HerzSupplement - Pentalong von Actavis

Entwicklung einer LC-MS-Methode zur
Quantifizierung von PETN und seinen vasodilatatorisch
wirksamen Metaboliten
Juliane Brettschneider 1 , Katrin Erler 2 , Bernd Luckas 2 , Jochen Lehmann 1 , Andreas Seeling 1
Zusammenfassung: Pentaerythritoltetranitrat
(PETN) ist ein hochpotentes organisches
Nitrat mit vasodilatatorischer Wirkung
an der glatten Gefäßmuskulatur und
wird in der Therapie der Herzinsuffizienz
bzw. der Anfallskupierung bei Angina pectoris
eingesetzt. Die Bioaktivierung durch
die mitochondriale Aldehyddehydrogenase
(ALDH­2) und auch andere Abbauwege
führen zu nitratärmeren Polyolen, die Anteil
an der vasodilatatorischen Wirkung der
Muttersubstanz haben. Die schrittweise
Metabolisierung des PETN führt zu Pentaerythritoltrinitrat
(PEtriN), Pentaerythritoldinitrat
(PEdiN) und Pentaerythritolmononitrat
(PEmonoN). Um eine Möglichkeit
zu schaffen, die Compliance im Rahmen
pharmakologischer Studien zu belegen
und auch die bei der Inkubation des PETN
mit Enzymen ablaufende Reaktionskinetik
beurteilen zu können, muss eine sehr empfindliche
Analytik, wie es sie bisher nicht
gab, verfügbar sein. Unsere Arbeitsgruppe
entwickelte nun eine RP­HPLC­ESI­MS­
Methode unter Verwendung einer C18­
Trennsäule auf der Basis des Wissens, das
1. Geschichte der Analytik von PETN und
PETN-Metaboliten
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurden
erste Bemühungen unternommen, in ihrer
Zusammensetzung unbekannte Nitro­Explosivstoffgemische
bezüglich ihrer Inhaltsstoffe
zu charakterisieren. Zunächst bediente
man sich einfacher analytischer Methoden
wie der Papierchromatografie, dann
der Dünnschichtchromatografie unter Verwendung
nitratspezifischer Sprühreagenzien,
wodurch bei ausreichenden Substanzmengen
schon semiquantitative Aussagen
möglich wurden.
Durch Nutzung der durch die DC­
Sprühreagenzien entwickelten Farbreaktionen
wurden dann colorimetrische Assays
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
in vorangegangenen HPLC­UV­Messungen
gewonnen worden war [1, 2]. Problematisch
sind hier die sehr geringen Konzentrationen
von PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten
in biologischen Proben. Um auch
diese erfassen zu können, wurde die Bildung
von stabilen Formiat­Addukten [3]
zur Erhöhung der Empfindlichkeit genutzt,
was zu LOD­(limit of detection­)Werten
von maximal 10 ­8 M für PETN, PEtriN und
PEdiN führte. Für diese Nitrate konnte dadurch
über den gesamten Arbeitsbereich
von 10 ­5 bis 10 ­8 M ein linearer Zusammenhang
zwischen Nitratkonzentration und
Signalintensität im HPLC­MS­Chromatogramm
belegt werden. Lediglich die Empfindlichkeit
der PEmonoN­Bestimmung
reichte mit einer LOQ von 5 x 10 ­5 M nicht
für eine Quantifizierung in biologischen
Proben aus, was möglicherweise an der zu
geringen Stabilität des PEmonoN­Formiat­
Adduktes liegt.
Schlüsselwörter: Organische Nitrate – Quantifizierung
– Formiat­Addukt – LC­MS
entwickelt. Doch diese zeigten, ebenso wie
densitometrische und photometrische Methoden
zur Gehaltsbestimmung organischer
Nitrate, zu geringe Empfindlichkeiten
und Selektivitäten, vor allem als in
den 1960­er Jahren im Rahmen der kardiovaskulären
Therapie vermehrt pharmakokinetische
Fragestellungen aufkamen
und die Quantifizierung von organischen
Nitraten sowie deren Metaboliten beabsichtigt
war. Auch alle nachfolgenden
Analysemethoden bis hin zur Flüssigchromatografie
(HPLC) mit UV­Detektion
oder Gaschromatografie erreichten nie die
für eine Gehaltsbestimmung von Nitraten
in biologischen Proben erforderliche Sensitivität.
Organische Nitrate
1 Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie,
Pharmazeutisches Institut
der Friedrich-Schiller-Universität
Jena, Deutschland
2 Lehrstuhl für Lebensmittelchemie,
Institut für Ernährungswissenschaften
der
Friedrich-Schiller-Universität
Jena, Deutschland