HerzSupplement - Pentalong von Actavis
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Klinisch <strong>von</strong> Bedeutung sind vor allem eine<br />
sich rasch entwickelnde Tachyphylaxie, die<br />
die Anwendung der organischen Nitrate in<br />
der Dauertherapie limitiert und in Verbindung<br />
damit die Verschiebung des Redoxgleichgewichts,<br />
d.h. die Bildung reaktiver<br />
Sauerstoffspezies. Erste Hinweise auf einen<br />
Zusammenhang zwischen der Bildung reaktiver<br />
Sauerstoffspezies und der Toleranzentstehung<br />
wurden 1995 <strong>von</strong> Münzel<br />
und Kollegen veröffentlicht [1]. Heute gibt<br />
es zahlreiche Publikationen, die das Modell<br />
des oxidativen Stresses in Bezug auf die Toleranzentstehung<br />
stützen [2, 3].<br />
In den vergangenen Jahrzehnten wurden<br />
verschiedene – nicht enzymatische und<br />
enzymatische – Wege zur Bioaktivierung<br />
der organischen Nitrate diskutiert, aber<br />
nachdem 2002 Chen et al. die mitochondriale<br />
Aldehyddehydrogenase (ALDH2)<br />
als Glyceroltrinitrat (GTN) metabolisierendes<br />
Enzym identifizierten, gibt es mehrere<br />
Publikationen, die einen klaren Zusammenhang<br />
zwischen dem Metabolismus<br />
der organischen Nitrate und diesem Enzym<br />
aufzeigen [4]. Die ALDH2 weist im katalytischen<br />
Zentrum Cysteinreste auf, die in<br />
vitro nach Exposition isolierter Mitochondrien<br />
mit verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies<br />
(ROS) oxidiert werden konnten,<br />
was in einer Inaktivierung der ALDH2<br />
resultierte [5]. Basierend auf diesen Erkenntnissen<br />
findet sich ein Erklärungsansatz<br />
für die Entstehung der mechanismusbasierten<br />
Toleranz, sodass wir GTN als<br />
Leitsubstanz der organischen Nitrate im<br />
Vergleich zu Pentaerithrityltetranitrat<br />
(PETN) sowie Isosorbitdinitrat (ISDN) bezüglich<br />
ihrer Wirkung auf die Bildung reaktiver<br />
Sauerstoffspezies nach Inkubation<br />
<strong>von</strong> u.a. humanen Endothelzellen sowie<br />
isolierten Mitochondrien getestet haben.<br />
Als Indikator für den Nachweis reaktiver<br />
Sauerstoffspezies wurde dazu Dihydrorhodamin<br />
123 (DHR123) verwendet,<br />
das im ungeladenen Zustand über die Zellmembran<br />
diffundiert und in der Zelle mit<br />
reaktiven Sauerstoffspezies zum fluoreszierenden<br />
Rhodamin 123 (Rh123) abreagiert<br />
[6]. Die positive Ladung sowie die<br />
Akkumulation <strong>von</strong> Rhodamin in Mitochondrien<br />
[7] lassen erwarten, dass Rh123<br />
intrazellulär verbleibt. Der Literatur zufolge<br />
bleibt das Signal eine Stunde stabil. Eine<br />
Abnahme der Fluoreszenz, die auf diffusionskontrollierte<br />
Prozesse zurückzuführen<br />
ist, sollte in einem zeitlichen Rahmen<br />
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel<br />
ablaufen, der größer ist als die <strong>von</strong> uns gewählten<br />
Inkubationszeiten [6].<br />
Ergebnisse und Diskussion<br />
Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies<br />
nach GTNInkubation wurde bereits in verschiedenen<br />
Geweben nachgewiesen [8–11].<br />
Daher haben wir zunächst untersucht, ob<br />
dieser Effekt auch auf die humane Endothelzelllinie<br />
EA.hy.926 übertragbar ist. Diese<br />
Zellen wurden gewählt, da das Endothel<br />
eine bedeutende Rolle bei der pathophysiologischen<br />
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies<br />
spielt [1, 12].<br />
Die Quantifizierung der intrazellulären<br />
Fluoreszenz erfolgte dabei zunächst an<br />
Hand <strong>von</strong> Fluoreszenzfärbungen und Mikroskopiebildern<br />
[13, 14]. Abbildung 1A<br />
zeigt, dass nach GTNInkubation der<br />
EA.hy.926Zellen die erwartete Zunahme<br />
der detektierten Fluoreszenz im Vergleich<br />
zu unbehandelten Zellen beobachtet wer<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
–20<br />
–40<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
50 µM<br />
5 10<br />
Zeit [Minuten]<br />
Organische Nitrate<br />
Abb. 1: Determination reaktiver Sauerstoffspezies mittels Fluoreszenzmikroskopie.<br />
Dargestellt ist die relative Änderung der 123-Rhodaminfluoreszenz in EA.<br />
hy.926 Zellen in Abhängigkeit <strong>von</strong> der Inkubationsdauer nach Stimulation mit 50<br />
und 500 μmol/l GTN (A) sowie nach 60 min Inkubation mit 2 μmol/l Cyclosporin A<br />
bzw. 500 μmol/l GTN allein oder zusammen (B). Dargestellt sind die Δ%-Werte<br />
bezogen auf unstimulierte Zellen (*: signifikant gegenüber unstimulierten Zellen).<br />
a<br />
B<br />
132-Rhodaminfluoreszenz<br />
∆% zu unstimulierten Zellen<br />
132-Rhodaminfluoreszenz<br />
∆% zu unstimulierten Zellen<br />
*<br />
*<br />
Cyclo A<br />
*<br />
500 µM<br />
20 5 10 20<br />
*<br />
GTN<br />
*<br />
*<br />
* #<br />
*<br />
Cyclo A + GTN<br />
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