HerzSupplement - Pentalong von Actavis

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Tab. 3: Übersicht über die prozentualen Gehalte des Fließmittels an Komponente A
bzw. B in Abhängigkeit des zeitlichen Verlaufs einer chromatografischen Messung
(Zusammensetzung Komponente A: 100 % Wasser, 10 mM Ameisensäure,
10 mM Ammoniumformiat; Zusammensetzung Komponente B: Acetonitril : Wasser
80:20 (V/V), 2 mM Ameisensäure, 5 mM Ammoniumformiat).
10
Anteil der Komponenten [%]
Zeit
[min]
5
8
18
20
29
30
40
Flussrate
[µl/min]
200
200
200
200
200
200
200
Zeit [min]
Anteil A
[%]
95
55
55
0
0
95
95
Anteil B
[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
Komponente A
10
0
Komponente B
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Abb. 3: Grafische Darstellung der veränderten Zumischung der Fließmittel-Komponenten
A und B während eines chromatografischen Laufes. Im Vergleich verschiedener
Methoden mit binärem Gradienten zeichnete sich die ausgewählte durch
eine gute Trennung der Analyten und eine frühe Retention des zuletzt eluierenden
PETN aus. Die Methode wurde im Folgenden für die Entwicklung einer Methode
zur Quantifizierung von PETN und seinen Metaboliten verwendet.
liten sollten aufgrund höherer Hydrophilie
zu früheren Zeiten eluieren, PEmonoN aufgrund
seines geringsten Nitratgehaltes als
Erstes, gefolgt von PEdiN und schließlich
PEtriN. Diese Überlegung wurde im Experiment
(HPLC­MS­Chromatogramme, Abb.
2) bestätigt. Für alle Chromatogramme wurde
ein optimierter binärer Gradient beider
Fließmittel­Komponenten benutzt. Die im
Vergleich verschiedener Methoden ermit­
5
45
45
100
100
5
5
Organische Nitrate
telte optimale Zufuhr der Fließmittel­Komponenten
A und B ist tabellarisch (Tab. 3)
wiedergegeben. Die entsprechende grafische
Darstellung findet sich in Abbildung
3. Für die Wahl der Methode war entscheidend,
dass die Trennung von PETN und seinen
nitratärmeren Metaboliten gut gelingt
und für das zuletzt eluierende PETN eine
vergleichsweise niedrige Retentionszeit
möglich wird.
Die ermittelten MS­Bedingungen, die
Bildung von Nitrat­Formiat­Addukten sowie
der gefundene Fließmittelgradient
wurden im Folgenden bei der Entwicklung
einer Methode zur Quantifizierung von
PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten
zusammengeführt. Die Kalibrierung
mithilfe von Standardlösungen im Konzentrationsbereich
von 10 ­5 bis 10 ­8 M verdeutlichte
den linearen Zusammenhang
von Nitratkonzentration und Signalintensität
im HPLC­MS­Chromatogramm über
den gesamten Arbeitsbereich. Ein Beispiel­
Chromatogramm der Kalibrierung ist in
Abbildung 4 für ein Gemisch von PETN
und PETN­Metaboliten mit einer jeweiligen
Konzentration von 10 ­6 M dargestellt.
Während PETN, PEtriN und PEdiN in
der vorliegenden Konzentration deutliche
Signale zeigen, ist der PEmonoN­Peak leider
nur undeutlich erkennbar. Es könnte
sein, dass nur eine Nitratgruppe für die Bildung
eines Formiat­Adduktes unzureichend
ist oder zu einer geringeren Stabilität
des Adduktes führt.
Die ermittelten Werte für die jeweiligen
Nachweis­ und Bestimmungsgrenzen sind
in Tabelle 4 gegenübergestellt. Während
die niedrigsten quantifizierbaren Konzentrationen
für PETN, PEtriN und PEdiN bei
maximal 5 x 10 ­8 M liegen, ist die LOQ von
PEmonoN mit einem Wert von 5 x 10 ­5 M
für eine Quantifizierung in biologischen
Proben nicht brauchbar. Dessen ungeachtet
konnte die entwickelte HPLC­MS­
Quantifizierungsmethode bereits erfolgreich
zur Bestimmung der Gehalte von
PETN und PETN­Metaboliten nach Extraktion
aus Humanplasma und Vollblut
sowie im Rahmen kinetischer Untersuchungen
nach der Inkubation der Nitrate
mit ALDH­2 eingesetzt werden. Ebenso
lassen die Nachweisgrenzen von PETN,
PEtriN und PEdiN die Gehaltsbestimmung
der Nitrate im Vollblut von Probanden
nach oraler Gabe von PETN zu, was letztlich
das Ziel unserer Bemühungen war. n
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel