Acetessigsäure Ethylester 201 100 185 100
stellten Feuchtigkeit im Reaktor wird
das trockene Enzym zunächst hydratisiert
[9,11]. Eine optimale Reaktionsgeschwindigkeit
wird erreicht, wenn
die Hydrathülle um das Enzym eine
Reaktors zurückzuführen: Die Diffusionskoeffizienten
in der Gasphasen sind
zwar mehr als drei Zehnerpotenzen höher
als in Flüssigphasen, die treibenden
Konzentrationsgefälle sind jedoch
schüsse angegeben. Aus den dargestellten
Ergebnissen ist ersichtlich, dass die
in den beiden Phasen (Gas- und Flüssigphase)
erzielten relativen katalytischen
Aktivitäten (jeweils bezogen auf
das Standardedukt Acetophenon) unterschiedlich
sind. Ferner kann festgestellt
werden, dass der Enantiomerenüberschuss
bei der enzymatischen Umsetzung
in der Gasphase grundsätzlich
höher ist als in der wässrigen Phase.
Die geringere Beweglichkeit des Enzyms
im quasi-trockenen Zustand ist
vermutlich verantwortlich für die Steigerung
der Enantioselektivität [12].
Dies kann als weiterer Vorteil der enzymatischen
Gasphasenkatalyse betrachtet
werden.
Darstellung des
entwickelten
kontinuierlichen Reaktors
Für die Produktion in größeren Maßstäben
ist ein kontinuierlich betriebener
Reaktor erforderlich. Abbildung
5 zeigt das entwickelte Reaktorsystem

108 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
als Schema und als Fotografie. Das Reaktorkonzept
stellt sich wie folgt dar:
Das Trägergas (Stickstoff) wird filtriert,
getrocknet und in vier Teilströme
aufgeteilt. Der Fluss jeden Teilstroms
wird jeweils mit Massendurchflussreglern
eingestellt (A). Drei Teilströme
werden durch Vorlagegefäße
(B) der flüssigen Reaktionsedukte
(Keton zur Reduktion, Isopropanol
zur Regenerierung des Cofaktors,
Wasser zur Einstellung einer bestimmten
Feuchtigkeit) geleitet. Die angereicherten
Ströme werden danach zusammengeführt
(C). Der Gesamtstrom
stellt den Zufluss zum Reaktor mit
definierter Konzentration an Edukten
dar. Die Konzentrationen der verschiedenen
Komponenten in der Gasphase
sind von der Temperatur und dem Siedepunkt
der Substanzen abhängig. Anhand
einer entwickelten Excel-Tabelle
werden die notwendigen Einstellungen
der Massendurchflussregler berechnet,
sodass der gesamte Trägergasstrom
schließlich genau definierte
Substrat- und Wasserkonzentrationen
enthält, bevor er durch den Festbettreaktor
(D) geleitet wird, in dem
sich das immobilisierte Enzym befindet.
In der Abluft des Reaktors wird
zur Kontrolle die Feuchte (E) gemessen.
Zur Analyse der Edukt- und Produktkonzentrationen
in der Reaktorabluft
werden Proben entnommen (F)
und mittels Gaschromatographie analysiert.
Der gesamte Aufbau befindet
sich in einem temperierten Schrank.
Der Gasstrom, welcher den Reaktor
verlässt, wird nach der Probenahme
in einer Kühlfalle (G) auskondensiert.
Der kontinuierlichen Reaktor zeigt
folgende Vorteile gegenüber dem
Batch-Reaktor:
– Der Gasstrom, der kontinuierlich
das Enzymbett durchströmt, sorgt für
einen schnellen Stofftransport. Damit
können effektive Reaktionsgeschwindigkeiten
beobachtet werden.
– Die Zusammensetzung des Gasstroms
kann genau definiert werden.
Die Interpretation der Ergebnisse ist
im Vergleich zum Batch-Reaktor stark
vereinfacht.
– Durch die Reaktionslimitierung
kann die Stabilität des Enzyms direkt
beobachtet werden.
Durchführung
kontinuierlicher
enzymatischer
Gasphasenreaktionen
Als Modellreaktion für den kontinuierlichen
Reaktor wurde das bereits genannte
Acetophenon-Isopropanol-
LBADH-System eingesetzt. Aus der Li-
Abb. 7: Berechneter und experimentell ermittelter Umsatz in Abhängigkeit vom molaren Verhältnis zwischen Acetophenon
und Isopropanol. Temperatur: 25°C; 0,5 g Enzympräparat (auf Glaskugeln adsorbierter LBADH-Rohextrakt
mit 4 mg Protein/g Träger); Fluss: 15 ml/min; relative Feuchte: 65 %; Aktivität Acetophenon 0,2.
teratur ist bekannt, dass die katalytische
Aktivität von quasi-trockenen
Enzymen vom Wassergehalt im Reaktionssystem
abhängig ist [9]. Daher
wurde in einer Versuchsreihe mit unterschiedlichen,
im Trägergas eingestellten
relativen Feuchten das Optimum
für die LBADH bestimmt. Wie
Abbildung 6 zu entnehmen ist, ist das
Enzym bei niedrigen relativen Feuchten
nur wenig aktiv. Ein sehr steiler
Anstieg der Aktivität ist zwischen der
relativen Feuchte im Gasstrom von
30 % auf 50 % zu erkennen, während
das Optimum bei einem Wert von
65 % auftritt. Der Grund für diese Beobachtung
liegt in der zunehmenden
Hydratisierung und damit steigenden
Beweglichkeit des Proteins, welche
für eine optimale katalytische Aktivität
erforderlich ist.
Zusätzlich zur Optimierung der Reaktionsgeschwindigkeit
ist auch der
maximal erzielbare Umsatz von Bedeutung
für einen Prozess. Dieser ist
abhängig von dem Verhältnis zwischen
Substrat- und Co-Substratkonzentration.
Die Bestimmung geeigneter
Verhältnisse kann unter Zuhilfenahme
der Gleichgewichtskonstanten
der Reaktion berechnet werden. Wie
aus Abbildung 7 zu erkennen ist, steigt
demnach der maximal mögliche Umsatz
mit zunehmendem Verhältnis von
Isopropanol zu Acetophenon an. Da
eine zu hohe Isopropanolmenge im
Trägergasstrom das Enzym deaktivieren
und die nachfolgende Produktaufarbeitung
negativ beeinflussen
würde, wurde ein Verhältnis Isopro-
panol zu Acetophenon von 60 festgelegt,
was bei 25°C einen maximalen
Umsatz von 87 % ermöglicht. Wie Abbildung
7 ebenfalls zu entnehmen ist,
konnten die berechneten Werte in Experimenten
sehr gut bestätigt werden.
Ausblick
Die bislang durchgeführten Arbeiten
dienten in erster Linie der Reaktorentwicklung
sowie der Generierung
grundlegenden Systemverständnisses.
Diese Arbeiten sind nun weitestgehend
abgeschlossen. Als nächster Schritt
steht daher die Weiterverbesserung der
Enzymimmobilisierung an, wodurch
eine bessere Zugänglichkeit für die gasförmigen
Edukte und weitere Stabilisierung
des bislang verwendeten Enzyms
bei höheren Temperaturen und
relativen Feuchten erreicht werden soll.
Alternativ wird auch der Einsatz anderer
thermostabilerer Enzyme getestet.
Parallel dazu werden Synthesen interessanterer
Produkte etabliert. Ferner
wird zur weiteren Produktivitätssteigerung
die Trägergaszubereitung so modifiziert,
dass höhere Substratkonzentrationen
durch den Reaktor geleitet
werden können. Schließlich wird der
kontinuierliche Reaktor in einen größeren
Maßstab zur tatsächlichen Produktion
chiraler Alkoholen übertragen.
Referenzen
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H., J. Am. Chem. Soc. 91 (1969),
2801
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Yagi, T., Biochim. Biophys. Acta 567
(1979), 96-105
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(1992), 467-473.
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Bioeng. 49 (1996), 700-716.
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14 (1992), 1059-1064.
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Legoy, M.D., Enz. Micr. Technol. 31
(2002), 425-430.
[12] Rariy, R.V., Klibanov, A.M., Biocatal.
Biotrans. 18 (2000), 401-407.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs
RWTH Aachen, Lehrstuhl für
Bioverfahrenstechnik
Worringer Weg 1
D-52056 Aachen
Tel.: 0241-80 255 46
Fax: 0241-80 222 65
eMail: buechs@biovt.rwth-aachen.de

DOWNSTREAM-PROCESSING
Modulares
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
109
membranadsorbertechnologisches
Baukastensystem zum
integrierten Downstream
Processing von Pharmatargets
� Dr. Sascha Beutel1 , Dr. Alexander Loa2 , Dr. Oskar-Werner Reif3 , Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber1 , Prof. Dr. Thomas Scheper1 1 2 3 Institut für Technische Chemie, Universität Hannover, Cell Culture Service GmbH, Hamburg, Sartorius AG, Göttingen
Dieses Vorhaben zielt darauf, integrierte Aufarbeitungssysteme zu schaffen, die eine schnelle und gezielte Problemlösung vorliegender Trennaufgaben,
eine Kopplung von Verfahrensschritten und eine einfache Handhabung ermöglichen sollen. Diese integrierten Systeme auf Basis von Membranadsorbern
werden modular als ein Baukastensystem aufgebaut, das eine flexible Anpassung an die jeweilige Problemstellung erlaubt und durch die Integration in
modulare Kartuschensysteme eine hohe Scale-up-Fähigkeit aufweist. Durch diese Prozessintegration werden Energie- und Abwasserkosten gemindert
und so wertvolle Ressourcen geschont. Das Prinzip wird anhand des Modellproteins r-hGH, eines rekombinanten humanem Wachstumsfaktors, entwikkelt
und getestet.
Keywords: Downstream Processing, Membranadsorber, Baukastensystem, Integration, modular, Proteinaufreinigung, Scale-up.
Vorhaben
Isolierung und Aufreinigung von
wertschöpfenden Proteinkomponenten
aus Rohprodukten, wie Fermentationsbrühen,
Blutseren oder Reaktionslösungen,
stellen heute immer
noch die großen Herausforderungen
im Bereich des Downstream Processings
biotechnologischer Pharmazeutika
dar. Bis heute werden unterschiedliche
energie- und abwasserintensive
Verfahrensschritte getrennt
voneinander durchgeführt (s. Abb.
1), so dass darüber hinaus ein erheblicher
apparativer Aufwand betrieben
werden muss. Die hiermit
verbundenen ökonomischen Aufwendungen
machen oft einen Großteil
der Produktionskosten aus, so dass
eine Reduzierung dieses Kostenfaktors
durch Integration der verschiedenen
Verfahrensschritte als die logische
Konsequenz erscheint. Überraschenderweise
ist dieser Ansatz
bisher nicht intensiv verfolgt worden.
Das von der Deutschen Bundesstiftung
Umwelt geförderte Vorhaben
„Innovatives Baukastensystem zum
integrierten Downstream Processing
von Pharmatargets auf der Basis mo-
dularerMembranadsorbertechnologie“ zielt darauf ab, derartige integrierte
Systeme zu schaffen, die eine
schnelle und gezielte Problemlösung
vorliegender Trennaufgaben, eine
Kopplung der Verfahrensschritte und
eine einfache Handhabung ermöglichen
sollen. Diese integrierten Systeme
auf Basis von Membranadsorbern
werden in einem Baukastensystem
verwirklicht, das eine flexible Anpassung
an die jeweilige Problemstellung
erlaubt und durch die Integration
in modulare Kartuschensysteme
eine hohe Scale-up-Fähigkeit aufweist.
Weiterhin sind derartige inte-
grierte Systeme auch ökonomisch
geboten, da sie eine Minimierung des
Ressourcen- und Energieverbrauchs
ermöglichen. Das Projekt ist eine Kooperation
des Instituts für Technische
Chemie der Universität Hannover, der
Fa. Cell Culture Service, Hamburg,
und der Fa. Sartorius, Göttingen. Die
Projektpartner ergänzen sich durch
ihre Expertisen so gut, dass alle
Aspekte des Vorhabens erschöpfend
bearbeitet werden können.
Die praktischen Arbeiten beginnen
mit der Konzeption und Entwicklung
der Basismembranen, wobei verschiedensteDerivatisierungstechni-
Abb. 1: Beispiel für ein Produktionsschema; rt-PA-Aufreinigung bei Fa.
Genentech.
ken zur Funktionalisierung der Membranen
eingesetzt werden. Diese
Funktionalisierung gliedert sich in
drei verschiedene Hauptbereiche,
welche die Schaffung einer hohen
Spezifität für jegliches Targetprotein
ermöglichen. Zuerst erfolgt eine Trägerfunktionalisierung
in Bezug auf
Abb. 2: Modulares Prinzip: Beispiel
Sartobind-Ionentauschermodule
der Fa. Sartorius
die Membranbeschaffenheit und -porengröße,
dann eine Basisfunktionalisierung
mit terminalen Linkern wie
Epoxid-, Aldehyd- oder Hydroxidgruppen,
und zum Schluss eine Ligandenbindung
von Lektinen, Antikörpern
o. ä. als Spezifitätsfunktionalisierung.
Die Einbindung der

110 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
OXYGENASEN
In der chemischen Industrie gibt es
bisher, abgesehen von Fermentationen
zur Alkohol- oder Aminosäurenproduktion,
wenige Beispiele für großtechnische
Anwendungen (über 1000
Jahrestonnen) von Bioprozessen [1].
Biotransformationen in diesem Maßstab
werden fast ausschließlich mit hydrolytischen
Enzymen durchgeführt,
z. B. in der Antibiotikaproduktion.
Oxidoreduktasen katalysieren unter
anderem hoch spezifische Oxyfunktionalisierungen
von Kohlenwasserstoffen
und erlauben so die Herstellung
von funktionalisierten hochwertigen
Grundchemikalien (Synthons), wie
z. B. chiralen Epoxiden, mit bis zu
100% Ausbeute. Solche, für die chemische
Industrie relevanten Reaktionen
sind mit organisch chemischen
Methoden schwierig durchführbar.
Traditionelle chemische, homogenoder
heterogenkatalytische Verfahren
Abb. 3: Schematischer
Aufbau einer Membranadsorbereinheit
im
Technikumsmaßstab.
funktionalisierten Membranen in ein
Modulsystem (s. Abb. 2) und dessen
Testung erfolgt anhand von Modellproteinen
wie r-hGH, einem rekombinanten
humanem Wachstumsfaktor
(r-hGH, human growth hormone).
Die Übertragung der Ergebnisse auf
Realmedien am speziellen Beispiel
des r-hGH führt dann zu einer allgemeinen
Methodik, welche die Optimierung
der Downstream-Bedingungen
ermöglicht. Ein derartiges prozessintegriertes
Downstream Processing-System
erlaubt eine schnelle
und leicht zu handhabende Modellierung
jedes Trenn- oder Aufreinigungsproblems
und vereinfacht so-
mit das Up-scaling in den Produktionsbereich
erheblich (s. Abb. 3),
was anhand des Modellproteins rhGH
demonstriert werden soll.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Thomas Scheper
Universität Hannover
Institut für Technische Chemie
Callinstrasse 3
30167 Hannover
Tel.: 0511-762 25 09
Fax: 0511-762 30 04
eMail: scheper@iftc.uni-hannover.de
Prozessintegrierte rekombinante
Biokatalyse für hochselektive
Oxyfunktionalisierung von
Kohlenwasserstoffen
� Dr. Andreas Schmid1 , Dr. Bruno Bühler1 , Dr. Bernd Bauer2 , Prof. Dr. Horst Chmiel3 , Dr. Bernhard Hauer4 , Dr. Tilo Habicher4 , Dr. Rudolf Krumbholz5 1 2 3 Institut für Biotechnologie, ETH Zürich, Schweiz, FuMA-Tech GmbH, St. Ingbert, Gesellschaft für umweltkompatible Prozesstechnik mbH, Saarbrükken,
4 BASF AG, Ludwigshafen, 5 K.D.-Pharma GmbH, Bexbach
für stereoselektive Epoxidierungen
oder Hydroxylierungen basieren auf
Schwermetallkatalysatoren. Ein biotechnologischer
Ansatz stellt eine öko-
nomisch sowie ökologisch interessante
Alternative dar. Oxygenasen sind besonders
interessant, da sie solche Reaktionen
unter milden Bedingungen
Abb. 1: Schema der Biotransformation von Styrol zu (S)-Styrolepoxid.
Wachsende rekombinante E. coli-Zellen exprimieren die Gene der Styrolmonooxygenase
von Pseudomonas sp. VLB120 und gewährleisten die
Regeneration von NADH. Substrat und Produkt liegen vor allem in der
organischen Phase vor, wodurch deren Toxizität minimiert wird [2].
.
via Einbau von Luftsauerstoff katalysieren
und so enzymdestabilisierende
Peroxide als Kosubstrate oder Koppelprodukte
vermeiden. Viele enzymatische
Oxygenierungen wurden beschrieben,
aber wenige davon sind
komerzialisiert. Dies liegt an der Komplexität
solcher Biokatalysatoren und
an der im Vergleich zu hydrolytischen
Biotransformationen wesentlich anspruchsvolleren
Prozessführung. Oxygenasen
sind häufig relativ instabil,
bestehen aus mehreren, teilweise
membrangebundenen Proteinkomponenten
und benötigen teure Coenzyme
wie NAD(P)H. Deswegen wurden
Oxygenasen bisher vor allem in ganzen,
lebenden Zellen, die kontinuierliche
Enzymproduktion und Coenzymregenerierung
gewährleisten, eingesetzt.
Das hier beschriebene Projekt befasst
sich mit der Lösung verschie-

