HerzSupplement - Pentalong von Actavis

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NachWenzel et al [42]. Herz Supplement Cardiovascular Diseases Reduktase NADPH Oxidierte Liponsäure S R R Reduzierte Liponsäure S ROS wirkt [44]: Wenn die Umwandlung von Acetaldehyd anhand der NADHBildung gemessen und GTN zugesetzt wird, so kommt die Dehydrogenaseaktivität zum Erliegen (Abb. 6a). Nach Zugabe des DithiolReagenz (DTT) kommt es zu einer Reaktivierung (rescue), die allerdings weit hinter der Aktivität vor der GTNGabe zurückbleibt. Das heißt, dass es eine irreversible Inaktivierung geben muss. Wir konnten bereits 2007 zeigen, dass die GTN In vivoBehandlung zu einer teils irreversiblen Inaktivierung der ALDH2 in Mitochondrien führt, die nur bedingt durch die Zugabe von reduzierter Liponsäure wiederhergestellt werden konnte (Abb. 6b). Auch AntimycinAinduzierter oxidativer Stress bewirkte eine teils irreversible Inaktivierung der ALDH2 in isolierten Mito R Gemischtes Disulfid S H S S ALDH-2 ALDH-2 chondrien, die durch reduzierte Liponsäure nicht zurückgeführt werden konnte (Abb. 6c). Das Konzept des durch Liponsäure vermittelten Schutzes konnten wir auch in einer Humanstudie verifizieren [30]. Basierend auf diesen Befunden postulierten wir die Redoxregulation der ALDH2 durch GTN und reaktive Sauerstoff und Stickstoffspezies (RONS) sowie eine irreversible Inhibition durch Bildung einer Sulfonsäuregruppe durch oxidierende Spezies (Abb. 7). Aktuellen Befunden zufolge bildet das isolierte Enzym selbst freie Radikale, die besonders gehäuft entstehen, wenn GTN anwesend ist [45]. Für diese Radikalproduktion spielt eine Konformationsänderung durch die Bindung von NAD + eine wesentliche Rolle, da durch eine Änderung der Bindungsaffinität von NAD + mittels Muta Intermediäres Thionitrat Weitere Bioaktivierung Relaxation 30 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel ROS S S ALDH-2 SO3H ALDH-2 GTN O–NO2 O–NO2 NAD + ALDH-2 NO2 NOx cGMP cGK-I O–NO2 O–NO2 O–H 1,2 GDN Abb. 7: Nach unseren und anderen Daten postulieren wir die folgende Sequenz von Ereignissen für den Metabolismus organischer Nitrate durch die ALDH�2: Zwei benachbarte Cystein�Thiol�Gruppen sind essenziell für die Nitratbioaktivierung. In einem ersten Schritt wird eine dieser Thiolgruppen den Stickstoff des sterisch am besten zugänglichen (und am stärksten aktivierten) Salpetersäureesters nukleophil angreifen und dabei ein Thionitrat�Intermediat bilden sowie den denitrierten Metaboliten (1,2�GDN). Durch Angriff des zweiten Thiols an diesem Thionitrat wird eine Disulfidbrücke und Nitrit als die Abgangsgruppe gebildet. Das Disulfid kann auch durch direkte Oxidation der Thiole durch reaktive Sauerstoff� oder Stickstoffspezies entstehen. Dabei könnten sogar höhere Oxidationen zur Sulfonsäure (–SO3H) auftreten und eine irreversible Hemmung der ALDH�2 bewirken. Die Wiederherstellung der enzymatischen Aktivi� tät involviert die Dithiol�Verbindung Dihydroliponsäure, die in Mitochondrien vorkommt und initial ein gemischtes Disulfid bildet. Nach intramolekularem nukleophilem Angriff dissoziiert dieses gemischte Disulfid zu oxidierter Liponsäure und reaktivierter (redu� zierter) ALDH�2. Die oxidierte Liponsäure wird durch spezielle Lipoamidreduktasen in Mitochondrien bzw. Glutathionreduktasen im Zytosol reduziert. Auch dieser letzte Schritt kann Angriffspunkt für eine oxidative Schädigung in der Nitrattoleranz sein. Das anorga� nische Nitrit, das während des katalytischen Zyklus gebildet wurde, benötigt eine weitere Bioaktivierung, um eine vasodilatierende Spezies hervorzubringen. Eventuell findet am isolierten Enzym auch direkt eine NO�Freisetzung statt.
