HerzSupplement - Pentalong von Actavis

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Herz Supplement Cardiovascular Diseases Tab. 3: Übersicht über die prozentualen Gehalte des Fließmittels an Komponente A bzw. B in Abhängigkeit des zeitlichen Verlaufs einer chromatografischen Messung (Zusammensetzung Komponente A: 100 % Wasser, 10 mM Ameisensäure, 10 mM Ammoniumformiat; Zusammensetzung Komponente B: Acetonitril : Wasser 80:20 (V/V), 2 mM Ameisensäure, 5 mM Ammoniumformiat). 10 Anteil der Komponenten [%] Zeit [min] 5 8 18 20 29 30 40 Flussrate [µl/min] 200 200 200 200 200 200 200 Zeit [min] Anteil A [%] 95 55 55 0 0 95 95 Anteil B [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Komponente A 10 0 Komponente B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Abb. 3: Grafische Darstellung der veränderten Zumischung der Fließmittel-Komponenten A und B während eines chromatografischen Laufes. Im Vergleich verschiedener Methoden mit binärem Gradienten zeichnete sich die ausgewählte durch eine gute Trennung der Analyten und eine frühe Retention des zuletzt eluierenden PETN aus. Die Methode wurde im Folgenden für die Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung von PETN und seinen Metaboliten verwendet. liten sollten aufgrund höherer Hydrophilie zu früheren Zeiten eluieren, PEmonoN aufgrund seines geringsten Nitratgehaltes als Erstes, gefolgt von PEdiN und schließlich PEtriN. Diese Überlegung wurde im Experiment (HPLCMSChromatogramme, Abb. 2) bestätigt. Für alle Chromatogramme wurde ein optimierter binärer Gradient beider FließmittelKomponenten benutzt. Die im Vergleich verschiedener Methoden ermit 5 45 45 100 100 5 5 Organische Nitrate telte optimale Zufuhr der FließmittelKomponenten A und B ist tabellarisch (Tab. 3) wiedergegeben. Die entsprechende grafische Darstellung findet sich in Abbildung 3. Für die Wahl der Methode war entscheidend, dass die Trennung von PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten gut gelingt und für das zuletzt eluierende PETN eine vergleichsweise niedrige Retentionszeit möglich wird. Die ermittelten MSBedingungen, die Bildung von NitratFormiatAddukten sowie der gefundene Fließmittelgradient wurden im Folgenden bei der Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung von PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten zusammengeführt. Die Kalibrierung mithilfe von Standardlösungen im Konzentrationsbereich von 10 5 bis 10 8 M verdeutlichte den linearen Zusammenhang von Nitratkonzentration und Signalintensität im HPLCMSChromatogramm über den gesamten Arbeitsbereich. Ein Beispiel Chromatogramm der Kalibrierung ist in Abbildung 4 für ein Gemisch von PETN und PETNMetaboliten mit einer jeweiligen Konzentration von 10 6 M dargestellt. Während PETN, PEtriN und PEdiN in der vorliegenden Konzentration deutliche Signale zeigen, ist der PEmonoNPeak leider nur undeutlich erkennbar. Es könnte sein, dass nur eine Nitratgruppe für die Bildung eines FormiatAdduktes unzureichend ist oder zu einer geringeren Stabilität des Adduktes führt. Die ermittelten Werte für die jeweiligen Nachweis und Bestimmungsgrenzen sind in Tabelle 4 gegenübergestellt. Während die niedrigsten quantifizierbaren Konzentrationen für PETN, PEtriN und PEdiN bei maximal 5 x 10 8 M liegen, ist die LOQ von PEmonoN mit einem Wert von 5 x 10 5 M für eine Quantifizierung in biologischen Proben nicht brauchbar. Dessen ungeachtet konnte die entwickelte HPLCMS Quantifizierungsmethode bereits erfolgreich zur Bestimmung der Gehalte von PETN und PETNMetaboliten nach Extraktion aus Humanplasma und Vollblut sowie im Rahmen kinetischer Untersuchungen nach der Inkubation der Nitrate mit ALDH2 eingesetzt werden. Ebenso lassen die Nachweisgrenzen von PETN, PEtriN und PEdiN die Gehaltsbestimmung der Nitrate im Vollblut von Probanden nach oraler Gabe von PETN zu, was letztlich das Ziel unserer Bemühungen war. n Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Summary Pentaerythritol tetranitrate (PETN) is a high potency nitrovasodilator and is used in the treatment of cardiomyopathy and angina pectoris. Bioactivation via mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2) and other biodegradations go along with a stepwise loss of the 4 nitrate functions