Abb. 2: Membranmodul für blasenfreie
Begasung sowie Produktaustrag
unter Rückhalt des Biokatalysators.
Das abgebildete Membranmodul
ist chemisch nicht stabil im
Pertraktionsmedium, soll jedoch
unter Verwendung mechanisch
stabiler Hohlfasermembranen entsprechend
angepasst werden.
dener Probleme der Oxygenase-basierten
Biokatalyse mit lebenden Zellen
und baut auf kürzlich entwickelten
Prozessen zur spezifischen Oxygenierung
von Styrol zu (S)-Styrolepoxid
und von Pseudocumol zu 3,4-
Dimethylbenzaldehyd auf [2,3]. Diese
Prozesse basieren auf Fed-Batch
kultivierten rekombinanten Escherichia
coli-Zellen als Biokatalysatoren
und auf einem Zweiphasensystem
bestehend aus wässrigem Medium
und einem organischen Lösungsmittel.
Solche Emulsionsprozesse ermöglichen
die Zugabe und Produktion
hoher Mengen an toxischen und
schwer wasserlöslichen Substraten
und Produkten. Für die Modellreaktion
von Styrol zu (S)-Styrolepoxid ist
das Konzept in Abbildung 1 dargestellt.
In nicht kontinuierlichen Pilotprozessen
im 30 L Maßstab wurden,
bezogen auf die wässrige Phase, Produktivitäten
bis zu 4 g L -1 h -1 erreicht,
was die industrielle Eignung der biokatalytischen
Oxyfunktionalisierung
veranschaulicht.
Aus ökonomischen sowie ökologischen
Gründen ist eine kontinuierliche
oder halbkontinuierliche Prozessführung
vorteilhaft für industrielle
Anwendungen. Dies erfordert eine
effektive Rückextraktion der Produkte
aus der Emulsion sowie eine gewisse
Langzeitstabilität des Biokatalysators,
was die Schwerpunkte des
hier beschriebenen Projekts sind.
Um hohe Expression der Oxygenasegene
und hohe NAD(P)H Regenerationsraten
zu erreichen, wird ein
Besuchen Sie unsere Homepage
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induzierbares effizientes Expressionssystem
(basierend auf dem alk Regulationssystem
von Pseudomonas
putida GPo1) in metabolisch hoch
aktiven wachsenden Zellen eingesetzt.
Eine Verbesserung der Biokatalysatorstabilität
wird durch eine grundlegende
Untersuchung des Stoffwechsels
(NADH und Kohlenstoff Metabolismus)
unter Prozessbedingungen angestrebt.
Die Produktivität solcher
Emulsionsprozesse ist oft durch toxische
Stoffwechselprodukte limitiert,
speziell bei der Verwendung hoher
Biomassekonzentrationen. Solche
Einflüsse sollen in kontinuierlichen
Prozessen charakterisiert werden.
Effektiver Sauerstoffeintrag und
Minimierung des Verlusts an leichtflüchtigem
Substrat werden durch
blasenfreie Begasung über Membranen
angestrebt. Hemmungen durch
toxische Biotransformations- sowie
Stoffwechselprodukte, wie sie bei der
Styrolepoxidproduktion auftreten,
sollen über kontinuierliche Prozessführung
und selektiven Produktaustrag
aus der Emulsion mittels Pertraktion
beseitigt werden. Dafür werden,
wie in Abbildung 2 gezeigt, poröse
Membranen und Module sowie
nicht-poröse Lösungs-Diffusionsmembranen
und die entsprechenden
Prozessführungsstrategien entwickelt.
Dieses Konzept erlaubt auch eine einfachere
und kostengünstigere Produktaufreinigung.
Die erfolgreiche Entwicklung kompetitiver
Prozesse mit hohen Produktivitäten
wird durch enge Zusammen-
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Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
111
arbeit von Biotechnologen und Verfahrensingenieuren
angestrebt. Die
Ergebnisse dieser Arbeit werden allgemein
die Entwicklung neuartiger
Bioprozesse ermöglichen, deren Produktivität
(und damit Wirtschaftlichkeit)
hoch genug ist, um herkömmliche
Prozesse der Petrochemie für die
Funktionalisierung von Kohlenwasserstoffen
durch kostengünstige und
umweltfreundliche biotechnologische
Alternativen zu ersetzen.
Literatur
[1] Schmid, A., Dordick, J.S., Hauer, B.,
Kiener, A., Wubbolts, M., Witholt, B.,
Nature 409 (2001), 258-268.
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Witholt, B., Schmid, A., Biotechnol.
Bioeng. 82 (2003), 833-842.
Korrespondenzadresse
Dr. Andreas Schmid
ETH Zürich
Institut für Biotechnologie
Hönggerberg HPT D73
CH-8093 Zürich, Schweiz
Tel.: + 41 1 633 3691
Fax: + 41 1 633 1051
eMail: andreas.schmid@biotech.biol.
ethz.ch
Impressum
Sonderpublikation „Nachhaltige Biokatalyse“
der Deutsche Bundesstiftung
Umwelt (DBU) in Kooperation mit
dem BioTechnologie Nachrichten-Magazin
|transkript der BIOCOM AG
Herausgeber:
Dr. Stefanie Heiden
Deutsche Bundesstiftung Umwelt
An der Bornau 2
D-49090 Osnabrück
Tel.: (0541)-9633-321
Fax: (0541)-9633-193
eMail: s.heiden@dbu.de
Dr. Rainer Erb
Zentrum für Umweltkommunikation
der Deutschen Bundesstiftung
Umwelt gGmbH
An der Bornau 2
D-49090 Osnabrück
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Fax: (0541) 9633-990
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Stralsunder Str. 58 - 59
D-13355 Berlin | Germany
Tel.: 030/264921-0
Fax: 030/264921-11
eMail transkript@biocom.de
Internet www.biocom.de
Redaktion:
Dr. Rainer Erb
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Tel.: 030/264921-40
Sabine Lohaus
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Druck:
Mayer & Söhne GmbH
Obernbacher Weg 7
D-86544 Aichach
9. Jahrgang 2003
Hervorgegangen aus BioTechnologie
Das Nachrichten-Magazin (1986-88)
und BioEngineering (1988-94)
ISSN 1435-5272
Postvertriebsstück A 49017
© BIOCOM AG, Berlin
® BIOCOM ist eine geschützte
Marke der BIOCOM AG, Berlin
BIOCOM ® AG

112 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
BIOPRODUKTAUFREINIGUNG
Magnettechnologie in der
Bioproduktaufreinigung
� Dr.-Ing. habil. Matthias Franzreb1 , Dipl.-Ing. Niklas Ebner1 , Dr. rer. nat. Martin Siemann-Herzberg2 1 2 Institut für Technische Chemie, Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, Institut für Bioverfahrenstechnik, Universität Stuttgart
Im Rahmen eines Projekts des durch die Deutsche Bundesstiftung Umwelt geförderten InnovationsCentrums Biokatalyse (ICBio) werden die Komponenten
und die Verfahrensführung eines neuen, einfachen und robusten Verfahrens für die Bioproduktaufreinigung entwickelt. Das Verfahren vereint die
Schritte Feststoffabtrennung sowie primäre Produktreinigung und basiert auf dem Einsatz kompakter magnetischer Mikrosorbentien und von auf die
Biotechnologie adaptierter Magnettechnologie. Nach einer Einführung und kurzen Vorstellung der eingesetzten Partikel- und Separatortechnologie werden
anhand der Aufreinigung eines 5xHis-getaggten Green Fluorescent Proteins (GFP) erste Daten für die bisher erreichten Prozessparameter des Verfahrens
angeführt. Zu den wichtigsten Ergebnissen zählen: (i) Im Rahmen eines Partikelscreenings erwiesen sich maghemithaltige Polyvinylalkohol-Partikel
mit “Immobilized metal affinity”-Liganden als geeignete Affinitätssorbentien. (ii) Die anschließende direkte Abtrennung der beladenen Mikropartikeln
aus einem Escherichia coli-Rohaufschluss mittels Magnetseparation gelang mit Filtergeschwindigkeiten von 25 m/h. (iii) Nach erfolgter Waschung vermag
eine einmalige Elution mit 0,1 mol/L Imidazol nahezu 95 % des gebundenen GFP in feststofffreier Form wieder zu desorbieren.
Keywords: Bioproduktaufreinigung, Hochgradienten-Magnetseparation, magnetische Mikrosorbentien, Immobilisierte Affinitätsliganden-Chromatographie,
Green Fluorescent Protein (GFP), integrierte Aufreinigungsverfahren.
Bei der Bioproduktaufreinigung im
technischen Maßstab besteht insbesondere
bei der schnellen und direkten
Abtrennung von Bioprodukten aus Zellaufschlüssen,
Zellkulturen und Zellsuspensionen
Optimierungsbedarf. Der
Grund hierfür ist, dass bei den gängigen
Aufreinigungsschemata eine Adsorptionschromatographie
im Festbett
häufig den ersten eigentlichen Reinigungsschritt
für das Zielmolekül darstellt.
Voraussetzung ist jedoch eine vollständige
Entfernung aller suspendierten
Feststoffe aus dem Zulaufmedium, sodass
der Chromatographie in der Regel
Fällungs-, Zentrifugations- und Mikrofiltrationsstufen
vorausgehen [1]. Die
resultierenden mehrstufigen Aufarbeitungsprozesse
führen zu hohen Produktverlusten,
langen Prozesszeiten sowie
oftmals zu einem hohen Chemikalien-
und Energieaufwand [2]. Die Entwicklung
neuer Verfahren zu einer direkten
Gewinnung von Bioprodukten
aus feststoffhaltigen Medien ist daher
von großem Interesse für eine kostengünstige
und nachhaltige Biotechnologie.
Die vielversprechendsten Ansätze
hierzu basieren auf dem Grundgedanken
mehrere der diskreten Aufreinigungsschritte
zu neuen und innovativen
Prozessen („integrierte Verfahren“) zusammenzufassen.
Vorgestellt wird im Folgenden ein
einfaches und robustes „integriertes
Verfahren“ für die Bioproduktaufreinigung,
das die Schritte Feststoffabtrennung
und primäre Produktreinigung in
Modellsystem dient dabei die Aufreinigung
eines rekombinant hergestellten
5x His-getaggten Green Fluorescent Proteins
(GFP) aus einem Escherichia coli-
Rohhomogenisat [3]. Der Lösungsansatz
basiert auf dem Einsatz magnetischer
Mikrosorbentien zur temporären
Bindung von Bioprodukten in Kombination
mit auf die Biotechnologie zugeschnittener
Magnettechnologie. Das
Grundprinzip folgt dem aus der Bioanalytik
bekannten Schema und ist in Abbildung
1 dargestellt. Im Unterschied
zur Bioanalytik muss das Schema für
einen Einsatz in der Bioproduktaufreinigung
aber in einem um mehrere Größenordnungen
erhöhten Maßstab realisiert
und vollständig automatisiert
werden. Hierdurch ergeben sich multidisziplinäre
Herausforderungen, wie
z. B. die gentechnologische Synthese
von für das Verfahren geeigneten Stämmen,
die kostengünstige Herstellung
magnetischer Mikrosorbentien sowie
die Entwicklung geeigneter Magnetseparationstechnologie
im technischen
Maßstab, wobei im letzteren Fall auf die
Erfahrungen aus dem industriellen Ein-
satz von Magnetseparatoren in der Erzaufbereitung
und der Wassertechnologie
aufgebaut werden kann [4,5].
Magnetische Sorbentien
Mit sehr wenigen Ausnahmen besitzen
biologische Substanzen diamagnetische
Eigenschaften, d. h. sie werden von einem
Magneten sehr schwach abgestoßen,
wodurch eine direkte Nutzung von
Magnetfeldern zu ihrer Handhabung
praktisch auszuschließen ist. Um dennoch
ein breites Anwendungsfeld für
magnetische Verfahren in der Biotechnologie
zu erschließen, ist es daher stets
notwendig die biologischen Substanzen
an magnetische Sorbenspartikel zu binden.
Diese Bindung kann in gewissen
Fällen, wie z. B. bei der Immobilisierung
von Enzymen, irreversibel erfolgen.
In der Regel wird aber eine reversible
Bindung angestrebt, die zum einen
stark genug ist, um eine ausreichende
Selektivität für die Zielsubstanz
zu erreichen, und zum anderen jedoch
durch eine Änderung der Milieubedingungen
wieder vollständig gelöst wer-
einem Verfahrensschritt vereint. Als Abb. 1: Prinzip der Magnettrenntechnologie im Milliliter-Maßstab.
den kann. Am Anfang der Entwicklung
jedes auf Magnettechnologie basierenden
Aufreinigungsverfahrens steht daher
die Suche nach geeigneten Partikeln.
Ausgangsbasis des Screenings nach
geeigneten magnetischen Grundpartikeln
waren die Eckpunkte: (i) Kompakte,
unporöse Partikelstruktur mit
ca. 1 µm Durchmesser, (ii) superparamagnetische
Eigenschaften ausreichender
Stärke für eine rasche und effiziente
Magnetseparation, (iii) chemisch
und mechanisch robust, (iv)
Partikeloberfläche liegt in einer Form
vor, die eine breite Palette weitergehender
Funktionalisierungen erlaubt, und
(v) die Oberfläche zeigt eine geringe
unspezifische Bindungsaffinität. Mit
Bezug auf das gewählte Modellsystem
wurden folgende Grundpartikeltypen
mit Iminodiacetatgruppen (IDA) funktionalisiert
(siehe Kasten), um nach
anschließender Kupferbeladung der
Chelatgruppen verschiedene, für Hisgetaggte
Proteine selektive, Affinitätssorbentien
zu erhalten.
– Polyglutaraldehyd gecoatete Ferritpartikel
(PGF) [6]
–Maghemithaltige Polymethacrylatpartikel
(mPMA)
– Maghemithaltige Polyvinylalkoholpartikel
(M-PVA) [7], 2 Varianten
Verfahrensführung und
Partikelseparation
Ein Ansatz zur Übertragung des in Abbildung
1 dargestellten Prinzips in den

technischen Maßstab ist in Abbildung
2 dargestellt. Die Abbildung zeigt das
Fließbild der verwendeten Laborversuchsanlage
sowie eine Detailvergrösserung
des Magnetseparationsbereichs.
Nach der Sorption der Biomoleküle an
magnetische Mikrosorbentien in einem
externen Rührreaktor wird die partikelhaltige
Suspension durch die Abscheidekammer
eines Magnetseparators
gepumpt. Hierbei werden die produktbeladenen
magnetischen Sorbentien
zurückgehalten, während z. B. unmagnetische
Zellbruchstücke den Separator
ungehindert passieren. Zum
Waschen und zur Elution wird der
Kreislauf der Laboranlage zunächst bei
eingeschaltetem Magnetfeld mit einer
entsprechenden Lösung gefüllt. Anschließend
erfolgt bei ausgeschaltetem
Magnetfeld ein ca. einminütiges Umpumpen
der Partikel in einem Loop,
gefolgt von einem Ausschleusen der
Wasch- bzw. Elutionslösung, wobei die
Partikel wiederum durch das Magnetfeld
zurückgehalten werden. Abschließend
werden die Partikel aus dem System
ausgespült und für den nächsten
Zyklus verwendet.
Aufgrund der geringen Größe der
Mikrosorbentien sowie der großen zu
verarbeitenden Volumina lässt sich die
nach den Sorptions-, Wasch- und Elutionsschritten
notwendige Partikelabtrennung
nicht mit Hilfe einfacher
Handpermanentmagnete oder Trommelmagnetseparatoren
erreichen. Vielmehr
kommen so genannte Hochgradienten-Magnetseparatoren
[4,9] zum
Einsatz, welche die magnetischen Partikel
in einem Filter aus magnetisierbarem
Drahtgewebe zurückhalten (siehe
Ausschnittsvergrößerung Abbildung
2). Die Maschenweite des Drahtgewebes
liegt bei ca. 1 mm und der Filter
hat durch die Verwendung von unmagnetischen
Abstandshaltern eine hohe
Porosität von ca. 95 %. Hierdurch können
unmagnetische Zellen und Zelltrümmer
den Filter ungehindert durchdringen
und es treten auch im Falle von
Zellhomogenisaten hoher Viskosität
nur geringe Druckverluste auf.
Aufreinigung eines
5x His-getaggten Green
Fluorescent Proteins (GFP)
Sorption
Zum Vergleich der Aufreinigungsleistung
der verschiedenen magnetischen
Träger wurden Adsorptionsisothermen
für eine nach dem Zellaufschluss ungeklärte
GFP-Lösung bestimmt. Je 2 mL
verschieden konzentrierter GFP-Lösungen
wurden mit 4 mg der kupferbeladenen
IDA-Partikeln 15 min lang
Herstellung
magnetischer Sorbentien
mit Chelatliganden am
Beispiel von M-PVA
Ausgangspunkt bilden mittels Suspensionspolymerisationhergestellte
maghemithaltige Polyvinylalkoholpartikel
der Firma chemagen Biopolymer-Technologie
AG. Diese Partikel
zeichnen sich durch eine stark
hydrophile Oberfläche, geringe unspezifische
Sorption und eine hohe
chemische und mechanische Robustheit
aus. Ausgehend von diesen
Primärpartikeln erfolgt die Einführung
chelatbildender Iminodiacetatgruppen
(IDA), wobei Allyl-Gly-
Abb. 2: Schema der Versuchsanlage zur Bioproduktaufreinigung.
geschüttelt. Aufgrund von Kinetikversuchen
erwies sich diese Zeit für das
gewählte System als ausreichend. Nach
Einstellung der Gleichgewichtsbeladung
der Partikel mit dem Zielprotein
GFP wurden die Partikel zweimal mit
Waschpuffer (20 mM NaH 2 PO 4 , 0,2 M
NaCl, pH 6,8) gewaschen, um unselektiv
gebundenes Protein weitgehend zu
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
113
entfernen. Anschließend wurde mit
Elutionspuffer (0,2 M Imidazol, 0,2 M
NaCl, pH 7,1) zweimal je 10 min eluiert
und somit die Protein-Beladung der
Partikel bestimmt. Abbildung 3 zeigt
die bei 25°C gemessenen Beladungswerte
mit GFP unter Gleichgewichtsbedingungen
sowie die dazugehörigen
Adsorptionsisothermen.
Abb. 3: Beladungskapazitäten für verschiedene magnetische Sorbentien.
cidyl-Ether zur Aktivierung und zur
Einführung eines Spacers eingesetzt
wird. Die endständige Doppelbindung
der allylaktivierten Partikel
lässt sich mittels N-Bromsuccinimid
(NBS) leicht bromieren [8]. Abschließend
erfolgt die Bindung des
IDAs im Alkalischen .
Diese lassen sich gut durch das Modell
von Langmuir beschreiben, dem
folgende Gleichung zugrunde liegt:
q = (q max x c*)/(K d + c*),
wobei q die Menge des gebundenen
Proteins, q max die maximale Beladungskapazität
und K d die Gleichgewichtskonstante
beschreibt. c* gibt die Konzentration
des Proteins im Überstand nach
Gleichgewichtseinstellung an. Tabelle 1
führt die Adsorptionsparameter für die
verschiedenen Partikelvarianten auf.
Eine optimierte Variante der M-PVA-
Partikel (M-PVA_I) zeigt hierbei mit
276 mg GFP/g Trägermaterial die höchste
Beladungskapazität der untersuchten
Mikrosorbentien. Die anderen untersuchten
Trägermaterialen zeigen
niedrigere Sättigungskapazitäten, was
auf niedrigere Ligandendichten zurückzuführen
ist (Ergebnisse nicht dargestellt).
Die geringen K d -Werte von unter
1,8 µM deuten bei allen Partikelsorten
auf eine hohe Selektivität der Mikrosorbentien
hinsichtlich des Zielproteins
hin.
Elution
Das Desorptionsverhalten von GFP in
Abhängigkeit von der Imidazolkonzentration
im Elutionsmitttel ist in
Abbildung 4 dargestellt. Quantifiziert
wurde die eluierte Menge an GFP bei
Verwendung der Partikelsorten M-
PVA_II und PGF. Die Imidazolmenge
im Elutionspuffer (Imidazol, NaCl, pH
7,1) wurde von 0,01 bis 1,0 mol/L variiert,
die Gesamt-Ionenstärke wurde
durch eine angepasste NaCl-Konzentration
bei 1,0 mol/L konstant gehalten,
um deren Einfluss auf die Desorption
zu unterdrücken.
Wie die Abbildung zeigt, reicht bei
den M-PVA_II-Partikeln eine Imida-

