HerzSupplement - Pentalong von Actavis

a
123-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
50
40
30
20
10
0
0
ISDN GTN PETN
Beno Ch
PA
tisch mit dem für nach fünfminütiger Inkubation
war (Abb. 1b). Aus diesen Ergebnissen
kann gefolgert werden, dass erstens
ein Rh123­Efflux aus EA.hy.926­Zellen
stattfindet und zweitens, dass dieser Prozess
durch Cyclosporin A gehemmt werden
kann. Aus Letzterem ergibt sich, dass wenn
Dihydrorhodamin 123 als Indikator für reaktive
Sauerstoffspezies verwendet wird,
bedacht werden muss, dass eine Veränderung
der intrazellulären Fluoreszenz nicht
nur auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
zurückzuführen sein muss, sondern
auch durch weitere Prozesse wie einen
Auswärtstransport oder einen veränderten
funktionellen Zustand von Mitochondrien
begründet werden kann.
Um die gezeigten Ergebnisse zu verifizieren
und zu gewährleisten, dass die gesamte
durch Oxidation entstandene Rhodaminkonzentration
erfasst wird, d. h. auch
die aus den Zellen heraustransportierte,
war es notwendig, eine Methode zu etablieren,
die es ermöglicht, Rhodamin zusätzlich
im Inkubationsüberstand zu quantifizieren,
was im Fall der Fluoreszenzaufnahmen
nicht möglich war. Rh123 wurde dazu
mittels einer organischen Phase sowohl aus
Zelllysat als auch aus dem Inkubationsmedium
extrahiert und die Fluoreszenz nach
chromatografischer Trennung ermittelt.
Die Abbildungen 3a und 3b zeigen, dass
Cyclosporin A die Rh123­Fluoreszenz verändert.
Nach 60­minütiger Inkubation der
Zellen mit 500 µmol/l GTN wurde die intrazelluläre
Rh123­Fluoreszenz gesteigert
(Abb. 3a), wobei, wie Abbildung 3b zeigt,
die extrazelluläre Konzentration anstieg
und zwar stärker als intrazellulär. In Gegenwart
von Cyclosporin A war der intrazelluläre
Anstieg der Rh123­Bildung signi­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
B
123-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
100
80
60
40
20
*
fikant gegenüber dem ungehemmten Efflux
gesteigert. Dementsprechend wurde
extrazellulär weniger Rh123 gegenüber ungehemmtem
Efflux detektiert. Die Tatsache,
dass nach der Inkubation der Zellen
mit GTN und Cyclosporin extrazellulär eine
höhere Konzentration als unter Kontrollbedingungen
gefunden wurde, muss
nicht bedeuten, dass der Efflux nicht vollständig
inhibiert war, sondern lässt sich
dadurch erklären, dass verschiedene Prozesse
an der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
durch GTN beteiligt sind und diese
von membranständigen Proteinen auch
nach extrazellulär abgegeben werden können
[21–23]. Durch solche Prozesse veränderte
extrazelluläre Rh123­Konzentrationen
können im Fall der Fluoreszenzaufnahmen
nicht detektiert werden [13, 14].
Zum Vergleich der Wirkung verschiedener
organischer Nitrate wurden EA.
hy.926 30 min mit 10 µmol/l ISDN, GTN
bzw. PETN inkubiert. ISDN und GTN
führten sowohl extra­ als auch intrazellulär
zu einer verstärkten Bildung von Rh123
(Abb. 4), wobei signifikante Ergebnisse
nur für die Extraktionen aus dem Überstand
erhalten wurden. Im Gegensatz dazu
war durch PETN keine signifikante Induktion
der Rh123­Bildung nachweisbar.
Die für GTN gezeigte initiale Zunahme
der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
legt den Schluss nahe, dass ein direkter Zusammenhang
mit der Metabolisierung besteht
(Abb. 1). Daher wurde die oxidative
Wirkung der organischen Nitrate im Folgenden
ebenfalls mit isolierten Mitochondrien
untersucht, deren Beteiligung an der
gesteigerten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
in mehreren Arbeiten gezeigt werden
konnte [8, 11, 24].
*
*
Organische Nitrate
Abb. 5: Nachweis der Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies
in Mitochondrien. Dargestellt
sind der Anstieg der
Oxidation von DHR zu Rh123
in Rattenlebermitochondrien
nach 30 min Inkubation mit
10 μmol/l des jeweiligen
organischen Nitrates (A)
sowie die Rhodaminbildung
nach Inkubation mit 10
μmol/l Benomyl, 1 mmol/l
Chloralhydrat bzw. 5 mmol/l
Propionaldehyd (B) (*: signifikant
gegenüber unstimulierten
Zellen).
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