and result in pentaerythritol trinitrate (PEtriN), pentaerythritol dinitrate (PEdiN) and pentaerythritol mononitrate (PEmonoN). All of them contribute to the vasodilatory action. In order to confirm compliance in the field of pharmacological studies and also in order to monitor reactions of PETN with regard to enzyme kinetics, a highly sensitive analytical method, which has not been available so far has to be found. Based on previous investigations via HPLCUV [1, 2], we developed a RPHPLCESIMS (reversed phase high performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry) method using a C18 column, which showed to be sensitive enough to determine the concentrations of PETN and its denitrated metabolites in biological samples. The formation of stable formiate adducts [3] further increased sensitivity and lead to LOD (limit of detection) of 10 8 M in maximum for PETN, PEtriN and PEdiN. Linearity could be shown within the whole working range for concentrations from 10 5 till 10 8 M. But a comparable detection of PEmonoN could not be achieved by this protocol. Key Words: organic nitrate – quantification – formiate adduct – LCMS Danksagung Ein herzliches Dankeschön soll an dieser Stelle dem Kollegium des Lehrstuhls für Lebensmittelchemie, Institut für Ernährungswissenschaften der FriedrichSchiller Universität Jena ausgesprochen werden, welches das für die Messungen verwendete LCMSGerät zur Verfügung stellte und stets hilfsbereit bei der Beantwortung technischer Fragen war. Darüber hinaus ist zu danken Katrin Fischer sowie Monika Listing, Kolleginnen des Lehrstuhls für Pharmazeutische/Medizinische Chemie an dem Institut für Pharmazie der FriedrichSchillerUniversität Jena, für die Synthese der verwendeten Standards PEtriN, PEdiN und PEmonoN. Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel Organisches Nitrat PETN PEtriN PEdiN PEmonoN Retentionszeit [min] 27,70 25,47 16,72 5,15 Literatur 1. Cavazzutti C, Gagliardi L, Amato A, Gattavecchia E, Tonelli D. Separation and quantitation of polynitrate esters in pharmaceutical preparations by reversedphase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 1982;244:391–395 2. Seeling A, Lehmann J. NO-donors, part X [1]: Investigations on the stability of pentaerythrityl tetranitrate (PETN) by HPLC-chemoluminescence-N-detection (CLND) versus UV-detection in HPLC. J Pharm Biomed Anal 2006;40:1131–1136 3. Zhao X, Yinon J. Identification of nitrate ester explosives by liquid chromatography-electrospray ionization and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. J Chromatogr 2002; A 977:59–68 LOD [mol/l] 1x10 -8 7,5x10 -9 1x10 -8 1x10 -6 Organische Nitrate LOQ [mol/l] 5x10 -8 2x10 -8 5x10 -8 5x10 -5 Tab. 4: Übersicht der experimentell ermittelten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für PETN und seine Metaboliten. Der angegebenen LOD liegt ein Signal- Rausch-Verhältnis mit einem Mindestwert von 3 zugrunde, während die LOQ ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 10 erfordert (LOD = „limit of detection“, Nachweisgrenze; LOQ = „limit of quantification“, minimale quantifizierbare Konzentration des Analyten). Intensität 8000 6000 4000 2000 0 PEmonoN PEdiN 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zeit [min] PEtriN PETN Abb. 4: HPLC-MS-Chromatogramm eines Gemisches der Standardlösungen von PETN, PEtriN, PEdiN und PEmonoN. Während PETN, PEtriN und PEdiN deutliche Peaks hoher Intensität zeigen, ist das PEmonoN-Signal wesentlich schwächer ausgeprägt, was ggf. auf eine geringere Stabilität des Formiat-Adduktes zurückgeführt werden kann und die Empfindlichkeit im Rahmen der Quantifizierung deutlich mindert (Konzentration der Analyten: je 10 -6 M). Für die Verfasser: Jochen Lehmann Pharmazeutisches Institut der Friedrich-Schiller- Universität Jena Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische Chemie Philosophenweg 12 07747 Jena, Germany Tel.: +49 (0)3641 949825 Fax: +49 (0)3641 949802 E-Mail: juliane. brettschneider@uni-jena.de oder: j.lehmann@uni-jena.de 11
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die nach Literaturangaben (siehe [1
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Unterschiede in den freigesetzten N
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