114 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Tab. 1: Angepasste Langmuir-Parameter für die GFP-Adsorption.
Partikelsorte q max K d (µM) q max /K d
(mg GFP/g Träger) (L/g Träger)
M-PVA_I 275,9 0,68 15,08
M-PVA_II 92,1 1,37 2,50
PGF 63,9 0,18 13,20
mPMA 179,8 1,75 3,82
zolkonzentration von ca. 0,1 mol/L
aus, um nahezu 95 % des gebundenen
GFP zu desorbieren. Dies entspricht
praktisch der maximalen GFP-
Menge, die von diesen Partikeln in einem
Elutionsschritt desorbiert werden
kann (96 % bei 1,0 mol/L Imidazol).
Für die PGF-Partikel ist eine mehr als
doppelt so hohe Imidazolkonzentration
von über 0,2 mol/L nötig, um die
Größenordnung der in einem Elutionsschritt
maximal desorbierbaren
Menge zu erreichen. Diese beträgt allerdings
nur ca. 90 % von der sorbierten
Gesamtmenge an GFP, sodass ein
zweiter Elutionsschritt ratsam ist. Ne-
zyklus. Ein Aufreinigungszyklus besteht
aus der Sorption des Proteins,
zweimaligem Waschung mit Waschpuffer
und einer anschließenden einoder
zweimaligen Elution (Bedingungen
und verwendete Puffer siehe
oben). Anschließend stehen die Partikel
nach Entfernung des Elutionsmittels
durch zweimaliges Waschen mit
Puffer (20 mM NaH 2 PO 4 , 0,2 M NaCl,
pH 6,8) für einen erneuten Zyklus zur
Verfügung.
Die maximalen Beladungskapazitäten
der Partikelsorte M-PVA_II in mg
eluiertes GFP pro g Träger sind in Abbildung
5 über mehrere Aufreini-
Abb. 4: Elutionseffizienz in Abhängigkeit der Imidazolkonzentration.
ben der höheren Sorptionskapazität
sprechen daher auch die Ergebnisse
der Elutionsuntersuchungen für eine
Verwendung der M-PVA-Partikel.
Wiederverwendung
Wichtig für eine automatisierte Betriebsweise
im technischen Maßstab
ist eine häufige Wiederverwendung
der Partikel. Hierbei ist der Verlust von
Cu 2+ -Ionen bei der Elution mit Imidazol
dann kritisch, wenn die maximale
Sättigung der Partikeln mit GPF nicht
mehr gewährleistet ist (Ergebnisse
nicht gezeigt), wie z. B. im Falle eines
zweiten Elutionsschritts oder bei zu
niedriger Ausgangskonzentration der
Biorohsuspension im Vergleich zur
gewählten Partikelkonzentration. Der
Verlust an Kupferionen bewirkt eine
Verringerung der Sorptionskapazität
an Protein im nächsten Aufreinigungs-
gungszyklen aufgetragen, wobei im
ersten Versuch zweimal (rote Symbole),
im zweiten Versuch nur einmal
eluiert wurde (blaue Symbole). Beidesmal
fand zwischen den Aufreinigungszyklen
keine Wiederbeladung
des Metallchelatbildners mit Cu 2+ -Ionen
statt.
Deutlich zu sehen ist der sehr
schnelle Abfall der maximalen Aufreinigungskapazität
bei einer zweimaligen
Elution. Bereits bei der vierten
Aufreinigung ist die Kapazität der Partikel
um 68 % von 96 mg GFP/g Träger
auf 31 mg GFP/g Träger gesunken.
Bei einmaliger Elution ist ein Rückgang
der Beladungskapazität auf ca.
31 mg GFP/g Träger erst im siebten
Zyklus zu verzeichnen. Da bei den M-
PVA-Partikeln auf eine zweite Elution
verzichtet werden kann (siehe oben),
ist eine erneute Beladung des Chelat-
lativ geringen Kapazitätsverlusten erst
nach dem dritten oder vierten Zyklus
notwendig. Wird nach jedem Zyklus
der Chelatbildner neu mit Cu 2+ -Ionen
beladen (schwarze Symbole) bleibt
die Kapazität der Partikeln hinsichtlich
des Modellproteins über viele
Zyklen voll erhalten.
Demonstration im 200 mL
Maßstab
Parallel zu den Detailstudien über das
Sorption-, Elutions- und Wiederverwendungsverhalten
der magentischen
Mikrosorbentien wurde die Leistungsfähigkeit
des Verfahrensprinzips in
Versuchen mit 200 mL Rohlysat demonstriert.
Abbildung 6a zeigt die
SDS-Gelanalyse der Fraktionen eines
entsprechenden Versuchs zur GFP-
Aufreinigung. Die verwendeten Puffer
entsprachen dabei den im Abschnitt
Sorption genannten. Die eingesetzte
Menge von 1,5 g M-PVA_II Partikeln,
entsprechend einer GFP-Aufnahmekapazität
von ca. 150 mg, wurde im Hinblick
auf hohe Reinheiten des Eluats
gewählt und nicht unter dem Aspekt
einer hohen Ausbeute. Wie aus dem
Gel zu erkennen ist, bildet GFP die einzige
Bande der beiden Elutionsfraktionen.
Zur Verdeutlichung, dass sich
das Verfahren nicht auf das hier eingehend
untersuchte Modellprotein
GFP beschränkt, ist mit Abbildung 6b
noch eine Gelanalyse der Aufreinigungsfraktionen
eines His-getaggten
technischen Enzyms beigefügt, wobei
Details hierzu in einer späteren Veröffentlichung
folgen.
Zusammenfassung und
Ausblick
Im bisherigen Projektverlauf ist es gelungen,
die Proteinaufreinigung mittels
magnetischer Mikrosorbentien von
ursprünglich 1-2 mL auf einen Maßstab
von aktuell 0,2 L Bakteriensuspensionen
(20 % v/v Zellmasse) pro Zyklus
zu übertragen. Hierzu waren die Entwicklung
und Produktion neuer leistungsstarker
magnetischer Mikrosorbentien,
ein Übergang von einfachen
Handpermanentmagneten zu Hochgradienten-Magnetseparatoren
sowie die
Erarbeitung und Optimierung geeigneter
Verfahrensprotokolle notwendig. Im
Falle des Modellsystems eines GFP-haltigen
Eschericha coli-Rohhomogenisats
ergibt sich aus der 20 %-igen Zellsuspension
eine Ausbeute von ca.
0,15 g nahezu reinen GFPs. Im weiteren
Verlauf des Projekts wird eine weitere
Maßstabsvergrößerung des Verfahrens
angestrebt. Hierzu ist derzeit ein
Magnetseparator mit größerer Filtermatrix
in Konstruktion, der im Falle des
Modellsystems ca. 3-4 Liter ungeklärte
Biorohsuspension - entsprechend ca.
5g gereinigtem Protein - pro Aufreinigungszyklus
durchsetzen kann. Parallel
werden weitere Partikelsorten mit
neuen Affinitätsliganden entwickelt, um
die Palette einsetzbarer Tags zu erweitern.
Eine sehr reizvolle längerfristige Aufgabe
wird schließlich die direkte Kopplung
des Magnettrennverfahrens an
Routineverfahren zur Herstellung rekombinanter
Proteine darstellen. Im
Falle der Kultivierung von rekombinanten
Bakterien wie Escherichia coli
können in so genannten Hochzelldichteverfahren
bis zu 100 g Biotrockenmasse/L
Reaktorvolumen hergestellt
werden [10]. Dieses entspricht einer
ca. 30 %-igen (v/v) Zellsuspension, die
sich anschließend mittels einer kontinuierlicher
Rührwerkskugelmühle im
technischen Maßstab vollständig aufschließen
lässt. Das vorgestellte Magnettrennverfahren
ist in der Lage, dieses
Rohlysat direkt weiter zu verarbeiten
und dabei die Schritte Feststoffabtrennung
und primäre Produktreinigung
zu vereinen.
bildners mit Cu 2+ -Ionen bei noch re- Abb. 5: Beladungskapazität über mehrere Beladungszyklen.

Literatur
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bed adsorption - Principles
and methods In: Amersham Pharmacia
Biotech., 91-630-5519-8.
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the treatment of minerals, Elsevier
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(2001), 51-58.
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313.
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Chromatogr. A 75 (1997), 39-50.
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W.H., IEEE Transactions on Applied
TEXTIL
Abb. 6: SDS-Gelanalyse der Aufreinigungsprozedur des His-getaggten
Modellproteins eGFP (a) sowie eines technischen Enzyms (b) mittels Magnettrenntechnik
am HGMS durch Verwendung von M-PVA_II Partikeln. M:
Molekularer Proteinmarker; 1: Zellaufschluss; 2: Sorptionsüberstand; 3:
vereinigte Waschfraktionen mit: 3.1, 3.2, 3.3 (1.-3. Durchgang); 4: 1. Elutionsfraktion;
5: 2. Elutionsfraktion. Färbung des 10 %-igen SDS-Gels mittels
Coomassie
Superconductivity 12 (2002), 963-
966.
[10] Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M.,
Syldatk, C., Mattes, R., Siemann, M.,
Altenbuchner, J., Biotechnol. Bioeng.
73 (2001), 95-103.
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
115
Projektpartner
–Dr. habil. Matthias Franzreb, Dipl.-
Ing. Niklas Ebner, Institut für Technische
Chemie, Forschungszentrum
Karlsruhe GmbH
Oxidative Enzyme in der
Textilindustrie
–Dr. Josef Altenbuchner, Dr. Zsuzsana
Mayer, Institut für Industrielle Genetik,
Universität Stuttgart
– Prof. Dr. Christoph Syldatk, Dr. Rudolf
Hausmann, Dr. Martin Siemann-
Herzberg, Dipl.-Biol. Christina Fritz,
Dipl.-Biol. t.o. Nikolaus Rahaus, Dipl.-
Biol. t.o. Nadja Schultz, Institut für Bioverfahrenstechnik,
Universität Stuttgart
–Dr. Lothar à Brassard, Dr. Jürgen
Oster, Dr. Thomas Sommer, chemagen
Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft,
Baesweiler
–Dr. Uwe Habich, Steinert Elektromagnetbau
GmbH, Köln
Korrespondenzadresse
Dr.-Ing. habil. M. Franzreb
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Institut für Technische Chemie
(ITC-WGT)
Hermann-von-Helmholtz-Platz 1
76344 Eggenstein-Leopoldshafen
Tel./Fax: 07247-82-3595/6660
eMail: matthias.franzreb@itc-wgt.fzk.de
� Dr. Eva Schuh1 , Dr. Elisabeth Heine1 , Dipl.-Chem. Nabil Daâloul1 , Prof. Dr. Hartwig Höcker1 , Dipl.-Ing. Rudi Breier2 , Dr. Anke Mondschein3 , Dr. Anke
Apitz3 , Prof. Dr. Karl-Heinz van Pée3 , Dr. Katrin Scheibner4 1 2 3 Deutsches Wollforschungsinstitut an der RWTH Aachen e.V. (DWI), Textilchemie Dr. Petry GmbH, Reutlingen (Dr. Petry), Institut für Biochemie, TU
Dresden (TU-Dresden), 4 JenaBIOS GmbH, Jena (JenaBIOS)
Die Textilindustrie ist eine Branche mit
hohem Energie- und Stoffverbrauch, bei
der die Hauptfracht der Emissionen
über das Abwasser erfolgt. Der Einsatz
von biotechnischen Verfahren kann zu
einer erheblichen Entlastung der Umwelt
und gleichzeitig zu Wettbewerbsvorteilen
im umkämpften Markt führen.
Die hier vorgestellten Arbeiten befassen
sich mit dem Einsatz von Enzymen in
der Veredlung von Wolle und Baumwolle.
Ziel des Verbundvorhabens ist die
Entwicklung und industrielle Umsetzung
alternativer Verfahren zur Carbonisur
von Wolle und zur Baumwollbleiche unter
Verwendung oxidativer Enzyme, die
im Rahmen des Projekts für diese beiden
Anwendungsbereiche produziert
und optimiert werden. Konventionell
kommen sowohl bei der Carbonisur als
auch bei der Baumwollbleiche Chemikalien
zum Einsatz, die Abwasser und
Maschinenteile belasten. Das Ziel des
ersten Teilbereichs ist es, mit Hilfe der
enzymkatalysierten Oxidation von Vegetabilien
in Wolle die bei der klassischen
Carbonisur eingesetzten Chemikalienmengen
zu reduzieren bzw. zu ersetzen
und die Schädigung der Wolle zu mi-
Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Grassamen (a)
und Ringelkletten(b), den Ausgangssubstraten für die Inkubation mit den
Oxidoreduktasen.
nimieren. Durch die Anwendung von
Oxidoreduktasen soll ein in der Papierherstellung
erprobtes Verfahren in der
Wollveredlung nutzbar gemacht werden.
Ziel des zweiten Teilbereichs ist es, mit
Hilfe von Oxidoreduktasen die farbigen
Begleitstoffe der Baumwolle zu zerstören.
Durch die enzymatische Bleiche soll
die Menge an Lauge, die bei der Peroxid-Bleiche
benötigt wird, und die Salzfracht
im Wasser reduziert sowie auf den
Zusatz von anorganischen Salzen als Stabilisatoren
verzichtet werden.
Einleitung und
Fragestellung
Im Rahmen des Verbundvorhabens
werden alternative Verfahren zur Car-

116 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
bonisur von Wolle und zur Bleiche von
Baumwolle unter Einsatz oxidativer
Enzyme entwickelt und im Pilotmaßstab
etabliert. Obwohl diese beiden Verfahren
gänzlich unterschiedliche textile
Schwerpunkte darstellen, kommen
in beiden Fällen die gleichen Enzyme
zum Einsatz. Die Kombination dieser
unterschiedlichen Themenkomplexe in
einem Verbundprojekt bietet demnach
den Vorteil, dass die notwendigen Entwicklungsarbeiten
im Hinblick auf Enzymproduktion
und -optimierung für
beide Bereiche zum überwiegenden
Teil durch den biotechnologisch orientierten
Verbundpartner (JenaBIOS:
Laccase, Mangan-Peroxidase) übernommen
werden; ein Teilbereich (Peroxidase)
wird durch das Institut für
Biochemie der TU Dresden abgedeckt.
Die Realisierung der Verfahren im Labormaßstab
erfolgt durch die Forschungsinstitute
(DWI: Wollveredlung;
TU Dresden: Baumwollveredlung) und
die Umsetzung der Verfahren in den Pilotmaßstab
im Hinblick auf den Transfer
in die Textilveredlungsbetriebe
durch den Hilfsmittelhersteller (Dr.
Petry), der sowohl auf dem Sektor der
Woll- als auch der Baumwollveredlung
Expertise aufweist.
Carbonisur vegetabiler
Bestandteile in Wolle
Als Vegetabilien werden pflanzliche
Überreste in Wolle bezeichnet. Die Kontamination
von Wolle mit Vegetabilien
ist auf die Weidebedingungen und die
Bedingungen, unter denen die Schafe
gehalten werden, zurückzuführen.
Menge und Art der Vegetabilien sind
Faktoren, die zu Preisminderungen der
Ware führen. Bei den Pflanzenresten
handelt es sich um die klettenförmigen
Verbreitungseinheiten bestimmter Futterpflanzen
sowie Heu, Stroh und begrannte
Grassamen. Die verholzten spiralbandigen
Kletten der Pflanzengattung
Medicago können bis zu 30 % des Vegetabiliengehalts
von Waschwolle ausmachen
[1]. Im Allgemeinen sind Kletten,
insbesondere Ringelkletten (Abb.
1), vorzugsweise bei Australwollen zu
finden, Steinkletten bei Capwollen, bei
beiden Provenienzen aber auch bestimmte
Gräserarten (Ringelkletten:
Xanthium spinosum, Medicago denticulata,
laciniata, minima; Gräser:
Barley grass [Hordeum lepinorum])
[2]. Europäische Wollen sind weniger
durch Kletten als durch Gräser und
Stroh verunreinigt. Einige Kletten werden
durch Krempeln und Kämmen erfolgreich
entfernt, andere können so
feinfaserig vorliegen, dass sie sich wie
die Wollfasern selbst verhalten und mit
Abb. 2: Reaktionsmechanismus für den mikrobiellen Ligninabbau durch
Manganperoxidase aus Nematoloma frowardii.
gekämmt werden. Diese Vegetabilien
können bei der Verarbeitung und Veredlung
der belasteten Wolle zu Problemen
führen, z. B. verursachen Klettenfragmente
beim Spinnen Fadenrisse
oder unerwünschte Verdickungen im
Faden. Bereits kleine Anteile an Vegetabilien
in Tuchen verändern den Griff
bzw. das Aussehen, da sie zu Fehlfärbungen
führen. Krempel, Kämme und
Spinnstrecken werden bei der Wollverarbeitung
durch Vegetabilien mechanisch
belastet [3]. Die chemische Methode
zur Entfernung der Vegetabilien
ist die Carbonisur. Hierbei wird die
gewaschene Wolle in ein Bad mit 6-8 %
Schwefelsäure gegeben, abgequetscht,
vorgetrocknet und dann bei Temperaturen
von über 100°C “gebrannt”. Die
durch die Trocknung hervorgerufene
Konzentrierung der Säure bewirkt eine
Dehydratisierung (Verkohlung) der
Cellulose. Die Reste der carbonisierten
Vegetabilien können durch Walzen zerkleinert,
der Klettenstaub anschließend
ausgeklopft und die Wolle neutralisiert
und gespült werden. Von harten Schalenteilen
wird die Säure jedoch nicht
gut aufgenommen, daher sind diese
Stücke auch nach der Carbonisur kaum
zu zertrümmern. Die Carbonisur ist
nicht unproblematisch für die Wolle
selbst. Neben den Vegetabilien kann
a) b)
auch die Wolle durch die Säure geschädigt
werden. Die gesamten Wollverluste
können je nach vorliegender Rohwolle
12 % und mehr betragen.
Bleichen von Baumwolle
Die Baumwollfaser ist ein einzelliges,
bandartig flaches Gebilde mit meist
kräftiger Zellwand. Sie besteht zu 90-
95 % aus reiner Cellulose und erscheint
unter dem Mikroskop als flaches Band
mit korkenzieherartigen Drehungen.
Diese Windungen greifen beim Verspinnen
scharnierartig ineinander, sodass
die Fasern gut im Garn haften. Baumwolle
enthält außerdem Baumwollfette
und -wachse, Ligninreste, Proteine,
Pektine und Mineralstoffe [4]. Je nach
Herkunftsland ist Rohbaumwolle weiß
(Peru Pima), gelb oder braun (ägyptische
Baumwolle) gefärbt.
Besonders die gelb- und braungefärbte
Baumwolle, deren Farbe in erster
Linie durch die anhaftenden Ligninreste
verursacht wird, muss in der Vorbehandlung
des Textilguts gebleicht
werden, um nachfolgend eine einheitliche
Färbung der Garne erreichen zu
können. Lange Zeit wurde Hypochlorit
als bleichendes Agens eingesetzt. Aus
Gründen der Umweltverträglichkeit ist
es heute in Deutschland überwiegend
Abb. 3: Benetzbarkeit von unbehandelter (a) und mit hydrolytischen Enzymen
behandelter Baumwollmaschenware (b) (TEGEWA-Tropfentest).
durch Wasserstoffperoxid ersetzt [5].
Wasserstoffperoxid ist eine schwache
Säure, die sich in wässriger Lösung
leicht zersetzt. Wird dieser wässrigen
Lösung Alkali zugesetzt, entstehen Hydroperoxidanionen,
die als das wirksame
Agens bei der Bleiche mit Peroxid
angesehen werden. Die Zersetzung
des Wasserstoffperoxids steigt mit zunehmender
Temperatur, zunehmendem
pH-Wert und wird durch Schwermetalle
und leicht oxidierbare Substanzen
katalysiert. Schwermetalle müssen
daher vor dem Bleichprozess maskiert
und die Eigenzersetzung bei der Dosierung
des Wasserstoffperoxids unter
Prozessbedingungen berücksichtigt
werden. Einen optimalen Bleicheffekt
erzielt man bei pH 11, der mit einem
Minimum an Faserschädigung zusammenfällt
und daher meist zur Anwendung
kommt. Andere eingesetzte
Bleichmittel sind z. B. Peressigsäure als
mildes Agens und Natriumdithionit als
reduzierendes Bleichmittel. Es ist günstig,
vor der Bleiche die Faser alkalisch
abzukochen. Dazu kommt gewöhnlich
Natronlauge zum Einsatz [6]. Durch
jedes Bleichverfahren wird die Cellulose
mehr oder weniger abgebaut, was
sich in einer Abnahme des Durchschnittspolymerisationsgrads
(DP) äußert.
Es ist daher nicht beliebig oft zu
wiederholen.
Das Ziel einer guten Bleiche ist es,
einen hohen Weißgrad, eine gute Haltbarkeit
des Weiß und eine gute Saugfähigkeit
der Ware mit geringstmöglicher
Faserschädigung und einer hohen
Wirtschaftlichkeit zu erreichen.
Der mikrobielle
Ligninabbau
Der mikrobielle Ligninabbau ist ein
generell aerober, oxidativer Prozess.
Eine Reihe von Mikroorganismen, sowohl
Pilze als auch Bakterien (Actinomyceten),
besitzen die Fähigkeit, die
Struktur des Lignins chemisch zu modifizieren
[7]; ein substanzieller Abbau
des Lignins verbunden mit seiner Mineralisierung
ist allerdings auf eine einzige
Gruppe von Mikroorganismen beschränkt
- die Basidiomyceten (Ständerpilze).
Innerhalb dieser artenreichen
Pilzklasse haben sich im Laufe der
Evolution zwei ökophysiologische Lebensweisen
entwickelt (Holzabbau und
Streuzersetzung), die einen effektiven
Angriff auf das Ligninpolymer außerhalb
der Zelle (extrazellulär) gewährleisten
[8]. Holzabbau und Streuzersetzung
können zur sogenannten Weißfäule
von Lignozellulosen führen, d. h.
zu einem selektiven Verlust des Lignins,
unter Zurücklassung weißgefärbter