Nach Daiber et al. In Vorbereitung Relative ALDH-2-Aktivität 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0 0 0,033 0,1 0,33 1 10 100 Organische Nitrate [µM] tion einer Glutaminsäure in der NAD + Bindungstasche (E268Q) deutlich weniger Radikale gebildet werden, ohne dass die NitratreduktaseAktivität merklich verändert wird [45]. So konnte im Wildtypenzym erst eine NOProduktion in Anwesenheit von GTN gemessen werden, wenn Superoxiddismutase (SOD) zugegeben wurde (ein Anzeichen für Abbau des NO durch Superoxid). Dagegen zeigte die E268Q Mutante bereits ohne SOD eine messbare NOProduktion, die durch SODZugabe weiter gesteigert wurde. Die Dehydrogenase und Esteraseaktivität der ALDH2 sind in der E268QMutante nahezu abwesend, wohingegen die basale Nitratreduktase Aktivität kaum verändert wird. Lediglich die etwa siebenfache Steigerung durch NAD + im Wildtypenzym entfällt in der E268QMutante aufgrund der geänderten NAD + Affinität [45]. Die Ersetzung einer Cysteingruppe im aktiven Zentrum durch eine Seringruppe (C302S) führte dagegen zum Verlust von allen drei enzymatischen Aktivitäten und einem Verlust der 1,2GDN und NOBildung aus GTN [45]. Die weitverbreitete ostasiatische Variante der ALDH2 (ALDH2*2) mit der Punktmutation E487K zeigt eine ähnliche Änderung der NAD + Bindungsaffinität wie die E268QMutante [46]. Daneben zeigt die Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel GTN PETN Abb. 8: Bestimmung der ALDH�2�Dehydrogenase�Aktivität mittels HPLC�basierter Messung der Umwandlung von 2�Hydroxy�3�Nitro� benzaldehyd zum Benzoesäureprodukt. Die Inaktivierung durch stei� gende GTN�Konzentrationen ist deutlich effektiver als die durch PETN. RONS-Bildung mittels L-012 ECL [RLU] 2,5 × 10 5 2,0 × 10 5 1,5 × 10 5 1,0 × 10 5 0,5 × 10 5 0 × 10 5 GTN PETN ALDH2*2Variante eine deutlich verringerte Dehydrogenase und Esteraseaktivität [46] sowie eine abgeschwächte GTNBioaktivierung [47]. Damit geht eine geringere vasodilatatorische Potenz des GTN in asiatischen Probanden mit dieser ALDH2Modifikation bzw. gesunden Freiwilligen nach Behandlung mit dem ALDHInhibitor Disulfiram einher [48]. In einer gerade publizierten Arbeit konnte gezeigt werden, dass die isolierte, gereinigte ALDH2*2Variante eine deutlich geringere Dehydrogenase, Esterase sowie Nitratreduktaseaktivität im Vergleich zum Wildtypenzym (ALDH2*1) aufweist [49]. Dementsprechend führte die ALDH2*2 Variante auch mit GTN zu einer deutlich abgeschwächten 1,2GDN Bildung, NO Freisetzung und sGCAktivierung. Interessanterweise bewirkte der kürzlich beschriebene ALDHAktivator Alda1 [50] nur eine marginale Steigerung der DehydrogenaseAktivität im Wildtypenzym, wohingegen die DehydrogenaseAktivität in der ALDH2*2Variante um einen Faktor 4 gesteigert wurde [49]. Der Effekt von Alda1 auf die Esteraseaktivität war im ALDH2*1Enzym moderat, aber die EsteraseAktivität der ALDH2*2Variante wurde achtfach erhöht. Alda1 hatte lei Organische Nitrate 0 0,01 0,1 1 10 Organische Nitrate [µM] Abb. 9: Die RONS�Produktion aus isolierter ALDH�2 und GTN bzw. PETN wurde anhand der L�012�Chemilumineszenz gemessen. Die RONS�Bildung mit PETN ist deutlich geringer als mit GTN. 31 Nach Daiber et al. In Vorbereitung
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