HerzSupplement - Pentalong von Actavis

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Herz Supplement Cardiovascular Diseases Eine Empfindlichkeitssteigerung sollte durch massenspektrometrische Detektion möglich werden, d.h. an das chromatographische Trennmodul wird ein Massenspektrometer angeschlossen, das die aus der chromatografischen Säule kommenden Moleküle selektiv und sensitiv erfasst. Aufgrund der bekannten Thermolabilität organischer Nitrate unter GCMSBedingungen wandte sich unsere Arbeitsgruppe der schonenderen HPLCMSAnalytik zu. 2. HPLC-UV als Ausgangspunkt für die Entwicklung einer HPLC-MS-Analytik Zur Vorbereitung auf die HPLCMSMethode wurde zunächst die flüssigchromatografisches Trennung mit UVDetektion bei 215 nm entwickelt [1, 2]. Verschiedene ReversedPhaseTrennsäulen wurden in Kombination mit Fließmitteln unterschiedlicher Zusammensetzung, basierend auf WasserMethanol und WasserAceto Organische Nitrate Organisches Nitrat Molare Masse [g/mol] Molare Masse des Formiat-Adduktes [g/mol] PETN PEtriN PEdiN PEmonoN 316,14 271,14 226,14 181,14 Tab. 1: Übersicht der molaren Massen von PETN und seinen Metaboliten sowie der molaren Massen entsprechender Formiat-Addukte. Die Differenz aus molarer Masse des organischen Nitrates und des aus ihm gebildeten Formiat-Adduktes ergibt in jedem Fall die molare Masse des Formiates (45,03 g/mol). Organisches Nitrat PETN PEtriN PEdiN PEmonoN Zeit des Scannens [msec] 250 250 250 250 DP [Volt] Tab. 2: Darstellung experimentell ermittelter MS-Potenziale, die die maximale Signalintensität der Nitrat-Formiat-Addukte in den Massenspektren liefern. Die Abkürzungen der Potenziale stehen hierbei für: DP = Entclusterungspotenzial, FP = fokussierendes Potenzial, EP = Eingangspotenzial. Die Optimierung der Ionenspray-Spannung ergab für jedes organische Nitrat einen Wert von –4000 V. Um die thermische Belastung der Nitrate so gering wie möglich zu halten, wurde mit einer für die Vernebelung minimal möglichen MS-Temperatur von 300 °C gearbeitet. –8 –40 –20 –40 361,17 316,17 271,17 226,17 FP [Volt] –90 –50 –100 –50 EP [Volt] nitrilGemischen, im isokratischen Modus getestet. Die beste Auftrennung von PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten wurde durch eine C18Trennsäule (Phenomenex ® Gemini 5u C18 110A, 250 x 4,60 mm) sowie das Fließmittelgemisch Acetonitril : Wasser im Verhältnis 60 : 40 (V/V) erzielt. Ein weiterer wichtiger Anhaltspunkt konnte der Publikation von Zhao und Yinon entnommen werden, die die Bildung von Addukten kurzkettiger organischer Säuren mit den untersuchten Nitraten beschreibt [3]. Tatsächlich erzeugten die Formiate, Acetate und Propionate der Nitrate die entsprechenden Molpeaks, welche bei den reinen Nitraten in der Regel wegen ihrer Instabilität fehlen. Dementsprechend wurde den beiden FließmittelKomponenten, aus denen der eigentliche Eluent binär gemischt wurde, ein AmeisensäureAmmoniumformiatPuffer zugesetzt, um die –2 –4 –4 –3 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Bildung von FormiatAddukten zu gewährleisten. Die wässrige FließmittelKomponente A beinhaltete Konzentrationen an Ameisensäure und Ammoniumformiat von je 10 mM, während FließmittelKomponente B ein Gemisch an Acetonitril und Wasser im Verhältnis 80:20 (V/V) darstellt und 2 mM Ameisensäure sowie 5 mM Ammoniumformiat enthielt. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die molaren Massen der untersuchten organischen Nitrate sowie ihrer zugehörigen FormiatAddukte, deren Bildung unter den angegebenen Bedingungen erwartet wurde. Die Differenz der molaren Massen von organischem Nitrat und korrelierendem FormiatAddukt entspricht in jedem Fall der molaren Masse des Formiat Anions (45,03 g/mol). Um die Bildung der postulierten FormiatAddukte zu untersuchen, wurde an dem SingleQuadrupolMassenspektrometer API 165TM für jedes organische Nitrat unter Verwendung der beschriebenen AmeisensäureAmmoniumformiatPuffer das Massenspektrum im negativen Ionenmodus aufgenommen. Alle Massenspektren zeigten beständig bei der Massenzahl des entsprechenden NitratFormiatAdduktes sogar einen Basispeak (stärkster Peak im Spektrum), was die Bildung sehr stabiler FormiatAddukte belegt. Um die Intensität des jeweiligen AdduktPeaks weiter zu erhöhen, wurden für jedes der organischen Nitrate optimale Werte für Eingangs und Entclusterungspotenzial sowie für das fokussierende Potenzial gesucht und gefunden. In Tabelle 2 sind diese drei optimierten Potenziale für jedes der organischen Nitrate wiedergegeben. 3. Entwicklung und Optimierung der HPLC-MS-Methode Die optimierten MSPotenziale wurden ebenso wie die zu erwartenden molaren Massen der NitratFormiatAddukte in die Messmethodik der MSKomponente übernommen. Unter den optimierten Bedingungen wurde für jede fixierte Massenzahl (Massenchromatogramm) das HPLCMS Chromatogramm aufgezeichnet. Abbildung 1 zeigt das HPLCMSChromatogramm mit der entsprechenden Massenzahl des PETN FormiatAdduktes von 361,17 g/mol. PETN hatte die längste Verweildauer auf der RPSäule mit einer Retentionszeit von 27,70 min (Abb. 1). Seine nitratärmeren Metabo Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel Intensität Intensität 2e+6 2e+6 1e+6 8e+5 4e+5 0 3e+6 3e+6 2e+6 2e+6 1e+6 5e+5 0 PETN m/z 361,17 amu Rt 27,70 min Organische Nitrate 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zeit [min] Abb. 1: HPLC-MS-Chromatogramm der Massenzahl 361,17 amu. Durch Aufnahme von Massenspektren kann die Massenzahl eindeutig auf eine Addukt-Bildung von PETN und Formiatanion zurückgeführt werden. Wie dem Chromatogramm zu entnehmen ist, eluiert das PETN-Formiat-Addukt bei 27,70 min (Konzentration der PETN-Standardlösung: 10 -4 M). Intensität Intensität 2e+6 2e+6 1e+6 8e+5 4e+5 0 1e+5 8e+4 6e+4 4e+4 2e+4 0 PEtriN m/z 316,17 amu Rt 25,47 min 0 5 10 15 20 Zeit [min] 25 30 35 40 PEdiN m/z 271,17 amu Rt 16,72 min 0 5 10 15 20 Zeit [min] 25 30 35 40 PEmonoN m/z 226,17 amu Rt 5,15 min 0 5 10 15 20 Zeit [min] 25 30 35 40 Abb. 2: HPLC-MS-Chromatogramme der Massenzahlen der Formiat-Addukte von PEtriN, PEdiN und PEmonoN. Die Chromatogramme bestätigen das in den HPLC- UV-Messungen beobachtete Retentionsverhalten der PETN-Metaboliten (Konzentration der Standardlösungen: je 10 -4 M).
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die nach Literaturangaben (siehe [1
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Unterschiede in den freigesetzten N
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