Zellulosefibrillen. Ander and Eriksson
[9] wiesen nach, dass die Oxidation
phenolischer Verbindungen durch
holzabbauende Weißfäulepilze auf extrazelluläre
Oxidoreduktasen (Laccasen,
Peroxidasen) zurückzuführen ist.
Aus Untersuchungen zur Spaltung von
Modellverbindungen und zur Depolymerisation
von Ligninpräparaten wurde
deutlich, dass diese Enzyme verschiedene
Bindungstypen im Lignin
unspezifisch durch Radikalbildung
(Ein-Elektron-Oxidationen) zu spalten
vermögen; sie wurden deshalb als ligninolytische
(oder Lignin-modifizierende
Enzyme) bezeichnet (beispielhaft
in Abbildung 2 der Reaktionsmechanismus
für Manganperoxidase
MnP).
Enzymproduktion und -
optimierung
Hauptziel des von der JenaBIOS GmbH
durchgeführten Teilvorhabens ist die
Herstellung bislang nicht kommerziell
erhältlicher Oxidoreduktasen aus
speziellen Pilzgruppen. Die Enzyme
werden hinsichtlich wesentlicher Reaktionsparameter
charakterisiert und
auf ihre Einsetzbarkeit bei Prozessen
der Carbonisur von Wolle und Baumwollbleiche
erprobt. Für diese Verfahren
der Textilveredlung werden spezielle
Biokatalysatoren benötigt, die
sich durch hohe Spezifität, katalytische
Aktivität und Stabilität auszeichnen;
letztere bezieht sich vor allem auf den
pH-Bereich, die Behandlungstemperatur
und die Anwesenheit organischer
Hilfsmittel. Bisher war die eingeschränkte
Verfügbarkeit derartiger
Enzyme ein Hinderungsgrund für ihren
breiten Einsatz. Da innovative Enzyme
in der konventionellen Prozessführung
zu einer effizienten Kostenreduktion
durch Ressourcenschonung
sowie entscheidend zur Umweltentlastung
beitragen können, ist die
Erprobung des biotechnologischen
Potenzials ligninolytischer Oxidoreduktasen
von großer Bedeutung.
Im Speziellen wurden neuartige Hybrid-
Peroxidasen (HybridP) und
Mangan-Peroxidasen (MnP) für die
Untersuchungen der Projektpartner
zur technischen Einsetzbarkeit produziert.
Die biotechnologische Herstellung
erfolgt nach Aufnahme der
stammspezifischen Bildungskinetik
und Sekretionsoptimierung vornehmlich
in Flüssigfermentation (bis
100 L). Enzymmuster, einschließlich
ihrer natürlichen Mediatoren und niedermolekularenKatalysekomponenten,
werden im Festbettreaktor produziert.
Abb. 4: Abbau des Modellfarbstoffs Poly R-478 mit Hilfe verschiedener
Peroxidasen.
Die eingesetzten Organismen gehören
zu den ökophysiologischen Gruppen
der Streu und Holz besiedelnden Weißfäulepilze.
Die Enzyme dieser Basidiomyceten
lassen aufgrund der besonderen
Habitate wesentliche katalytische Eigenschaften
in Bezug auf die Entfernung
von Vegetabilien und die Delignifizierung
erwarten. Obwohl ihr biochemisches
Potenzial erst seit wenigen Jahren
Gegenstand des wissenschaftlichen
Interesses ist, konnte bereits gezeigt
werden, dass diese Pilzgruppen über
hochaktive Enzymsysteme zum Abbau
persistenter Verbindungen verfügen. Als
zentrales Enzym des degradativen Systems
fungiert die MnP, die u. a. Lignine
und Huminsäuren sowie PAK, Nitro- und
Chloraromaten anzugreifen vermag.
Um die Oxidoreduktasen in technische
Biokatalyseprozesse integrieren zu
können, erfolgte zunächst die biochemische
Charakterisierung, wie die Erfassung
von Katalyse- und Prozessparametern.
Die Evaluierung des Lignin abbauenden
und spaltenden Potenzials
wurde in Absprache mit den Projektpartnern
durchgeführt.
Im Einzelnen wurden folgende Arbeitsschritte
durchgeführt:
– Analyse des Aktivitätsprofils im Kulturüberstand
und im Kulturextrakt,
– Erstellung von Enzymbildungskinetiken
in Abhängigkeit von Kultivierungsparametern
und Induktionsfaktoren,
– Charakterisierung der Biokatalysatoren,
– Produktion und Isolierung vielversprechender
Enzyme im Labormaßstab
und
– Upscaling des Herstellungsprozesses
unter Einsatz spezieller Fermentationstechniken.
Enzymkatalysierte
Baumwollbleiche
Ziel dieses Teilprojekts ist es, die Möglichkeiten
für den Einsatz von Oxido-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
117
reduktasen für die enzymatische Bleiche
von Baumwolle zu bestimmen.
Dabei sollen sowohl kommerziell erhältliche,
als auch bei JenaBIOS und
an der TU Dresden neu isolierte Enzyme
mit ungewöhnlichen Stabilitäten
zum Einsatz kommen. Durch den Einsatz
von Enzymen sollen die zurzeit industriell
benötigten Bleichchemikalien
Natronlauge und Wasserstoffperoxid
drastisch reduziert und damit
eine erhebliche Reduktion der Salzfracht
im Abwasser sowie eine Wassereinsparung
erreicht werden.
Einsatz hydrolytischer
Enzyme
Enzymreaktionen an Baumwolle können
durch eine Vielzahl von Faktoren
beeinflusst werden, hierzu zählt insbesondere
die Zugänglichkeit des Substrats
für das Enzym. Der enzymatische
Angriff kann negativ beeinflusst werden
durch
– der Baumwolle anhaftende hydrophobe
Wachse und Fette und
– für die raumbeanspruchenden Enzyme
zu kleine interfibrilläre Zwischenräume
der Baumwollfaser.
Die Folge ist, dass die zu oxidierenden
Substanzen vom Enzym gar nicht
erreicht werden. Die Zugänglichkeit
der Baumwolle für Enzyme kann entweder
durch den Einsatz von Netzmitteln
oder durch Entfernung der hydrophoben
Substanzen verbessert werden.
Die Benetzbarkeit wird mit einem standardisierten
Tropfentest überprüft. Die
Einsinkzeit eines Tropfens muss für
technische Zwecke unter 7 s liegen.
Bei der Untersuchung verschiedener
Enzymkombinationen erwies sich der
simultane Einsatz von Pectinase, Hemicellulase
und Xylanase bei pH 4,5 am
effektivsten. Es können Einsinkzeiten
beim Tropfentest von unter einer Sekunde
sogar ohne zusätzliches Netzmittel
erreicht werden (Abb. 3), dabei gilt
es jedoch, Behandlungsdauer und -
temperatur weiter zu optimieren (derzeit
20 h, 40°C). Besonders hervorzuheben
ist, dass diese Enzymkombination
im pH-Wert mit den im Rahmen des
Projekts untersuchten Peroxidasen
kompatibel ist und demnach als ein kostengünstigeres
einstufiges Verfahren in
Betracht gezogen werden kann.
Einsatz oxidativer Enzyme
Versuche zum Einsatz verschiedener
oxidativer Enzyme auf Baumwollmaschenware
und -kardenband haben
gezeigt, dass in diesen Behandlungen
im Vergleich zu den entsprechenden
Blindbehandlungen keine Erhöhung
des Weißgrads erzielt werden kann.
Teilweise wurde sogar eine durch die
Behandlung hervorgerufene Farbvertiefung
des Substrats beobachtet, die im
Falle von Mn-abhängigen Enzymen
möglicherweise auf die Bildung von
Braunstein auf der Ware zurückzuführen
ist. Dieses Ergebnis ist unabhängig
von der eingesetzten Enzymkombination.
Um die Wirkung der zu untersuchenden
Peroxidasen an Lignin an einem
vereinfachten System zu überprüfen,
wurde daher mit löslichen Modellverbindungen
gearbeitet. Zum Einsatz kamen
Poly R-478, ein Polymer-gebundener
Farbstoff, dessen Entfärbung
photometrisch verfolgt werden kann
und der in der Literatur als Lig-nin-Modell
beschrieben wird, und lösliches
Lignin. Die Ergebnisse der Behandlungen
von Poly R-478 sind in Abbildung
4 gezeigt.
Während die Hybrid-Peroxidase aus
B. adusta und Baylase Poly R-478 vollständig
entfärben, wird bei Lignin eine
Farbvertiefung beobachtet. Dies kann
auf eine Reaktion zwischen Enzym und
Lignin zurückgeführt werden, die aber
nicht zu einer Entfärbung führt. Dieser
Effekt kann durch den Abbaumechanismus
phenolischer Strukturen bei
der enzymatischen Delignifizierung erklärt
werden. In einem ersten Oxidationsschritt
werden chinoide Systeme
gebildet, die häufig eine braune Farbe
besitzen. Des Weiteren ist bekannt, dass
die genannten Enzyme auch in der Lage
sind, Ligninbausteine zu polymerisieren
und auf diese Weise zu einer Farbvertiefung
beitragen könnten.
Daraus kann gefolgert werden, dass
eine Reaktion zwischen Enzym und Lignin
auch an der Baumwolle denkbar
ist, was die dabei beobachtete Farbvertiefung
erklärt. Dies legte eine Erweiterung
der Untersuchungen auf den
Einfluss von Cofaktoren mit dem Ziel
des weiteren Ligninabbaus nahe.

118 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Enzymkatalysierter Abbau
von Vegetabilien in Wolle
Ziel dieses Teilbereichs ist es, mit Hilfe
der enzymkatalysierten Oxidation von
Vegetabilien in Wolle, die bei der klassischen
Carbonisur eingesetzten Chemikalienmengen
zu reduzieren bzw.
vollständig zu ersetzen.
Durch die Anwendung von Oxidoreduktasen
(vorwiegend MnP und Laccasen)
wird ein bereits in der Papierherstellung
erprobtes Verfahren für die
Wollindustrie nutzbar gemacht. Unterschiedliche,
aus belasteten Wollen und
von einer Wollkämmstrecke stammende
Vegetabilienarten (Grassamen und
Ringelkletten, Abb. 1) wurden isoliert
und mit definierten Enzymen bzw. Enzymcocktails
isoliert behandelt, um den
Abbaugrad der einzelnen Vegetabilien
unter festgelegten Reaktionsbedingungen
genau zu bestimmen. Sowohl die
anteilmäßig am stärksten auftretenden
Grassamen als auch die Ringelkletten
wurden als homogenes Ausgangssubstrat
eingesetzt.
Die Zellwände höherer Pflanzen sind
aus Cellulose, Lignin und Polyosen auf-
ÖKOEFFIZIENZ
gebaut. Um einen Abbau der Vegetabilien
erzielen zu können, muss einerseits
ein Angriff der Polysaccharide über hydrolytische
Prozesse und andererseits an
dem für die Verholzung des pflanzlichen
Materials verantwortlichen Lignin auf
oxidativem Wege erzielt werden. Letztere
Komponente der Vegetabilien, die insbesondere
für die Festigkeit und Widerstandsfähigkeit
von Ringelkletten verantwortlich
ist, liegt in vielen Pflanzenteilen
eng vergesellschaftet mit Xylan vor. Um
die Zugänglichkeit des Lignins für die
oxidativen Enzyme zu verbessern, wurde
daher ergänzend der Einsatz von Xylanasen
in den Behandlungen untersucht.
Zum Abbau der Vegetabilien kamen sowohl
oxidative Enzyme der Projektpartner
JenaBIOS GmbH und TU Dresden
als auch kommerziell erhältliche hydrolytische
Enzyme (vorwiegend Xylanasen)
zum Einsatz. Die unterschiedlichen Enzyme
wurden sowohl separat als auch
in Kombination eingesetzt.
Zur Beurteilung des enzymkatalytisch
bewirkten Modifizierungsgrads
der Vegetabilien wurden verschiedene
analytische Methoden angewandt.
Nach Inkubation der Vegetabilien mit
hydrolytischen Enzymen wurde die
Menge der in die Flotte freigesetzten
reduzierenden Zucker [10] sowie der
Gewichtsverlust der Vegetabilien und
somit deren Abbaugrad bestimmt.
Durch die im Rahmen des Projekts erprobten
Enzymbehandlungen erfolgt
überwiegend ein Angriff auf die Polysaccharid-Komponente
der pflanzlichen
Substrate, wohingegen die verholzten
Bestandteile nahezu unverändert
bleiben. Dies spiegelt sich in den
unterschiedlichen Behandlungserfolgen
an Polysaccharid-reichen Grassamen
im Vergleich zu denen an Ringelkletten
wider.
Literatur
[1] Milnthorpe, E.J., Aust. Cent. Wool
Committee Testing Ho. (1943).
[2] Nitschke, G., Textilpraxis 32 (1977),
24-28.
[3] Schiecke, H.E., Wolle als textiler Rohstoff,
Schiele & Schön GMBH, Berlin
(1979).
[4] Stöckigt, U., Döcke, W., Glass, H.,
Heinze, W., Köhler, E., Kuhrt, M.,
Schmerler, C.-J., Appretur (1989).
Ökoeffizienz-Bewertung
in der Prozessentwicklung
[5] Stöhr, R., Melliand Textilberichte 11
(1995)1010.
[6] Ebner, G, Schelz, D., Textilfärberei und
Farbstoff. Springer Verlag, Berlin
(1989).
[7] Eriksson, K.-E. L., Enzyme application
in fiber processing, ACS symposium
series, ISSN 0097-6156; 687, San
Francisco (1997), 2–14.
[8] Tanesaka, E., Masuda, H., Kinugawa,
K., Mycologia 85 (1993), 347-354.
[9] Ander, P., Eriksson K.-E., Arch. Microbiol.
109 (1976), 1-8.
[10] Analytische Bestimmungsmethode:
Betriebsinterner Nachweis reduzierender
Zucker der Firma Extrakt Chemie
GmbH & Co, Stadthagen.
Korrespondenzadresse
Dr. Elisabeth Heine
Deutsches Wollforschungsinstitut an
der RWTH Aachen e.V.
Veltmanplatz 8
D-52062 Aachen
Tel.: 0241-4469 129
Fax: 0241-4469 100
eMail: heine@dwi.rwth-aachen.de
Web: www.dwi.rwth-aachen.de
� Arno Biwer1 , Pascal Zuber2 , Prof. Dr. Klaus Bellmann2 , Dr. Dieter Sell3 , Peter Gebhart3 , Prof. Dr. Elmar Heinzle1 1 2 3 Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, Lehrstuhl für ABWL und Produktionswirtschaft, Universität Mainz, AG Bioverfahrenstechnik,
Dechema e.V., Frankfurt
Frühe Entwicklungsphasen neuer Verfahren sind entscheidend für die späteren Produktionskosten und die entstehenden Umweltbelastungen. Durch die
Berücksichtigung von Ökoeffizienz-Aspekten in der Prozessentwicklung können ökologisch und ökonomisch optimierte Verfahren erreicht werden, die
sich durch gute Marktchancen und geringe Umweltbelastungen auszeichnen.
Keywords: Ökoeffizienz, Ökologische Bewertung, Ökonomische Bewertung, Nachhaltigkeit, Prozessentwicklung, Cyclodextrin, Oxidative Enzyme.
Einleitung
Vom Einsatz biotechnologischer Verfahren
wird oft eine Verbesserung industrieller
Prozesse hin zu einer nachhaltigeren
Entwicklung, d. h. zu kostengünstigeren,
ökologisch optimierten
und sozialverträglichen Prozessen,
erwartet. In frühen Phasen der Prozessentwicklung
wird bereits ein großer
Teil der später bei der Produktion
entstehenden Kosten und der später
entstehenden Umweltbelastungen fest-
gelegt [1]. Es ist deshalb wichtig, die
Prozesse bereits in diesen Phasen ökologisch
und ökonomisch, also hinsichtlich
ihrer Ökoeffizienz, zu evaluieren.
Im Gegensatz zu den oft vorgenommenen
retrospektiven Bewertungen
steht man bei der integrierten Prozessentwicklung
vor zwei Problemen:
Zum einen sind meist erst wenige der
relevanten Daten vorhanden, die oft
noch mit einer hohen Unsicherheit
behaftet sind. Zum anderen müssen die
Ergebnisse in relativ kurzer Zeit gelie-
fert werden, um als Entscheidungshilfe
in der Prozessentwicklung dienen
zu können. Die hier vorgestellte Methode
erlaubt es, aufbauend auf den
in frühen Entwicklungsphasen vorhandenen
Prozessdaten, eine schnelle und
umfassende ökologische und ökonomische
Bewertung vorzunehmen.
Methodik
Die Bewertung erfolgt in zwei
Schritten. Im ersten Schritt werden
die bereits vorhandenen Daten im
Entwicklungsprojekt erfasst und
fehlende Daten durch Modellbildung
und Simulation ergänzt. Im
zweiten Schritt werden die so ermittelten
Sachbilanzen nach ökologischen
und ökonomischen Kriterien
bewertet. Die Ergebnisse dienen
dann als Entscheidungshilfe im Entwicklungsprozess
(siehe Abb. 1).
Dieses Vorgehen wird im Verlauf der
Prozessentwicklung iterativ wiederholt.

Datenbeschaffung und
-generierung
Je besser die Datengrundlage, umso
umfassender und präziser werden die
Ergebnisse der Bewertung sein. Daher
ist es wichtig, eine breite Datengrundlage
zu schaffen. Hierzu werden zunächst
alle im Entwicklungsprojekt vorhandenen
relevanten Daten erfasst.
Dies kann durch die Verwendung eines
Fragebogens unterstützt werden.
Parallel erfolgt eine umfangreiche Literatur-
und Patentrecherche.
Die so ermittelten Prozessdaten sind
jedoch meist für eine Bewertung nicht
ausreichend, da in frühen Entwicklungsphasen,
insbesondere für nachgeordnete
Schritte wie die Produktaufreinigung,
nur lückenhafte Informationen
vorliegen. Durch die Modellierung
und Simulation des Verfahrens können
fehlende Daten abgeschätzt und die
Datengrundlage entscheidend verbessert
werden (siehe Abb. 2). Auf den vorhandenen
Prozessdaten aufbauend
wird dabei ein Modell des erwarteten
Produktionsverfahrens erstellt. Dabei
wird zunächst das Verfahrensschema
des erwarteten Produktionsprozesses
ermittelt. Dieses Verfahrenschema wird
im nächsten Schritt in einer Simulationssoftware
abgebildet. Dort werden
für jeden Prozessschritt die notwendigen
Parameter definiert und Simulationen
des Modells durchgeführt. Aufgrund
der beschränkten Datengrundlage
ist man bei der Definition der Prozessparameter
teilweise auf Abschätzungen
angewiesen.
Aus den Simulationen erhält man die
Quantifizierung der wichtigsten Stoffströme
und eine Sachbilanz, die sowohl
die Input- und Outputstoffe als auch
den Energiebedarf des Prozesses beschreibt.
Diese Sachbilanz bildet die
Grundlage für die ökologische und
ökonomische Bewertung.
Ökologische Bewertung
Die in der Sachbilanz ermittelten Mengen
der Input- und Outputstoffe werden
zunächst auf die funktionale Einheit des
Verfahrens bezogen. Der so erhaltene
„Mass Index“ sagt aus, wie viel eines
Inputstoffs pro funktioneller Einheit, z.
B. 1 kg Endprodukt, verbraucht wird
bzw. wie viel eines Outputstoffs pro
funktioneller Einheit gebildet wird.
Für eine detaillierte ökologische Bewertung
müssen jedoch die Mengen
der einzelnen Stoffe und ihre Umweltrelevanz
zusammengeführt werden.
Basierend auf den Stoffeigenschaften
wird hierzu ein „Environmental Factor“
definiert, der als Wichtungsfaktor dient.
Er ist ein Maß für die potenzielle Umweltgefährdung,
die von dem betrachteten
Stoff ausgeht. Der Environmental
Factor wird für Input- und Outputstoffe
getrennt bestimmt (siehe Abb. 3).
Jeder Inputstoff wird nach vier
Schwerpunkten bewertet: Die Ressourcenverfügbarkeit,
die mit seiner Bereitstellung
verbundenen Umweltbelastungen
(Grey Inputs), die negative Wirkung
auf Organismen und das Stoffrisiko.
Die negative Wirkung auf Organismen
und das Stoffrisiko werden
auch zur Bewertung der Outputstoffe
verwendet. Das Stoffrisiko berücksichtigt
das Potenzial des Stoffs im Prozess
Störungen zu verursachen, z. B. durch
die Bildung zündfähiger Gemische oder
einen niedrigen Flammpunkt. Die Wirkung
auf Organismen betrachtet vor allem
die akute und chronische Toxizität
des Stoffs. Die Outputstoffe werden darüber
hinaus auch nach ihrer Wirkung
auf die Umweltkompartimente Luft und
Wasser/Boden untersucht. Hier spielen
Aspekte wie Ozonabbau und Treibhauseffekt
(Luft) oder Eutrophierung (Wasser/Boden)
eine Rolle.
In jeder betrachteten Kategorie wird
mit einer einfachen dreistufigen ABC-
Klassifizierung festgelegt, ob der Stoff
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
119
Abb. 1: Regelkreis
der ökologischökonomischen
Bewertung in der
Prozessentwicklung.
ein geringes, mittleres oder hohes Belastungspotenzial
besitzt. Im nächsten
Schritt werden den drei Klassen A, B
und C Zahlenwerte zugeordnet und die
Zahlenwerte aller relevanten Kategorien
zum Environmental Factor des Stoffs
aggregiert.
Die Massenanteile der Input- und
Outputstoffe in der Sachbilanz (Mass
Index) werden mit den ermittelten
Wichtungsfaktoren (Environmental
Factor) multipliziert. Dadurch erhält
man den so genannten „Environmental
Index“. Durch den Vergleich der Environmental
Indices eines Verfahren
können die Stoffe identifiziert werden,
die aus Umweltsicht die größte Bedeutung
haben. Folglich liegt in einer Reduzierung
dieser Stoffe auch das größte
Potenzial für Prozessverbesserungen.
Addiert man die Environmental Indices
aller Input- oder Outputstoffe eines
Verfahrens, erhält man den Environmental
Index des Prozesses. Er
kann dazu verwendet werden, alternative
Prozesse oder Prozessschritte zu
vergleichen. Parallel zur Stoffbewertung
erfolgt auch die Abschätzung des Energieverbrauchs
des Verfahrens. Er wird
ebenfalls in die Bewertung des Prozesses
einbezogen.
Abb. 2: Verbesserung der Datengrundlage durch Modellbildung und Simulation
in der Prozessentwicklung.
Ökonomische Bewertung
Ausgangspunkt der ökonomischen
Bewertung ist ein Prozessmodell, in
dem Rohstoffe in einem oder mehreren
Transformations- und Aufreinigungsschritten
(in Sinne einer Black
box) in die gewünschten Endprodukte
umgewandelt werden. Insofern basiert
die ökonomische Bewertung auf
der qualitativen und quantitativen
Sachbilanz der beteiligten Stoffströme.
Da zu Beginn einer Entwicklung in
der Regel nur wenige Informationen
über die konkrete Produktionsanlage
vorliegen, ist es nicht möglich, die
dazugehörigen Apparaturen und baulichen
Elemente sowie die Kosten hierfür
in der Frühphase der Entwicklung
hinreichend genau abzuschätzen. Aus
diesem Grund stützt sich die Bewertung
in dieser Situation zunächst auf
leicht ermittelbare ökonomische
Kennzahlen, wie z. B. verschiedene variable
Kostenbestandteile.
Die Bewertungselemente lassen
sich zwei logischen Ebenen zuordnen.
Zum einen kann eine quantitative
Wirtschaftlichkeitsebene identifiziert
werden, zu der die monetär messbaren
Bereiche zählen. Zum anderen
darf auch die qualitative Risikoebene,
zu der verschiedene ökonomisch
relevante Risikoaspekte gerechnet
werden, nicht vernachlässigt werden.
Die für die ökologische Bewertung
gebildeten Massenindizes auf der Inputseite
der Sachbilanz werden mit jeweiligen
Marktpreisen bewertet. Die
Summe dieser Werte stellt als Bestandteil
der variablen Stückkosten
einen ersten Anhaltspunkt für die
Wirtschaftlichkeitsbewertung dar. Die
Stoffe auf der Outputseite (bis auf das
Endprodukt selbst) stellen zu entsorgende
Abfallstoffe dar, sofern sie nicht
recycelt und in diesem oder anderen
Herstellungsprozessen verwendet
werden können. Die dazugehörigen
Massenindizes müssen mit entsprechenden
Abfallkosten, je nach Art der
Entsorgung (Abwasser über Kläranlage,
Sonderdeponie etc.), bewertet
werden. Weiter sind die für die entsprechenden
Verfahrensschritte notwendigen
Energiebedarfe festzustellen
und ihrer Art nach (Strom,
Dampf, etc.) mit Marktpreisen zu bewerten.
Diesen Kostenblöcken muss das Erlöspotenzial
des Endprodukts gegenübergestellt
werden. Bei neuartigen
Produkten stellt die Summe dieser
Kosten eine Untergrenze für mögliche
Verkaufspreise dar. Sofern Marktinformationen,
insbesondere Preisinformationen,
vorliegen, kann der

120 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
Stückdeckungsbeitrag für dieses Verfahren
ermittelt werden.
Auf der Risikoseite werden Beschaffungs-,
Absatz- und Umfeldrisiko unterschieden,
die jeweils die Ausprägungen
gering, mittel, hoch und sehr hoch
aufweisen können. Das Beschaffungsrisiko
wirkt sich auf die Herstellkosten
aus. Aus diesem Grund werden die variablen
Stückkosten je nach Risikoausprägung
mit unterschiedlichen Faktoren
multipliziert, um die mögliche
Bandbreite dieser Kosten zu ermitteln.
Das Absatzrisiko wiederum wirkt sich
über Schwankungsbreiten des Endproduktpreises
auf die ökonomische Bewertung
aus. Das Umfeldrisiko spielt
bei biotechnologischen Verfahren eine
große Rolle und kann Wirkungen sowohl
auf der Kosten- als auch auf der
Erlösseite entfalten. Ergebnis des ökonomischen
Bewertungsprozesses ist ein
Wirtschaftlichkeits- und Risikoprofil
des betrachteten Verfahrens, in dem
beide Bewertungsebenen zusammengefasst
sind.
Fallbeispiele
Die Anwendung der Methode wird anhand
zweier Fallbeispiele aus dem
DBU-Verbund „Biokatalyse“ gezeigt,
die in dieser Ausgabe in eigenen Artikeln
näher beschrieben sind.
α-Cyclodextrin
Cyclodextrine (CD) sind zyklische Oligosaccharide
bestehend aus Glucoseresten,
die über α-1,4-glykosidische
Bindungen verbunden sind. Nach der
Anzahl von Glucoseresten pro Molekül
unterscheidet man α-, β- und γ-CD mit
6, 7 bzw. 8 Glucoseresten pro Molekül.
Alle drei Typen werden heute industriell
hergestellt und in der Lebensmittel-,
Chemie-, Pharma- und Textilindustrie
eingesetzt. Cyclodextrine haben
einen zylinderförmigen Aufbau mit
einer hydrophoben Innen- und einer
hydrophilen Außenseite. Dadurch können
sie Einschlusskörper mit vielen hydrophoben
Verbindungen bilden und
so deren physikalische und chemische
Eigenschaften verändern [2].
Zur Herstellung von α-Cyclodextrin
wird Stärke als Rohstoff verwendet.
Zunächst wird die Stärke mit Hilfe von
α-Amylase zu Dextrin abgebaut. Nach
der Stärkehydrolyse erfolgt die eigentliche
Cyclodextrinbildung, die durch
die Cyclodextringlycosyl-Transferase
(CGTase) katalysiert wird. Innerhalb
des DBU-Verbunds „Biokatalyse“ werden
im Projekt „Hochwertige Kohlenhydrate“
neue Enzyme mit veränderten
Eigenschaften zur α-Cyclodextrinher-
Abb. 3: Wirkungsklassen bei der Bestimmung des Environmental Factors
von Input- und Outputstoffen.
stellung entwickelt. Um die Auswirkungen
dieser neuen Enzyme auf den Produktionsprozess
abschätzen zu können,
wurde das Verfahren modelliert,
simuliert und bewertet. In der industriellen
Produktion wird überwiegend das
so genannte Solventverfahren verwendet.
Hierbei lenkt ein organischer Komplexbildner
die Enzymreaktion. Der
Komplexbildner und das α-CD bilden
einen Komplex und fallen aus. Dadurch
wird in der Gleichgewichtsreaktion
kontinuierlich α-CD abgezogen. Eine
typische Prozessabfolge ist in Abbildung
4 gezeigt.
Das erstellte Modell geht von einem
Reaktorvolumen von 10 m 3 und der
Produktion von 1,5 t α-Cyclodextrin
aus. Das Verfahren erreicht eine Ausbeute
von 47%. Dabei werden etwa 2
kg Rohstoffe/kg Produkt und 13 kg
Wasser/kg Produkt benötigt (Mass Index).
Der allergrößte Teil der Abfälle
liegt als Abwasser vor, das mit leicht
abbaubaren organischen Verbindungen
belastet ist. Der Energiebedarf beträgt
im Modell etwa 18 MJ/kg Produkt.
Die Wasserdampfdestillation zur Abtrennung
des Decanols und die Kristallisation
sind dabei die energieintensivsten
Schritte.
Die Environmental Indices bewerten
die Umweltrelevanz der Input- und Outputstoffe.
Auf der Inputseite dominiert
die Stärke aufgrund ihrer großen Masse
und daneben das Decanol (Komplexbildner).
Auf der Outputseite haben die
leicht abbaubaren organischen Verbindungen
(Glucose, Maltose, Dextrin,
Produktverlust etc.) eine größere Bedeutung,
aber auch das Decanol spielt
eine Rolle. Die Bedeutung des Decanols
kann durch ein weitgehendes Recycling
deutlich verringert werden. Eine Reduzierung
der organischen Abfallstoffe ist
letztlich nur durch eine höhere Ausbeute
möglich. Grundsätzlich zeigt die ökologische
Bewertung eine relativ geringe
Umweltbelastung durch das Verfahren.
Dabei wirkt sich das Verfahren vor
allem auf die Umweltkompartimente
Wasser und Boden aus, während die
Wirkung auf das Umweltkompartiment
Luft, die direkte Beeinträchtigung von
Organismen und Sicherheitsaspekte
kaum eine Rolle spielen.
Mit Hilfe von Sensitivitätsanalysen
wurde die möglichen Auswirkungen
neuer Enzyme untersucht. Die durchgeführten
Analysen zeigen, dass der
Einfluss der Reaktionsdauer gering ist
und die Startkonzentration der Stärke
über 20% liegen muss. Die Verwendung
von thermostabilen CGTasen und
die damit verbundenen Prozessmodifikationen
bringen einige Vorteile für
die Verfahren, vor allem wird der Energie-
und Kühlbedarf des Reaktors
deutlich reduziert. Das größte Potenzial
zur Prozessverbesserung liegt zum
einen in einer Erhöhung der Ausbeute
und der damit verbundenen Reduzierung
des Rohstoffbedarfs und des Anfalls
organisch belasteter Abwässer und
Abb. 4: Verfahrensschema eines
Solventverfahrens zur Herstellung
von a-Cyclodextrin.
zum anderen in einer Energieeinsparung
durch die Erhöhung der Produktkonzentration
oder durch eine weniger
energieintensive Abtrennung des
Wassers in der Aufreinigung.
Bei der ökonomischen Bewertung
werden sämtliche Inputstoffe mit
Marktpreisen bewertet. Der Preis für
die CGTase wird mit Hilfe eines Prozessmodells,
in dem die Herstellung
simuliert wird, abgeschätzt. Die mit
weniger als 10% an der Massenbilanz
(inkl. Wasser) beteiligte Stärke macht
mit weitem Abstand den größten Kostenfaktor
auf der Rohstoffseite aus. Ein
deutlich geringerer Anteil der gesamten
Rohstoffkosten fällt auf die α-
Amylase. Die Kosten für Decanol, CG-
Tase und Wasser sind nahezu unerheblich.
Die hauptsächlich flüssigen Abfallstoffe
können direkt über das Abwasser
entsorgt werden, sodass deren Kostenanteil
vernachlässigbar gering ist.
Zwar werden signifikante Kosten für
Strom, Dampf und Kühlwasser ermittelt,
die jedoch im Vergleich zu den
Rohstoffkosten nicht ins Gewicht fallen.
So betragen die Kosten für elektrische
Energie lediglich ca. 0,03 C/kg. Insgesamt
dominieren die Rohstoffkosten
mit ca. 86% die variablen Kosten.
Der Cost Mass Index [3] gibt das
Verhältnis von Rohstoffkosten und
(möglichem) Umsatz an und beträgt
bei diesem Verfahren ca. 0,1. Um also
α-CD im Wert von 100 C herzustellen
ist ein Rohstoffeinsatz im Wert von 10
C notwendig.
Um eine vollständige Bewertung vor
dem Hintergrund der Nachhaltigkeit
vorzunehmen, sind auch investitionsabhängige
Kosten zu berücksichtigen.
Abbildung 5 zeigt bei entsprechenden
Annahmen bzgl. Anlagenspezifikation,
Abschreibungen, Zinsen etc. den Verlauf
der Umsatzrendite (Gewinn/Umsatz)
in Abhängigkeit des Marktpreises
für α-CD.
Oxidative Enzyme in der
Textilindustrie
Das Forschungsprojekt „Oxidative Enzyme
in der Textilindustrie“ im Verbund
„Biokatalyse“ beschäftigt sich mit dem
Einsatz oxidativer Enzyme in zwei Verfahrensschritten
der Textilherstellung
bzw. -veredlung, der Bleiche von Baumwolle
und der Carbonisur von Wolle.
Diese zwei Verfahren werden in unterschiedlichen
Bereichen der textilen
Wertschöpfungskette genutzt. Sie sind
jedoch beide sehr chemikalien- und
energieintensiv. Im Projekt sollen alternative
Verfahren für beide Prozesse
entwickelt werden, die jeweils auf dem
Einsatz von oxidativen Enzymen anstatt

der bisher eingesetzten verschiedenen
Chemikalien basieren [4].
Bleiche von Baumwolle
Insbesondere der Prozess der Bleiche
von Baumwolle wurde schon früh als
ein potenzielles Einsatzgebiet biotechnologischer
Erkenntnisse in der Textilindustrie
erkannt. Für Textilunternehmen
können biotechnische Anwendungen
bei erfolgreicher Verfahrenssubstitution
Minderungen des Ressourceneinsatzes,
Verringerung/Vermeidung
von Emissionen und somit Kostensenkungen
bedeuten [5].
Baumwolle besteht zu 90-95 % aus
Cellulose sowie aus Baumwollfetten
und -wachsen, Ligninresten, Proteinen,
Pektinen und Mineralstoffen. Je nach
regionaler Herkunft kann Baumwolle
weiß, gelb oder braun gefärbt sein. Insbesondere
gelb- und braungefärbte
Baumwolle machte in der Vergangenheit
den Einsatz von Hypochlorit in der
textilen Vorbehandlung notwendig, um
bei nachfolgenden Färbevorgängen
eine einheitliche Färbung von Garn
oder Flächentextil zu erreichen. Heute
wird Wasserstoffperoxid eingesetzt, um
die textilen Eigenschaften Weißgrad,
Saugfähigkeit, Netzbarkeit und geringe
Faserschädigung in ausreichendem
Maße zu gewährleisten.
Ein alternativer enzymatischer Prozess,
der durch reduzierten Energieund
Chemikalieneinsatz charakterisiert
sein sollte, muss sich an dem etablierten
Prozess der Bleiche mittels Wasserstoffperoxid
messen lassen. Daher wurde
der etablierte Prozess der Peroxidbleiche
analysiert um eine Benchmark
für den zu entwickelnden Alternativprozess
zu setzen. In einen typischen
Bleichprozess gehen neben Energie
und Wasser verschiedene Chemikalien
ein, die sich mit dem Wasser zu einer
Flotte im Flotten-Verhältnis von ca. 1:20
(Ware:Flotte) verbinden. Für diese Ressourcen
wurden die Kostensätze für
Energie und Wasser ermittelt, da diese
unmittelbar über die betriebliche Kostenrechnung
in die Plankosten und
mögliche Rechnungen der Kosten je
Stunde Bleichprozess einfließen.
Die aggregierten Plan-Kosten der
Kostenstelle, in der dieser Prozess
durchgeführt wird, betragen 970.000
C p.a. Bei einer Plan-Leistung von
31.200 h ergeben sich Plankosten von
31 C/h. Bezogen auf die reale Dauer
eines Bleichprozesses ergeben sich
folglich Prozesskosten in Höhe von 375
C. In einem Bleichprozess werden im
Schnitt 300 kg Textil mittels Peroxid
gebleicht. Die Kosten pro kg Ware betragen
somit ca. 1,25 C. Werden aus-
Abb. 5: Abhängigkeit der erwarteten Umsatzrendite vom Marktpreis für α-
Cyclodextrin.
schließlich die Energie- und Stoffkosten
für den charakterisierten Bleichprozess
angesetzt, so ergeben sich Prozesskosten
von 350 C bzw. 1,17 C/kg
gebleichte Ware.
Dies sind die Richtgrößen, an denen
sich ein enzymatisches Bleichverfahren
auszurichten hat, wenn es gelingt
Enzyme zu identifizieren und zu
produzieren, die alle qualitativen Anforderungen
an eine Bleiche erfüllen.
Es ist anzumerken, dass für eine solche
Substitution keine Investitionen in
Anlagen notwendig sind. Eine enzymatische
Bleiche wäre nach derzeitigen
Überlegungen in vorhandenen modernen
Anlagen durchführbar.
Carbonisur von Wolle
Bei der Carbonisur werden pflanzliche
Reste (Vegetabilien) aus der Wolle entfernt,
da diese ansonsten bei der Weiterverarbeitung
der Wolle zu mechanischen
Problemen bei der Bearbeitung
sowie zu qualitätsbeinflussenden Veränderungen
im Griff und in der Optik
entstehender Tuche führen würden.
Insofern ist die Carbonisur von Wolle
ein notwendiger Verfahrensschritt der
textilen Wertschöpfungskette, der derzeit
als chemisches Verfahren durch
den Einsatz von Schwefelsäure ausgeführt
wird. In diesem Verfahren wird
die Säure durch das Erhitzen der Wolle
auf über 100 °C aufkonzentriert, was
eine Dehydratisierung (Verkohlung)
der Cellulose bewirkt. Allerdings ist dieses
Verfahren sehr kritisch zu betrachten,
da die Wolle durch den Säureeinsatz
signifikant geschädigt wird. Wollverluste
durch Säure und durch Vegatabilien
belaufen sich gemeinsam auf
bis zu 23 % oder 0,50 C/kg Wolle.
Um die Potenziale einer „enzymatischen
Carbonisur“, zu denen auch die
Vermeidung des genannten Wollver-
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
121
lusts zählt, zu ermitteln, wurde der konventionelle
Carbonisurprozess analysiert.
Bei Wollpreisen von im Mittel 2,70
C/laufender Meter ergibt sich für ein
repräsentatives carbonisierendes Textilunternehmen
bei einem bearbeiteten
Warenwert von 1.490.000 C/p.a. ein
Warenverlust durch die Carbonisur von
185.000 C /p.a. Davon entfallen
124.000 C/p.a. auf den reinen Faserverlust,
der durch ein enzymatisches
Verfahren vermieden werden kann, für
das außerdem gilt, dass es wenig kapitalintensiv
ist, da es in der Regel auf in
wollverarbeitenden Textilunternehmen
vorhandenen Anlagen ausgeführt werden
könnte. Falls es gelingt, ein Enzym
(oder einen Enzymcocktail) zu identifizieren,
das den qualitativen Ansprüchen
an die Entfernung von Vegetabilien
aus der Wolle genügt, so kann ein
enzymatisches Verfahren dann effizient
sein, wenn ein Preis für dieses Enzym
(Enzymcocktail) unter 25 C/kg realisiert
wird (angenommene Enzymmenge
für das repräsentative Textilunternehmen:
5.000 kg).
Dass die Substitution der chemischen
Carbonisur wünschenswert ist,
unterstreichen auch Überlegungen zu
anderen substituierenden Technologien:
„Die in Schafwolle auftretenden
pflanzlichen Verunreinigungen bereiten
im konventionellen Wollreinigungsprozess
Schwierigkeiten, da sie nur durch
mechanische oder chemische Verfahren
entfernt werden können. Durch
beide Methoden kann jedoch die Faser
geschädigt werden. Hinzu kommt,
dass bei der mechanischen Reinigung
nicht alle Vegetabilien entfernt werden
können und ein unerwünschter Restgehalt
im Wollvlies verbleibt. Das chemische
Verfahren ist sowohl umweltschädigend
wie auch unwirtschaftlich.
Daher soll nun mittels Laserstrahlung
eine selektive Zerstörung der Vegetabilien
ohne Schädigung der Wolle ermöglicht
werden. ...“ [6].
Perspektiven
Die Fallbeispiele verdeutlichen, dass
bereits in frühen Phasen der biotechnologischen
Prozessentwicklung ökologische
und ökonomische Charakteristiken
abgeschätzt werden können.
Für eine weitergehende Implementierung
in die industriellen Entwicklungsprozesse
müssen die erarbeiteten Methoden
weiter verbessert und ihre Anwendung
vereinfacht werden. Mit diesen
Methoden wird die Entwicklung
ökoeffizienter Prozesse unterstützt.
Ökoeffizienz verbindet dabei wirtschaftlichen
Nutzen mit einer Reduzierung
der Umweltbelastung. Eine Verbesserung
der Ökoeffizienz bedeutet also
auch immer eine Steigerung der Nachhaltigkeit
und zwar letztlich aller drei
Säulen. Denn die Entwicklung wettbewerbsfähiger
Produkte ermöglicht eine
wirtschaftliche Nachhaltigkeit, die Reduzierung
der Umweltbelastung und
des Rohstoffverbrauchs verbessert die
ökologische Nachhaltigkeit und die Befriedigung
menschlicher Bedürfnisse in
Einklang mit der Umwelt stärkt die soziale
Nachhaltigkeit.
Literatur
[1] Biwer, A. und Heinzle, E. In: Heiden, S.,
Burschel, C., Erb, R. (Hrsg.) Biotechnologie
als interdisziplinäre Herausforderung.
Spektrum Verlag: Heidelberg
(2001), 191-208.
[2] Biwer, A., Antranikian, G. und Heinzle,
E., Appl. Microbiol. Biotechnol. 59
(2002), 609-617.
[3] Heinzle, E. et al., Ind. Eng. Chem. Res.
37 (1998), 3395-3407.
[4] Heine, E. et al., In: Heiden, S., Erb, R.
(Hrsg.) Biokatalyse - Verbundvorhaben
der Deutschen Bundesstiftung Umwelt.
Sonderausgabe der DBU in Kooperation
mit BIOspektrum, Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg (2001), 49-
53.
[5] Gebhart, P., Ingenieur forum WESTFA-
LEN-RUHR 2/99, 13.
[6] o.V., Selektive Lasereinigung von Wolle,
INFO-Börse Laser, 34/1999.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Elmar Heinzle
Technische Biochemie Universität
des Saarlandes
PF 15 11 450
D-66041 Saarbrücken
Tel./Fax: 0681-302 2905/ 302 4572
eMail: e.heinzle@mx.uni-saarland.de

122 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
WIRTSCHAFTLICHKEITSANALYSE
Praxisnahe Implementierung
biotechnologischer Verfahren in
mittelständischen Textilbetrieben
� Peter Gebhart, Dr. Dieter Sell
DECHEMA e.V., Karl-Winnacker-Institut, AG Bioverfahrenstechnik
Biotechnologisch hergestellten Produkten und biotechnologischen Verfahren kann im Sektor der Textilindustrie, insbesondere im Bereich der Textilveredlung,
große Bedeutung für Prozessoptimierungen zukommen.
Für die überwiegend klein- und mittelständisch geprägte Branche, für die weiterhin ein hoher Wettbewerbsdruck kennzeichnend ist, gilt, dass die Substitution
oder Optimierung von einzelnen Prozessschritten und damit verbundene Kostensenkungen erkennbar zur Steigerung der Effizienz ganzer Produktionsabläufe
beiträgt. Anders als in anderen Branchen ist es in der Textilveredlungsindustrie kaum möglich, konkurrenzlose Produkte und neue oder
deutlich erhöhte Produktqualitäten anzubieten. Somit kann eine Verfahrenssubstitution, die einen Kostenvorteil nach sich zieht, erheblich dazu beitragen,
die Position eines Unternehmens im Wettbewerb zu sichern oder zu verbessern.
Im Projekt sollte zum einen dieser Zusammenhang an einem konkreten Prozessschritt, der Zerstörung von Restperoxid im Anschluss an die oxidative
Bleiche baumwollhaltiger Textilien, nachgewiesen werden. Zum anderen sollten weitere Prozesse innerhalb der Wertschöpfungskette der Textilveredlung
identifiziert werden, die sich für Substitutionen oder Optimierungen durch die Anwendung biotechnologischer Erkenntnisse eignen.
Keywords: Textilveredlung, Bleiche, Biotechnologie, Enzyme, Wissenstransfer, Prozessoptimierung, Kostensenkung.
Projektziele
Durch zunehmende Verknappung von
Rohstoffen, steigende Umweltbelastungen
durch Unternehmen, öffentliche
und private Haushalte, steigende Kosten
für die Beseitigung von Abfallprodukten
industrieller Prozesse sowie sich
verschärfender Umweltgesetzgebung
kommt Prozessoptimierungen eine
wachsende Bedeutung zu. Innovative
biotechnologische Verfahren können
maßgebliche Beiträge zu derartigen
Prozessoptimierungen liefern. Die Textilindustrie
galt und gilt als ein Kernbereich
möglichen Wandels von End-ofpipe-Technologien
zu produktionsintegriertem
Umweltschutz durch die Anwendung
der Biotechnologie.
Um Interessenvertretern der Textilindustrie
den Gedanken des produktionsintegrierten
Umweltschutzes durch
Biotechnologie nahe zu bringen, wurde
durch die Deutsche Bundesstiftung
Umweltschutz, Osnabrück, das Projekt
„Praxisnahe Implementierung biotechnologischer
Verfahren in mittelständischen
Textilbetrieben“ gefördert. Zur
inhaltlichen und organisatorischen
Bearbeitung arbeitete die antragstellende
Arbeitsgruppe Bioverfahrenstechnik
des Karl-Winnacker-Instituts der DE-
CHEMA e.V. mit den Kooperationspartnern
Windel Textil GmbH & Co. (neue
Firmenbezeichnung: TVW - Textilveredlungs-
und Handelsgesellschaft Windel
mbH), Bielefeld, und Gesamtverband
der deutschen Textilveredlungsindustrie
e.V., Eschborn, sowie der auftragnehmenden
Firma TVU-Beratungen,
Schloß Holte-Stukenbrock, zusammen.
Ziele des Projekts waren, den Informationsfluss
und Wissenstransfer bezüglich
des tatsächlichen bzw. des potentiellen
Einsatzes biotechnologischer
Verfahren und Produkte im Bereich der
Textilveredlung zu verbessern. Weiterhin
sollten Ressentiments, die durch
negative Erfahrungen mit nicht ausgereiften
biotechnologischen Verfahren
entstanden sind, abgebaut werden.
Schließlich sollten andere Hemmnisse
für die bisher nicht erfolgte großflächige
Verbreitung biotechnologischer Verfahren
in der Textilindustrie identifiziert
Abb. 1: Temperatur-Zeit-Diagramm
werden. Besonders jedoch sollten
durch den angestrebten Wissenstransfer
neue Entwicklungsprojekte angeregt
und hierzu potentielle Partner zusammengeführt
werden.
Wirtschaftlichkeitsanalyse
von Verfahren zur
Entfernung von Restperoxid
aus baumwollhaltigen
Textilien nach der
oxidativen Bleiche mit
Wasserstoffperoxid
Insbesondere um die Textilveredlungsbranche
für die Potentiale biotechnologischer
Produkte und Prozesse
in der Wertschöpfungskette der
Textilveredlung zu sensibilisieren wur-
den für einen konkreten Verfahrensschritt,
die Entfernung von Restperoxid
im Anschluss an die oxidative
Bleiche baumwollhaltiger Textilien,
das konventionelle Verfahren und die
neue biotechnologische Alternative
unter ökonomischen Gesichtspunkten
analysiert.
Der Prozess
Üblicherweise wird heutzutage nicht
mehr Chlor sondern Wasserstoffperoxid
als Bleichmittel für Textilien eingesetzt.
Um in den nachfolgenden Färbeprozessen
höchste Qualität zu erzielen,
ist es notwendig, Bleichmittelreste
vollständig aus dem weiter zu veredelnden
Textil zu entfernen.
Im konventionellen Verfahren wurde
die Entfernung des Restperoxids
durch wiederholtes (d.h. mindestens
zweifaches) Spülen des Textils mit
heißem Wasser angestrebt. Diese Verfahrensweise
ist nicht nur sehr energie-
und wasserintensiv, sondern kann
auch die erforderliche vollständige
Entfernung von Wasserstoffperoxidresten
nicht garantieren.
Aus diesem Grund wurde ein neues
enzymatisches Verfahren entwikkelt,
das mittlerweile als etabliert gelten
darf und weitreichende, wenn
auch noch nicht vollständige Verbreitung
in der Textilveredlungsindustrie
gefunden hat. Bei diesem neuen bio-

technologischen Verfahren wird nach
der oxidativen Bleiche der Textilien
nur einmal bei hoher Temperatur gespült
(je nach Materialart bedeutet
dies Temperaturen zwischen 80-
96°C). Anschließend wird einer neuen
Flotte das Enzym Katalase zudosiert,
das bei Temperaturen zwischen 30°C
und 40°C ca. 15 Minuten einwirkt. Im
analysierten Prozess kam das Präparat
“KAPPAZYM AP Neu” der Kapp
Chemie GmbH, Miehlen, zum Einsatz.
Das Enzym zerlegt überschüssiges Peroxid
in Wasser und Sauerstoff. Anschließend
können sofort notwendige
Folgeprozesse gestartet werden,
deren Ergebnisse übrigens ein signifikant
höheres Qualitätsniveau gegenüber
dem konventionellen Verfahren
aufweisen.
Da (mindestens) ein Spülgang eingespart
wird, verringert sich sowohl
der Einsatz der Ressourcen Wasser
und Energie als auch die Prozessdauer.
Alt vs. Neu –
Prozessvergleich
Um den Rahmen für eine Betrachtung
unter gleichen Bedingungen zu schaffen,
müssen der neue biotechnologische
Prozess und seine verfahrenstechnische
konventionelle Alternative
genau abgegrenzt werden. Diese Grenzen
sind die Punkte, bis zu dem und
ab dem die betrieblichen Prozesse
unabhängig von der Verfahrenssubstitution
gleich sind.
Für beide Verfahrensweisen gilt,
dass der Prozess nach dem Ablassen
der Bleichflotte aus der Anlage und mit
dem Einlassen einer Spülflotte in den
Färbeapparat beginnt. Er endet jeweils
mit dem Einleiten derjenigen Chemikalien,
die eine reduktive Bleiche synthetischer
Textilbestandteile in Gang
setzen. In Abbildung 1 ist der analysierte
Schritt als „bleach cleanup“ bezeichnet
und reicht von 0 bis 180 Minuten.
Um den angeführten Verfahrensvergleich
durchzuführen, mussten einige
grundlegende Annahmen getroffen
werden:
Zahl der Bleichprozesse pro Jahr
Bedingt durch die technischen Spezifikationen
beider Prozesse sind bei
der durchgeführten Verfahrenssubstitution
keine Veränderungen an den
Anlagen des Textilveredlungsbetriebs
notwendig, die Investitionen erfordern
würden. Lediglich die Programme für
die Maschinensteuerung mussten
modifiziert werden. Ein Vergleich zwischen
dem alten und neuen Verfah-
Abb.2: Baumfärbeapparat HT 09.
Abb. 3: Gelochte Stahlzylinder zur Aufnahme der Textilwickel, HT 09 im
Hintergrund.
ren zur Zerstörung des Restperoxids
lässt sich daher sowohl für einen einzigen
Bleichprozess als auch für die
Gesamtheit der Prozesse eines Jahres
durchführen. Zur besseren Vergleichbarkeit
von ökonomischen Ergebnissen
über längere Zeitabschnitte hinweg
wurde in der Analyse der Zeitraum
eines Jahres zugrunde gelegt.
Dazu wurden alle Produktionsaufträge
mehrerer Monate untersucht und
die Zahl von Bleichprozessen der interessierenden
Art ermittelt. Die Anzahl
der ermittelten Prozesse wurde
dann auf ein volles Geschäftsjahr (12
Monate) hochgerechnet. Den Ergebnissen
liegt die Anzahl von insgesamt
1420 Prozessen zur Entfernung von
Restperoxid, davon 1124 auf Baumfärbeapparaten
und 296 auf Strangfärbeapparaten
ausgeführt, zugrunde.
Auswahl der Produktionsanlage
Beim ausgewählten Textilveredlungsbetrieb
werden zur Peroxidbleiche
zwei verschiedene Anlagentypen genutzt.
Zum einen sind das Baumfärbeapparate
mit den firmeninternen
Bezeichnungen HT 01 bis HT 11 und
zum anderen Strangfärbeapparate mit
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
123
den firmeninternen Bezeichnungen
Soft 15 und Soft 16 (siehe dazu die
Abbildungen 2 bis 4).
Im Betrachtungszeitraum wurden
1420 Bleichprozessen mit Einsatz der
Katalase Kappazym AP Neu durchgeführt.
Ca. 80 % wurden auf den Baumfärbemaschinen
abgearbeitet. Auf die
Soft-Färbeapparate entfielen die anderen
ca. 20 % der Gesamtmenge.
Da es im analysierten Unternehmen
Abb. 4: Strangfärbeapparat Soft 15.
Baumfärbemaschinen in unterschiedlichen
Größen gibt, war es wichtig,
eine „durchschnittliche“ Apparatur
zu identifizieren. Ca. 1/3 aller Bleichprozesse
auf Baumfärbemaschinen
liefen auf dem Apparat HT 09, der mit
einer Füllmenge von 5.800 Litern
Flotte auch als durchschnittlich groß
angesehen werden kann. Da weitere
50 % der Prozesse zu etwa gleichen
Teilen auf den Apparaten HT 02 und
HT 10 liefen, die von ihrer Füllmenge
her ähnlich weit von den 5.800
Litern des HT 09 entfernt sind (HT
02: 2.600 l, HT 10: 8.500 l), wurde
Apparatur HT 09 als die Apparatur
identifiziert, an der man die Analyse
für den Bereich Baumfärben durchführen
kann.
Eine ähnliche Annahme musste für
den Bereich der Strangfärbeapparate
nicht getroffen werden, da die Apparaturen
Soft 15 und Soft 16 gleiche
Größe und Füllmenge besitzen. Die
Analyse für diese Bleichprozesse wird
am Beispiel von Soft 15 durchgeführt,
da im Betrachtungszeitraum ca. 75 %
aller Prozesse auf diesem Apparat
durchgeführt wurden.
Materialeinsatz pro
Prozess
Es wurde die durchschnittlichen Menge
an zu veredelndem Textil je Prozess
ermittelt, da diese Menge den
Einsatz an Prozesswasser determiniert.
Für den Prozess auf dem Baumfärbeapparat
ergibt sich ein durchschnittlicher
Materialeinsatz von 226
kg je Prozess, für den Strangfärbeapparat
157 kg je Prozess. Selbstverständlich
wurden alle getroffenen Annahmen
mit den ausführenden Praktikern
im Unternehmen abgesprochen
und von ihnen bestätigt.
Nachdem somit ein quasi idealer
Prozess identifiziert war, wurde er für

124 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
beide Verfahren betriebswirtschaftlich
untersucht. Dabei kamen Fixund
Proportionalkostensätze aus der
Betriebskalkulation, die im Betrachtungszeitraum
aktuellen Einkaufspreise
für Chemikalien und Betriebsstoffe
sowie die im Betrachtungszeitraum
gültigen kommunalen Preise für
Wasser und Energie zum Einsatz. Außer
dem Wasserstoffperoxid kommen
bei der Bleiche von Mischgewebe
noch eine ganze Reihe anderer Chemikalien
zum Einsatz, so z.B. Stabilisatoren,
Kochsalz und Faserschutzmittel.
Dampf dient zum Aufheizen
der Bleichflotte, Kühlwasser zum Abkühlen
derselben. Prozesswasser ist
das Wasser, das als Bleichflotte direkt
mit den Textilien in Berührung
kommt.
Ergebnis
Aus Gründen der Geheimhaltung werden
hier keine absoluten Zahlen genannt,
sondern die Kosten des neuen
Verfahrens in Relation zum herkömmlichen
Verfahren dargestellt
(siehe Tabelle: Kostensenkung nach
Anlagentyp).
Mit dem enzymatischen Verfahren
sind sowohl auf dem Baum- als auch
auf dem Strangfärbeapparat Einsparungen
zu erzielen. Die Kosten für
Chemikalien steigen zwar um 7% bzw.
11% an, dies erklärt sich jedoch dadurch,
dass hier die Kosten für das
Enzym einfließen. In allen anderen
Bereichen reduzieren sich die Kosten,
zum Teil sogar bis zu 20%. Dabei
muss berücksichtigt werden, dass die
einzelnen Kostenfaktoren in unterschiedlich
hohem Maß an den Gesamtkosten
beteiligt sind. Unter diesen
Voraussetzungen schneidet das
enzymatische Verfahren letztendlich
rund 6% bzw. 8% billiger ab, als das
herkömmliche.
Die Substitution des herkömmlichen
mehrfachen Spülens zur Entfernung
von Wasserstoffperoxid-Resten
bei der Baumwollbleiche durch eine
enzymatische Behandlung mit der Katalase
KAPPAZYM AP Neu bewirkt
konkret die folgenden Vorteile:
– Der Ressoucenverbrauch sinkt
durch die deutliche Einsparung von
Wasser (sowohl beim Spülen als auch
durch den Einsatz als Kühlmittel für
den gesamten Prozess) sowie die Einsparung
von Prozessenergie in Form
von Dampf.
– Die Umweltbelastung verringert
sich sowohl durch die genannte Senkung
des Ressourcenverbrauchs als
auch durch geringere Einleitung von
industriellem Abwasser.
Tab. 1: Kostensenkung nach Anlagentyp
– Die Kosten des Unternehmens für
diesen Verfahrensschritt verringern
sich signifikant; es konnten je nach
verwendetem Maschinentyp und zu
bearbeitendem Material Kostensenkungen
zwischen 6 und 8 % per anno
realisiert und nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse dieser Wirtschaftlichkeitsanlyse
zeigen am konkreten
Beispiel, dass schon eine geringfügige
produktionsintegrierte biotechnologisch
basierte Verfahrensänderung
den Ressourcenverbrauch und die
Umweltbelastung deutlich gesenkt
hat, ohne dass dazu technisch und finanziell
aufwändige Investitionen notwendig
waren. Wesentlich ist gleichzeitig,
dass durch die gezeigte verfahrensinduzierte
Kostensenkung die
Wettbewerbsfähigkeit des Unternehmens
gesteigert wurde.
Identifikation weiterer
Einsatzgebiete
biotechnologischer
Verfahren in der
Textilveredlung
Die am konkreten Beispiel aufgezeigten
Potenziale des Einsatzes biotechnologischen
Know-hows in der Textilveredlung
regten die interdisziplinäre
Diskussion über mögliche weitere
Einsatzgebiete für biotechnologische
Verfahren in der Wertschöpfungskette
der Textilveredlung maßgeblich an.
Aus der Diskussion zwischen Experten
verschiedener Fakultäten und
dem damit verbundenen fachübergreifenden
Wissenstransfer entstanden
während der Projektlaufzeit und
des Abschlussworkshops keine konkreten
Verfahrensvorschläge. Jedoch
wurden in einer Prioritätenliste eine
Vielzahl von Handlungsfeldern für verschiedenste
Prozessstufen der Textilveredlung
identifiziert, innerhalb derer
der Einsatz biotechnologischer
Verfahren wünschenswert und möglich
erscheint.
Potenzielle Einsatzgebiete biotechnologischer
Verfahren in der Textilveredlung:
– Reinigen von Textilmaschinen:
Ersatz des chemikalienintensiven Auskochens
der Anlagen durch ein schonenderes
enzymatisches Verfahren.
– Enzymatischer Schnelltest beim
Wareneingang:
Beantwortung der für die weitere Bearbeitung
der Textilien relevanten
Fragen, welche Chemikalien in welchen
Mengen auf das Textil aufgebracht
sind und ob Enzyminhibitoren
und/oder Komplexbildner vorhanden
sind.
– Identifizierung und Einsatz einer
sauren Amylase:
eine pH 2-taugliche Amylase könnte
die Verbindung der Arbeitsgänge Entmineralisieren
und Entschlichten ermöglichen.
– Alternative Bleichmittel:
Ersatz herkömmlicher Bleichmittel
wie Wasserstoffperoxid durch Peroxidasen.
– Abbau von Silikonverbindungen:
Enzymatischer Abbau von Silikonverbindungen,
die im Rahmen der Ausrüstung
auf das Textil aufgebracht
wurden.
– Enzymatisches Abkochen:
Ersatz des alkalischen Abkochens
durch einen „Enzymcocktail“ oder
ganze Mikroorganismen.
–Biofinishing:
Einsatz von Cellulasen und Co-Faktoren
zum Ersatz chemischer Ausrüstungsverfahren.
– Alternative Schlichtemittel:
Einsatz von Proteinhydrolysaten als
Schlichtemittel.
Resultate
Die Textilveredlungsindustrie ist
durch hohen Energie- und Ressourcenverbrauch
und zeitintensive Produktionsprozesse
charakterisiert.
Deshalb können produktionsinte-
grierte biotechnologische Verfahren
hier in besonderem Maße dazu beitragen,
Energie und Wasser zu sparen,
Emissionen zu vermindern sowie
die Prozesse und somit die Durchlaufzeiten
zu verkürzen. Der Nachweis
ökonomischer Vorteile ist maßgeblich
für die Bereitschaft von Entscheidungsträgern
in Unternehmen, ökologisch
vorteilhafte innovative Verfahren
zur Anwendung zu bringen.
Aus dem Projekt resultiert die am
konkreten Beispiel der Verfahrenssubstitution
der Zerstörung von Restperoxid
in der textilen Bleiche gewonnene
Erkenntnis, dass Einsatzmöglichkeiten
biotechnologischer Produkte
und Prozesse in der textilen
Wertschöpfungskette für Unternehmen
genannte Minderungen des Ressourceneinsatzes
sowie Verringerung/
Vermeidung von Emissionen und somit
Kostensenkungen bedeuten können.
Das Projekt zeigte weiterhin, dass
die bisher als unzureichend anzusehende
Anwendung biotechnologischer
Verfahren in der textilen Wertschöpfungskette
nicht auf Ressentiments
seitens der Textilveredlungsindustrie
gegenüber dieser Art von
Technologien zurückzuführen ist.
Vielmehr besteht hier ein Technologiebedarf
an anwendungsreifen, in
ihrer verfahrenstechnischen Sicherheit
über Erstanwendungen hinausgehenden
Verfahren. Den vorwiegend
klein- und mittelständisch geprägten
Unternehmen in der Textilveredlung
fehlen i.d.R. die technischen und finanziellen
Mittel, um Ergebnisse der
Forschung in Verfahren zu überführen
bzw. verfahrenstechnische Erkenntnisse
auf die unternehmensspezifischen
Gegebenheiten zu adaptieren.
Der Technologiebedarf geht ebenfalls
über das Realisieren von „Insellösungen“
hinaus. Dies bedeutet für
eine zukünftige Entwicklung, dass - bei

aller Konzentration auf schnellstmögliche
Lösung drängender Probleme
der Unternehmen - in Übereinstimmung
mit den Bedürfnissen der Branche
noch eine Vielzahl von biotechnologischen
Verfahren entwickelt und
angeboten werden kann, die je nach
den unternehmensspezifischen Gegebenheiten
(Produkte, Prozesse, anla-
UMWELTBILANZIERUNG
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
125
Umweltorientierte Bewertung von
Produktionsprozessen am Beispiel
der Verbundinitiative BIOL
� Dipl.-Ing. René Gildemeister, Dr. Cornelia Haase, Dr. Horst Moormann, Dr. Jens Wohlers, Prof. Dr. Norbert Räbiger
Institut für Umweltverfahrenstechnik, Universität Bremen
Als Teilprojekt innerhalb des Verbunds „Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft“ - kurz: BIOL - wird das vom Institut für Umweltverfahrenstechnik
(IUV) der Universität Bremen entwickelte Methodenkonzept der umweltrelevanten Bewertung als Maßnahme zur Unterstützung der Entwicklung neuer
innovativer Prozesse und Verfahren im Vergleich zu konkurrierenden Verfahren angewendet. Primäres Ziel ist es, die Entwicklung biotechnologischer
Innovationen in der Lebensmittelindustrie sowohl als Einzelsystem wie auch als integrativer Bestandteil einer Produktionslinie hinsichtlich der Nachhaltigkeitsanforderungen
projektbegleitend zu unterstützen. Die Anwendung der Umweltbilanzierung in einem frühen Stadium der Produktentwicklung kann
mögliche Umweltgefährdungspotenziale aufdecken und ermöglicht eine nachhaltige Ausrichtung der Innovation für die spätere Produktion. Erste Erfolge
hinsichtlich eines besseren Ressourcenmanagements und einer optimierten Produktionsentwicklung konnten bereits in guter Zusammenarbeit mit den
involvierten Arbeitsgruppen erzielt werden. Ein weiteres Ziel des Projekts ist die Erhöhung der Akzeptanz von Methoden der Umweltbilanzierung und
deren Weiterentwicklung durch Zusammenarbeit und Erfahrungsaustausch mit Arbeitsgruppen, die auch an Methoden der Umweltbilanzierung arbeiten.
Keywords: Bewertung, Biotechnologie, Lebensmittelindustrie, Nachhaltigkeit, produktionsintegrierter Umweltschutz, Umweltbilanzierung.
Einleitung
Das gestiegene Bewusstsein über die
Bedeutung der Nachhaltigkeit, des Umweltschutzes
und möglicher Umwelteinwirkungen,
die mit der Produktion und
Anwendung von Produkten sowie mit
Dienstleistungen im Zusammenhang
stehen, hat das Interesse an den vorgeschlagenen
Maßnahmen der Integrierten
Produktpolitik (IPP) erhöht. Zur
Verringerung der negativen Umweltauswirkungen,
zur Charakterisierung der
Nachhaltigkeit der Produktionslinien
und zur Sicherung der Konkurrenzfähigkeit
von Industriestandorten wird
hierbei insbesondere auf die Integration
der umweltrelevanten Produktbewertung
in den Verantwortungsbereich
des Managements hingewiesen, wo sie
durch Anwendung von Bewertungsmethoden
umgesetzt werden muss.
Vor diesem Hintergrund der wachsenden
Berücksichtigung ökologischer
gentechnische Ausstattung, Art und
Umfang des Ressourcenverbrauchs
bzw. der Emissionen) zum Einsatz in
der textilen Wertschöpfungskette
kommen können.
Abschließend ist anzumerken, dass
für einige der im Rahmen des Projekts
identifizierten Einsatzgebiete biotechnologischer
Produkte oder Prozesse
Belange, der Forcierung des Kreislaufgedankens
und steigender Anforderungen
an die Flexibilität von Produktionssystemen
gewinnen zukunftsweisende
und umweltorientierte Analyse- und Bewertungsmethoden
für eine bessere
Integration ökonomischer sowie ökologischer
Aspekte bei der Entscheidungsfindung
im Unternehmen zunehmend
an Bedeutung.
Im Institut für Umweltverfahrenstechnik
(IUV) wurde das „Methodenkonzept
zur umweltrelevanten und
ökonomischen Bewertung von Produktionslinien“
entwickelt. Das Ziel dieses
Methodenkonzepts ist es, sowohl
die ökologischen als auch die
häufig damit in Verbindung stehenden
ökonomischen Schwachstellen und
Optimierungspotenziale entlang von
bestehenden und/oder in der Entwicklung
befindlichen Produktionslinien
als solche zu identifizieren sowie
zu lokalisieren und somit Einspa-
in derzeit laufenden Projekten verschiedener
Förderschwerpunkte
(„Biokatalyse“ der Deutschen Bundestsiftung
Umwelt, „Nachhaltige Bio-
Produktion“ des Bundesministeriums
für Bildung und Forschung) nach anwendungsreifen
Lösungen geforscht
bzw. an konkreten Umsetzungen dieser
Lösungen gearbeitet wird.
rungs- und Entwicklungspotenziale
transparent und nachvollziehbar offen
zu legen.
Im Rahmen der DBU-Verbundinitiative
„Biotechnologie in der Lebensmit-
Korrespondenzadresse
Peter Gebhart
DECHEMA e.V.
Karl-Winnacker-Institut
AG Bioverfahrenstechnik
Tel.: 069-7564 426
Fax: 069-7564 388
eMail: gebhart@dechema.de
telwirtschaft“ - kurz: BIOL - soll das
Methodenkonzept und dessen methodische
Weiterentwicklung auf die Produktion
angewendet werden. In der
Lebensmittelverarbeitung zeichnen
Abb. 1: Methodenkonzept zur umweltrelevanten und ökonomischen Bewertung
von Produktionslinien.

126 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
sich viele Prozesse aufgrund der hohen
hygienischen Anforderungen an
das Produkt durch einen großen Wasser-
und Energieverbrauch aus. Auch
wenn vor allem aufgrund bisheriger
wirtschaftlicher Betrachtungen an vielen
Stellen der Ressourcenverbrauch
reduziert wurde, ist immer noch ein
großes Einsparpotenzial vorhanden,
welches sich allerdings häufig erst
nach intensiver Analyse identifizieren
lässt. Da sich der wirtschaftliche Aufwand
nur schwer abschätzen lässt,
scheuen viele Unternehmen Mühen
und Kosten einer solchen Analyse. Als
Folge hiervon bleibt das Potenzial zur
Ressourceneinsparung im Unternehmen
oft unerkannt, wobei dies im
Besonderen für die Umsetzung von
Innovationen gilt. Innerhalb der F&E-
Phase wurde den Auswirkungen von
Innovationen auf die Nachhaltigkeit
im Zielprozess bisher nur wenig Aufmerksamkeit
gewidmet.
Das Ziel des BIOL-Projekts ist eine
projektbegleitende umweltrelevante
Bewertung von vier der im Rahmen
der DBU-Verbundinitiative geförderten
innovativen biotechnologischen
Verfahren als integrativer Bestandteil
einer Produktionslinie sowie als Einzelsysteme,
die über Synergien im
Bereich produktionsintegrierter Einsatz,
Ressourcenminimierung oder
Qualitätskontrolle verfügen.
Darstellung des
Methodenkonzepts der
umweltrelevanten
Bewertung
Zur Bewertung bestehender sowie
geplanter Verfahren und Prozesse
wurde ein Methodenkonzept entwikkelt,
das einen ökonomischen und
ökologischen Vergleich von Systemen,
Prozessen und Prozesslinien ermöglicht
[3]. Hervorzuheben ist die umfassende
Einbeziehung umweltrelevanter
Faktoren, die sowohl ökologische
als auch human- und ökotoxikologische
Auswirkungen berücksichtigen.
Das entwickelte Methodenkonzept
orientiert sich in seiner Vorgehensweise
an der Erstellung von Ökobilanzen
(DIN EN ISO 14040 ff.) und
setzt sich aus folgenden Modulen zusammen:
– Zieldefinition,
– Sachbilanz,
– Bewertungsmethode,
– Schwachstellendefinition und Optimierungsanalyse,
– ökonomische Betrachtung.
Die einzelnen Module können in einem
iterativen Prozess jeweils ange-
Abb. 2: Ausgewählte Wirkungskategorien und Einflussgrößen der Bewertungsmethode.
passt werden und sind je nach dem Ziel
variabel ausführbar (Abb. 1).
Zu Beginn der Anwendung des Methodenkonzepts
werden in der Zieldefinition
der Untersuchungsrahmen
festgelegt sowie die Forschungsinteressen
dargestellt. Nach einer detaillierten
Systembeschreibung werden die
Bilanzgrenzen und damit der Bilanzraum
festgelegt, der sich im vorliegenden
Methodenkonzept auf die Produktionslinien
begrenzt.
In der Sachbilanz, welche die notwendige
Voraussetzung zur iterativen
Durchführung des Methodenkonzepts
darstellt, erfolgt die möglichst detaillierte
Erfassung der Stoff- und Energieströme
der zu vergleichenden relevanten
Systeme und Prozesse. Mit den
in der Sachbilanz erhobenen Daten
werden Kennzahlen zur Dokumentation
und Beurteilung der Umweltleistung
eines Unternehmens gebildet. Dadurch
lassen sich Produktionsprozesse über
die gesamte Produktionslinie charakterisieren
und Zusammenhänge hinsichtlich
Nachhaltigkeit und Ressourcenverbrauch
aufzeigen. Das Stoffstrommanagement
sämtlicher Inputund
Outputströme ermöglicht bereits
zu diesem Zeitpunkt eine zielgerichtete
Optimierung bzw. eine kontinuierliche
Verbesserung der Produktionslinie.
Das Ziel der Bewertungsmethode
ist es, die innerhalb einer Produktion
mit Produkten, Prozessen und
Dienstleistungen in Verbindung stehenden
Beeinflussungen der Umwelt zu erfassen,
nachvollziehbar aufzubereiten,
die jeweils spezifischen Wirkungen abzuschätzen
und zu bewerten. Die umweltrelevante
Bewertung basiert auf
einer Modifikation der Methode von
Gebler [2]. Das Bewertungsergebnis
besteht aus einem Kennwert, dem
Funktionswert für umweltrelevante
Wirkungen (F ges ), der in geeigneter
Weise die gesamtökologischen Umweltauswirkungen
eines Systems repräsentiert.
Zur Ermittlung des Funktionswerts
für umweltrelevante Wirkungen
wird aufbauend auf der Sachbilanz
zunächst jeder im Produktionsprozess
definierte Stoff sowie dessen
Abbau- und Umwandlungsprodukte
aufgrund seiner potenziellen Wirkungen
in verschiedene Wirkungskategorien
klassifiziert. Als Wirkungskategorien
werden sowohl toxikologische als
auch ökotoxikologische Kriterien berücksichtigt
(Abb. 2).
Innerhalb der Wirkungskategorien
wird anschließend jeder klassifizierten
Substanz ein repräsentativer Wirkungsindikator
zugeordnet. Die Indikatoren
stellen stoffspezifische, naturwissenschaftlich
abgesicherte und das Schadenspotenzial
bewertende Größen dar.
Die stoffspezifischen Werte für die Berechnung
der Wirkungsindikatoren
der einzelnen Substanzen/Stoffe werden
der UBA-Datenbank, den gängigen
Sicherheitsdatenblättern und Nachschlagewerken
sowie der institutseigenen
Datenbank entnommen. Liegen
die benötigten Daten nicht vor, erfolgt
über die Analyse von Struktur-/Wirkungsbeziehungen
eine Abschätzung
hinsichtlich der Substanzeigenschaften
(z. B. QSAR).
Im nächsten Schritt werden die Wirkungsindikatoren
innerhalb jeder Kategorie
in eine gemeinsame Einheit
umgerechnet, welche die Zusammenfassung
in ein Wirkungsindikatorergebnis
erlaubt (Charakterisierung).
Die so für jede Wirkungskategorie berechnetenWirkungsindikatorergebnisse,
die weder qualitativ noch quantitativ
unmittelbar miteinander vergleichbar
sind, stellen nach DIN EN ISO
14042 zusammen das Wirkungsabschätzungsprofil
für eine Substanz dar.
Zur Formulierung einer ganzheitlichen
Aussage über die gesamtökologischen
Umweltauswirkungen von
Stoffen und Energien stellt die Reduktion
der Komplexität in Form eines
Zahlenwerts eine wesentliche Voraussetzung
für die Auffindung von ökologischen
Schwachstellen in Produktionslinien
dar, ohne den Einfluss der
Subjektivität des Bewertenden berücksichtigen
zu müssen. Hierzu muss die
in viele Wirkungskategorien aufgeteilte
Umweltrelevanz auf einen Funktionswert
zurückgeführt werden.
Zur Bildung eines einzigen wirkungskategorieübergreifendenKennwerts,
zur Verbesserung der Trennschärfe,
zur Vermeidung von Scheingenauigkeiten
und zur Senkung der
Fehlerquote werden im ersten Schritt
den ermittelten Indikatorergebnissen
abgestufte Größenordnungen zugewiesen
(Einordnung). Zur Erhöhung der
Übersichtlichkeit werden alle stoffspezifischen
Toxizitätsfaktoren (Tx’, Tx’’,
Tx’’’ und Tx’’’’) zu einem Kennwert
Tx zusammengefasst und gleichrangig
gewichtet. Der Minimalwert (pessimistische
Annahme) wird aus allen vier
Datentypen als Kennwert Tx gewählt.
Die ermittelten Indikatorergebnisse
der Wirkungskategorien der Bioakkumulation
(BCF’), der Biomagnifikation
(AF’) und der Persistenz (PF) werden
anschließend mit dem stöchiometrischen
Faktor λ multipliziert und als
Bezugsgröße nach ihrem Gefährdungspotenzial
(Tx S ) als Ökogefährdungsfaktor
Tx ök gewertet:
(Bio = Biomasse; S = Substanz)
Das pro kg Substanz vorhandene
Potenzial einer Schadwirkung wird mit
Hilfe des Ökogefährdungsfaktors ausgedrückt.
Bei der Berechnung des Funktionswerts
für umweltrelevante Wirkungen
eines Schadstoffs (F-Wert) werden die
Schadstofffrachten (m S ) der entsprechenden
Substanz und seiner Abbauprodukte
mit den stoffspezifischen
Ökogefährdungsfaktoren multipliziert.
Eine Substanz kann auch durch ihre
Abbauprodukte umweltgefährdend
wirken, die dafür in die Berechnung
des F-Werts mit einbezogen werden
müssen:
(PE = Produktionseinheit)
Abschließend werden die Funktionswerte
für umweltrelevante Wirkun-

gen (F S ) aller anfallenden Stoffe S zu
einem Gesamtfunktionswert umweltrelevanter
Wirkungen (F ges ) zusammengefasst,
wobei hier das Gemischgefährdungspotenzial
von Schadstoffen mit
Hilfe eines so genannten Gemischgefährdungsfaktors
(G Si,Sj ) berücksichtigt
wird:
Eine Übersicht über die einzelnen
Berechnungsschritte zur Ermittlung
des Funktionswerts gibt Abbildung 3.
Zur Durchführung der Analyse
zur umweltrelevanten Schwachstellendefinition
wird der ermittelte
Kennwert (F ges ) über die einzelnen
Prozessschritte einer Produktionslinie
aufgetragen. Durch Visualisierung der
umweltrelevanten Bewertung in Diagrammdarstellung
und der Anwendung
von mathematischen Kriterien
auf den Kurvenverlauf können die
ökologischen Schwachstellen einer
Produktionslinie transparent und
nachvollziehbar ermittelt werden.
Nach erfolgter Schwachstellendefinition
können mit Hilfe des Moduls zur
umweltrelevanten Charakterisierung
von Optimierungsansätzen
durch Modellbildung auch mögliche
integrierte Umweltschutzmaßnahmen
erarbeitet und deren Anwendung im
Produktionsprozess bewertet werden.
Bei der ökonomischen Betrachtung
werden aufbauend auf der Sachbilanz
den einzelnen Stoff- und Energieströmen
Wertmaßstäbe zugeordnet.
Aufgrund der erhöhten Transparenz
der ökonomischen Aspekte können
die Kosten den einzelnen Prozessschritten
zugeordnet, Kostenpotenziale
identifiziert und eine Entscheidungsgrundlage
für mittel- und langfristige
Planungen geschaffen werden.
Die Anwendung der
Umweltbilanzierung in der
Verbundinitiative BIOL
Die nachhaltige Produktion im Bereich
der Life Sciences gilt als eine der
Schlüsseltechnologien des 21. Jahrhunderts
und wird in Zukunft ein zentraler
strategischer Wettbewerbsfaktor
der Wirtschaft sein. Aufgrund der hohen
hygienischen Anforderungen an
das Produkt zeichnen sich viele Prozesse
der Lebensmittelverarbeitung
durch einen großen Wasser- und Energieverbrauch
aus. Des Weiteren resultieren
aus der biotechnologischen
Forschung erhöhte Ansprüche an die
Produktsicherheit, welche die Unternehmen
der lebensmittelverarbeitenden
Industrie vor große Herausforde-
rungen stellen. Die effiziente Umstellung
auf eine nachhaltige Produktion
erfordert daher bereits im Vorfeld einer
Investition eine umweltrelevante
Analyse der Produktionsprozesse, da
sich die vorhandenen, aber nicht augenfälligen,wertschöpfungssteigernden
Potenziale erst nach intensiver
Analyse identifizieren lassen.
Im Rahmen der DBU-Verbundinitiative
BIOL erfolgt bereits während
der Entwicklung von vier biotechnologischen
Innovationen die Anwendung
und methodische Weiterentwicklung
der auf die Produktion ausgerichteten
Umweltbilanzierung, um
als Projektziel bereits frühzeitig einen
Beitrag zur nachhaltigen Entwicklung
dieser ressourcenintensiven Produktion
zu leisten. Aufgrund von Synergien
im Bereich produktionsintegrierter
Einsatz, Ressourcenminimierung
und/oder Qualitätskontrolle wurden
folgende vier geförderte biotechnologische
Verfahren ausgewählt:
– Biotechnologische Veredelung von
terpenhaltigen Reststoff-Fraktionen
der citrusverarbeitenden Industrie zu
hochwertigen natürlichen Duft- und
Aromastoffen
– Ressourcen- und umweltschonende
Behandlung von Lebensmitteln
durch Hochdruck
– Neues biotechnologisches Verfahren
zur Brauchwassergewinnung mit
Trinkwasserqualität aus Abwässern
der Lebensmittelverarbeitung
– Optimierung von DNA-Arrays zur
Analyse von Milch und Milchprodukten
Sonderband | 2003 | BIOKATALYSE
127
Abb. 3: Bewertungsschritte zur Ermittlung des Funktionswertes für umweltrelevante Wirkungen (F-Wert).
Die Anwendung der Umweltbilanzierung
innerhalb der Entwicklung
biotechnologischer Innovationen findet
in einem frühen Stadium der jeweiligen
Projekte statt, um bereits bei
der Konzeptionierung der Innovationen
unterstützend mitwirken zu können.
Als weiteres Teilziel dieses Vorhabens
soll die Akzeptanz von Methoden
der Umweltbilanzierung erhöht
leisteten die Basis für die Bewertung
der geplanten bzw. bestehenden Prozesse.
Mit Hilfe dieser Unterstützung
ist eine hohe Datensicherheit im Allgemeinen
erreicht worden. War die
Datenlage für die Bewertung lückenhaft
oder erforderte präzisere Werte,
konnten zusätzlich unter der Voraussetzung
eines vertretbaren Aufwands
gezielte Messungen zur Erweiterung
Abb. 4: Bilanzierung und Modellierung von Stoffströmen.
sowie deren Weiterentwicklung gefördert
werden. Hierzu erfolgt ein kontinuierlicher
Erfahrungsaustausch mit
anderen an den Methoden der Stoffstrombilanzierung
beteiligten Arbeitsgruppen.
Bei der Durchführung der Projekte
erfolgte zunächst in enger Zusammenarbeit
mit den Projektpartnern
die Festlegung der Systemgrenzen und
die Aufnahme bzw. Überlassung von
Daten. Die Grundvoraussetzungen zur
Erfassung der Input- und Outputströme
waren somit gegeben und gewähr-
der Datenlage vor Ort durchgeführt
werden. Das gute Klima zwischen den
Projektpartnern ermöglichte eine erfolgreiche
Zusammenarbeit, im Rahmen
derer Beiträge zur Optimierung
der innovativen biotechnologischen
Prozesse bezüglich eines nachhaltigen
Ressourcenmanagements bereits
geleistet werden konnten. Hinweise
über die Auswirkung einer späteren
Integration der Innovation in die Gesamtproduktion
oder eine Neuausrichtung
der Produktionslinie konnten
ebenfalls erbracht werden und

128 BIOKATALYSE
| Sonderband | 2003
unterstützten die Arbeitsgruppen bei
der Fokussierung ihrer F&E-Aktivitäten.
Im Folgenden wird am Beispiel des
Projektes: „Optimierung von DNA-Arrays
zur Analyse von Milch und Milchprodukten“
die Vorgehensweise unter
Anwendung des Methodenkonzepts
kurz beschrieben und dargestellt.
Bei Fermentationsprozessen in der
Milchindustrie bestehen durch virale
oder bakterielle Kontaminationen
erhebliche ökonomische und umweltrelevante
Risiken. Für eine Vielzahl
von Milchprodukten werden
spezifische bakterielle Starterkulturen
eingesetzt, deren Qualität durch
die Kontamination mit kulturschädigenden
Bakterien und insbesondere
durch Bakteriophagen (Bakterien lysierende
Viren) gefährdet ist. Deshalb
ist eine ständige Qualitätskontrolle
der eingesetzten Starterkulturen und
der Milchprodukte sowie der verwendeten
Roh- und Hilfsstoffe erforderlich.
Konventionelle mikrobiologische
Untersuchungsmethoden benötigen
bis zum Ergebnis der Analysen
einen Zeitraum von bis zu drei Tagen
und in Einzelfällen einen noch längeren
Zeitraum. Diese Zeiten entsprechen
den Quarantänezeiten der Produkte.
Im Fall von Fehlfermentationen
fallen damit neben dem wirtschaftlichen
Schaden Umweltbelastungen
aufgrund der dadurch notwendigen
Entsorgung der Produkte
und der anschließenden Reinigung
der Produktionsanlagen an. Durch
den Einsatz eines DNA-Arrays könnten
die genannten Risiken aufgrund
der zeitnahen Detektion erheblich
minimiert werden.
Die Untersuchungen erfolgen an
einer Sauermilchproduktionslinie.
Zu Beginn erfolgt die Festlegung der
Systemgrenzen und innerhalb des damit
festgelegten Bilanzraumes die
Aufnahme der Sachbilanzdaten (Abb.
4).
Auf Basis dieser ermittelten Daten
werden dann in der sich anschließenden
Wirkungsanalyse wie beschrieben
die Funktionswerte für umweltrelevante
Wirkungen ermittelt. Aus
der Bilanzierung des Ist-Zustands
sind die Entwicklungen verschiedener
Szenarien möglich, die verschiedene
Richtungen der zukünftigen
Produktion aufzeigen können. Die
Auftragung der Funktionswerte über
die einzelnen Prozessschritte der
Produktionslinie stellt die Grundlage
zur Identifizierung von Schwachstellen
bzw. Optimierungspotenzialen
im Produktionsprozess dar (Abb. 5).
Abb. 5: Auffinden von Optimierungspotenzialen im Produktionsprozess.
In den Prozessschritten Einwaage,
Pasteurisierung und Fermentation
sind relativ starke Steigungen (S1, S2
und S3), insbesondere im Abwasserbereich,
erkennbar. Diese sind zum
einen auf den Wasserverbrauch zurückzuführen
und zum anderen auf
den damit verbundenen Einsatz von
Reinigungsmitteln. Bei erfolgreicher
Nutzung eines DNA-Arrays könnte die
Anzahl der Fermentationen zwischen
den Sicherheitsreinigungen erhöht
werden, da die Detektion einer Fehlfermentation
sofort erfolgt. Die Produktion
wird erst nach der Eliminierung
des Kontaminationsherds fortgesetzt
und es lassen sich somit weitere
Fehlchargen vermeiden. Der Wasserund
Chemikalienverbrauch wird
ebenfalls gesenkt und ist in der Summe
kontrollierbarer einsetzbar. Die
Identifizierung der Optimierungspotenziale
in der Produktionslinie führte
in Rücksprache mit dem Betrieb zu
Überlegungen, ob die vorhandenen
Reinigungsmittel eingespart oder substituiert
werden können, was zu einer
Verbesserung der umweltrelevanten
Auswirkungen beitragen würde.
Am Beispiel dieses Projekts zeigen
sich Synergien im Bereich des produktionsintegrierten
Einsatzes, der
Qualitätskontrolle und der Ressourcenminimierung
zu den anderen Projekten:
So wäre die Integration eines
DNA-Arrays zur Qualitätskontrolle in
der Milchverarbeitung auch auf die
drei anderen, vom IUV bewerteten
Projekte übertragbar. Durch ihren
Einsatz ließen sich Fehlchargen vermeiden
und somit Ressourcenverbräuche
minimieren.
Zusammenfassung und
Ausblick
Im Rahmen des DBU-Verbundprojekts
BIOL werden die neuentwickelten
innovativen biotechnologischen
Prozesse für die Lebensmittelindustrie,
inklusive der daraus resultierenden
Produktionsprozesse, mit Hilfe
des am IUV entwickelten Methodenkonzepts
der umweltrelevanten
Bewertung im Hinblick auf Nachhaltigkeit
und Ressourcenverbrauch untersucht.
Am Beispiel der milchverarbeitenden
Industrie sind die Möglichkeiten
des Methodenkonzepts
aufgezeigt worden. Nach dem Aufzeigen
vorhandener Optimierungspotenziale
der einzelnen Produktionslinien
oder Produktionsprozesse
durch die Erhebung der Sachbilanzdaten
und der sich anschließenden
Funktionsanalysen können gegenwärtige
und zukünftige Umweltauswirkungen
mit Hilfe der Umweltbilanzierung
wesentlich besser abgeschätzt
werden. Die hierfür eingesetzten Wirkungsanalysen
in Kombination mit
Optimierungsuntersuchungen haben
die Modellierung von Szenarien, bei
der unterschiedliche Variationen der
jeweiligen Prozessführungen betrachtet
werden, ermöglicht und eine
Aussage über die möglichen umweltrelevanten
Potenziale bewirkt.
Des Weiteren ist angedacht, den
Betrieben das Methodenkonzept als
Entscheidungshilfe für eine nachhaltige
Betriebsführung bereitzustellen
und aufbauend auf den Erfahrungen
des IUV im Bereich der Umweltbilanzierung
bei Neuentwicklungen von
Produkten oder bei Optimierungen
von Produktions- und Prozesslinien
unterstützend mitzuwirken.
Literatur
[1] Umweltbundesamt: Materialien zu
Ökobilanzen und Lebensweganalysen,
Texte 26/97, Erich-Schmidt-Verlag,
Berlin (1997).
[2] Gebler, W.: Ökobilanzen in der Abfallwirtschaft
– Stuttgarter Berichte zur
Abfallwirtschaft, Bericht 41 (1992).
[3] Haase, C.: Umweltrelevante und ökonomische
Bewertung von Produktionslinien,
Dissertation Universität
Bremen, Shaker Verlag (2002).
Korrespondenzadresse
Prof. Dr.-Ing. Norbert Räbiger
Institut für Umweltverfahrenstechnik
Universität Bremen
Postfach 330 440
28 334 Bremen
Tel.: 0421-218 41 96
Fax: 0421-218 49 47
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